العنوان الحالي: OX11 0DE، المملكة المتحدة، مبنى دايموند، حديقة هارويل للعلوم والابتكار، ديتكوت، أوكسفوردشاير، المملكة المتحدة، شركة دايموند لايت سورس المحدودة، مركز التصوير البيولوجي الإلكتروني.
يُعدّ مُركّب حصاد الضوء في مركز التفاعل 1 (RC-LH1) المكوّن الأساسي لعملية التمثيل الضوئي في البكتيريا الضوئية الأرجوانية. وقد قدّمنا بنيتين لمُركّب RC-LH1 من بكتيريا Rhodopseudomonas palustris، تمّ الحصول عليهما باستخدام المجهر الإلكتروني فائق البرودة. تتكوّن بنية مُركّب RC-LH114-W، بدقة 2.65 أنغستروم، من 14 حلقة فرعية من LH1 تُحيط بمركز التفاعل، ويقطعها البروتين W. أما المُركّب الخالي من البروتين W، فهو مُكوّن مركز التفاعل بالكامل، مُحاط بحلقة فرعية مُغلقة من LH1. تُتيح مُقارنة هاتين البنيتين فهمًا أعمق لديناميكيات الكينون في مُركّب RC-LH1، بما في ذلك التغييرات التركيبية غير المُحدّدة سابقًا عند ارتباط الكينون بموقع QB في مركز التفاعل، بالإضافة إلى تحديد مواقع ارتباط الكينون المُساعدة، والتي تُسهّل انتقاله إلى مركز التفاعل. يمنع التركيب الفريد لبروتين W إغلاق حلقة LH1، مما يؤدي إلى إنشاء قناة لتسريع تبادل الكينون/الكينولون.
تُعدّ الطاقة الناتجة عن عملية التمثيل الضوئي مصدرًا أساسيًا لاستمرار الحياة على الأرض، ولها إمكانات هائلة في مجال التكنولوجيا الحيوية الشمسية. وبينما تُعزز البكتيريا الضوئية الأرجوانية عملية التمثيل الضوئي على مستوى العالم، فإنها تُظهر أيضًا أنماطًا متنوعة من الطاقة وقدرات أيضية متعددة. فهي قادرة على تجنب عملية التمثيل الضوئي والنمو كبكتيريا غيرية التغذية في الظلام، كما تستطيع تثبيت النيتروجين وثاني أكسيد الكربون، وإنتاج الهيدروجين، وتحليل المركبات العطرية (1-3). ولتوفير الطاقة اللازمة لهذه العمليات، يجب تحويل الضوء بسرعة وكفاءة إلى طاقة كيميائية. تبدأ هذه العملية عندما يمتص مُركّب هوائي اصطياد الضوء الضوء وينقل الطاقة الممتصة إلى مركز التفاعل، مما يؤدي إلى بدء فصل الشحنات (4-7). تتكون الوحدة الأساسية لعملية التمثيل الضوئي في البكتيريا الضوئية الأرجوانية من مركز تفاعل من النوع الثاني، مُحاط بمُركّب حصاد الضوء 1 (LH1)، مُشكّلاً بذلك مُركّب النواة RC-LH1. يتكون LH1 من مجموعة من ثنائيات ألفا-بيتا غير المتجانسة المنحنية، يرتبط كل منها بجزيئين من الكلوروفيل البكتيري (BChl) أ وواحد أو اثنين من الكاروتينات (8-12). يتكون أبسط هوائي LH1 من 16 أو 17 ثنائيًا غير متجانسًا من ألفا-بيتا تحيط بمركز التفاعل (9-13) في حلقة مغلقة، ولكن في المركبات الأساسية الأخرى، تقاطع الببتيدات العابرة للغشاء استمرارية LH1 المحيط، مما يعزز انتشار الكينول/الكينون بين مركز التفاعل ومركب السيتوكروم bc1 (11، 13-15). يُعد نبات رودوبسيودوموناس (Rps.) الأرجواني الضوئي كائنًا نموذجيًا يمكن من خلاله فهم نقل الطاقة والإلكترون الذي يدعم عملية التمثيل الضوئي. أول بنية بلورية لـ Rps. يتكون نموذج معقد RC-LH1 في بكتيريا Rps. palustris من RC محاطًا بـ 15 حلقة LH1 غير متجانسة، تفصل بينها بروتين غير معروف يُسمى "البروتين W" (14). وقد تم لاحقًا تحديد البروتين W على أنه RPA4402، وهو بروتين غير مُوصوف بوزن 10.5 كيلو دالتون، ويحتوي على ثلاثة حلزونات غشائية متوقعة (TMH) (16). نقترح إعادة تسمية جين rpa4402 الذي يُشفّر البروتين W إلى pufW، وذلك ليتوافق مع التسمية المستخدمة للجينات التي تُشفّر الوحدات الفرعية RC-L وM (pufL، pufM) وLH1α وβ (pufA، pufB). ومن المثير للاهتمام أن البروتين W موجود فقط في حوالي 10% من معقد RC-LH1، مما يُشير إلى أن بكتيريا Rps. palustris تُنتج نوعين مختلفين من معقد RC-LH1. نقدم هنا بنيةً عالية الدقة تم الحصول عليها بتقنية المجهر الإلكتروني فائق البرودة (cryo-EM) لمركبين أساسيين، أحدهما يحتوي على البروتين W و14 وحدة ثنائية غير متجانسة من نوع αβ، والآخر خالٍ من البروتين W ويحتوي على حلقة LH1 مغلقة مكونة من 16 وحدة ثنائية غير متجانسة. تمثل بنيتنا نقلةً نوعيةً في فهم مركب RC-LH1 في بكتيريا Rps. palustris، إذ قمنا بتحليل مجموعة متجانسة من كل نوع، وحصلنا على دقة كافية لتحديد كل ببتيد والأصباغ المرتبطة به، بالإضافة إلى الدهون والكينونات ذات الصلة. تُظهر مقارنة هذه البنى أن البروتينات الثلاثة TMH-W، التي لم تُكتشف في أي مركب RC-LH1 آخر حتى الآن، تُنشئ قناةً للكينون لتسريع تبادل الكينون/الكينولون. تم تحديد عدد من مواقع ارتباط الدهون والكينون المحفوظة، وكشفنا عن تغير بنيوي جديد بعد ارتباط الكينون بمركز التفاعل (RC)، والذي قد يكون مناسبًا لمركز التفاعل في النظام الضوئي الثاني (PSII) للكائنات الحية الضوئية المؤكسجة. توفر نتائجنا رؤى جديدة حول حركية ارتباط الكينون/الكينولون وتبادله في المركب الأساسي RC-LH1 للبكتيريا الضوئية الأرجوانية.
لتسهيل دراسة تفصيلية للمركبين الموجودين في بكتيريا Rps. palustris، قمنا بعزل كل مركب RC-LH1 باستخدام الطرق الكيميائية الحيوية. تم تنقية المركب الذي يفتقر إلى البروتين W (يُشار إليه فيما يلي بـ ΔpufW) من السلالة التي تفتقر إلى جين pufW (16)، ولا يمكن إنتاج سوى مركب RC-LH1 واحد. يتم إنتاج المركب الذي يحتوي على البروتين W بواسطة سلالة أخرى. تم تعديل البروتين W لهذه السلالة بإضافة علامة His عشرية في نهايته الكربوكسيلية، بحيث يمكن دمج المركب الذي يحتوي على البروتين W بفعالية مع معظم المركبات التي تفتقر إلى البروتين W عن طريق تثبيت المعدن. يتم فصل المركب بفعالية (16) باستخدام كروماتوغرافيا التقارب (IMAC).
كما هو موضح في الشكل 1، يحتوي كلا المركبين على وحدة تحكم مركزية ثلاثية الوحدات (RC-L وRC-M وRC-H) محاطة بهوائي LH1. يُظهر التركيب البنيوي للمركب الخالي من البروتين W، بدقة 2.80 أنغستروم، 16 وحدة ثنائية غير متجانسة من نوع αβ، تُشكل حلقة LH1 مغلقة تُحيط بوحدة التحكم المركزية (RC) بالكامل، ويُشار إليه فيما يلي باسم المركب RC-LH116. أما التركيب البنيوي للمركب المحتوي على البروتين W، بدقة 2.65 أنغستروم، فيحتوي على 14 وحدة ثنائية غير متجانسة من نوع LH1 يفصلها البروتين W، ويُشار إليه فيما يلي باسم المركب RC-LH114-W.
(أ و ب) تمثيل سطحي للمركب. (ج و د) أصباغ مرتبطة معبر عنها بقضبان. (هـ و و) تُظهر المعقدات المرصودة من السطح السيتوبلازمي الببتيدات ووحدات LH1 الفرعية ممثلة برسومات كرتونية، ومرقمة باتجاه عقارب الساعة بدءًا من فجوة البروتين W [بما يتوافق مع ترقيم معقد Rba sphaeroides (13)]. بالنسبة لـ LH1-α، لون الوحدة الفرعية البروتينية أصفر؛ بالنسبة لـ LH1-β، لون الوحدة الفرعية البروتينية أزرق؛ بالنسبة للبروتين W، لون البروتين أحمر؛ بالنسبة لـ RC-H، لونه سماوي؛ بالنسبة لـ RC-L، لونه برتقالي؛ بالنسبة لـ RC-M، لونه أرجواني. تُمثل العوامل المساعدة بقضبان، ويمثل اللون الأخضر جزيئات BChl وBPh a، ويمثل اللون الأرجواني الكاروتينات، ويمثل اللون الأصفر جزيئات UQ10. (G وH) عرض مكبّر للفجوة بين البروتين وW في المنطقة المكافئة من معقد RC-LH114-W (G) ومعقد RC-LH116 (H). تظهر العوامل المساعدة على شكل ملء الفراغ، ويظهر الكينون المخلبي باللون الأزرق. تم تمييز الفجوة بين البروتين وW بخط أزرق متقطع في (G)، بينما تم تمييز الثقوب الصغيرة التي ينتشر فيها الكينون/الكينولول على حلقة LH116 بخط أسود متقطع في (H).
يُظهر الشكل 1 (أ و ب) مركز التفاعل محاطًا بمصفوفات مفتوحة أو مغلقة من ثنائيات LH1αβ غير المتجانسة، يرتبط كل منها باثنين من الكلوروفيل البكتيري وكاروتينويد واحد (الشكل 1، ج و د). وقد أظهرت دراسات سابقة أن Rps هو معقد LH1. في المسار الحيوي لتخليق زانثين السبيرولينا، تحتوي هذه الأنواع على تجمعات مختلطة من الكاروتينويدات (17). ومع ذلك، يُعد سبيروبيروكسانثين الكاروتينويد السائد، وكثافته مُرضية. لذلك، اخترنا نمذجة سبيروكسانثين في جميع مواقع ارتباط LH1. عديدات الببتيد ألفا وبيتا عبارة عن نطاقات حلقية غشائية مفردة ذات مناطق خارجية غشائية قصيرة (الشكل 1، أ، ب، هـ، و). على الرغم من عدم ملاحظة كثافة 17 حمضًا أمينيًا في الطرف الكربوكسيلي، فقد تم شطر عديد الببتيد ألفا من الميثيونين 1 إلى الألانين 46 في كلا المعقدين. اختُزلت عديدات الببتيد β من Gly4 إلى Tyr52 في RC-LH116، ومن Ser5 إلى Tyr52 في RC-LH114-W. لم تُلاحظ كثافة لـ 3 أو 4 بقايا طرفية N أو 13 بقايا طرفية C (الشكل S1). أظهر تحليل مطياف الكتلة للمركب المختلط RC-LH1 المُحضر من السلالة البرية أن المنطقة المفقودة كانت نتيجة انقسام غير متجانس لهذه الببتيدات (الشكلان S1 وS2). كما لوحظت إضافة مجموعة الفورميل إلى الطرف N لـ α-Met1 (f). أظهر التحليل أن ببتيد α يتكون من البقايا fMet1 إلى Asp42/Ala46/Ala47/Ala50، وأن ببتيد β يتكون من البقايا Ser2 إلى Ala53، وهو ما يتوافق تمامًا مع خريطة الكثافة المُلتقطة بالمجهر الإلكتروني عند درجة حرارة منخفضة.
يؤدي تنسيق α-His29 وβ-His36 إلى وضع جزيئات BChls وجهاً لوجه؛ حيث يتجمع كل ثنائي غير متجانس αβ مع جيرانه لتشكيل حلقة مفتوحة (RC-LH114-W) أو حلقة مغلقة (RC-LH116) حول مركز التفاعل (RC). تُظهر مصفوفة الصبغة المقترنة بالإكسيتون (الشكل 1، جـ ود) تشابهاً كبيراً. بالمقارنة مع نطاق 877 نانومتر لـ RC-LH114-W، يبلغ الانزياح الأحمر للامتصاص عند 880 نانومتر لـ RC-LH116 مقدار 3 نانومتر (الشكل 2أ). ومع ذلك، فإن طيف الاستقطاب الدائري متطابق تقريباً (الشكل 2ب)، مما يشير إلى أنه على الرغم من وجود فرق واضح بين الحلقات المفتوحة والمغلقة، إلا أن البيئة المحلية لجزيئات BChls متشابهة للغاية. قد يكون الانزياح الأحمر للامتصاص نتيجة لانخفاض الحركة الحرارية وزيادة الاستقرار على الحلقة المغلقة (18، 19)، أو التغيير في اقتران الصبغة الناتج عن الحلقة المغلقة (20، 21)، أو مزيج من هذين التأثيرين (11).
(أ) طيف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية/المرئية/القريبة من الأشعة تحت الحمراء، حيث تم تمييز قممها بالأصباغ المقابلة لها، وتمت معايرتها بالنسبة لقمة BPh عند 775 نانومتر. (ب) طيف الاستقطاب الدائري، تمت معايرته بالنسبة لامتصاص BChl عند 805 نانومتر. (جـ و د) أطياف ΔA مختارة من أطياف الامتصاص المعتمدة على الزمن لمركب RC-LH114-W (جـ) ومركب RC-LH116 (د). ولتحسين قابلية المقارنة، تمت معايرة جميع الأطياف بالنسبة لـ ∆A بقيمة −A عند 0.2 بيكو ثانية. (هـ) معدل أكسدة السيتوكروم c2 بعد التشعيع في وجود تراكيز مختلفة من UQ2 (انظر الشكل S8 للبيانات الأولية). (F) في الخلايا النامية تحت إضاءة منخفضة أو متوسطة أو عالية الشدة (10 أو 30 أو 300 ميكرومول/م² ثانية، على التوالي)، تم تحديد نسبة البروتين W ووحدات RC-L الفرعية في المركب المنقى ونسبة الغشاء المفصول. تم تحديد مستوى البروتين باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد SDS والمقايسة المناعية (انظر الشكل S9 للبيانات الأولية). تم تحديد النسبة بالنسبة إلى مركب RC-LH114-W المنقى. النسبة القياسية لـ RC-L إلى البروتين W في المركب هي 1:1.
تكون جزيئات الكلوروفيل البكتيري (BChls) في الموضع 1 من حلقة αβ14 المشوهة في RC-LH114-W (الشكل 1، A، C، وE) أقرب إلى المانح الأولي (P) في مركز التفاعل (RC) بمقدار 6.8 أنغستروم من جزيئات الكلوروفيل البكتيري المكافئة في RC-LH116 (الشكل 1، B، D، وF، والشكل S3)؛ ومع ذلك، تُظهر حركية الامتصاص العابر للمركبين أن ثوابت زمن نقل طاقة الإثارة من LH1 إلى مركز التفاعل (RC) في RC-LH114-W وRC-LH116 هي 40 ± 4 و44 ± 3 بيكو ثانية على التوالي (الشكل 2، C وD، الشكل S4 والجدول S2). كما لا يوجد فرق يُذكر في النقل الإلكتروني داخل مركز التفاعل (الشكل S5 والنص التكميلي ذي الصلة). نشك في أن التطابق الوثيق في زمن انتقال الطاقة بين LH1 وRC-P يعود إلى تشابه المسافة والزاوية والطاقة الكامنة لمعظم جزيئات BChl في حلقتي LH1. ويبدو أن استكشاف نمط طاقة LH1 للوصول إلى أقصر مسافة ليس أسرع من انتقال الطاقة المباشر من المواقع غير المثلى إلى RC. كما قد تخضع حلقة LH1 المفتوحة في RC-LH114-W لحركة حرارية طفيفة في ظروف درجات الحرارة المنخفضة لأغراض التحليل البنيوي، ويوجد شكل حلقي αβ14 أطول عند درجة حرارة الغرفة نتيجةً لمسافة التصبغ لجزيئات βBChl في موضع RC 1.
يحتوي مُركّب RC-LH116 على 32 جزيء من الكلوروفيل البكتيري و16 جزيء من الكاروتينات، وترتيبه العام مُطابقٌ لما تم الحصول عليه من Thermochromatium (Tch.) pidpidum [معرّف بنك بيانات البروتين (PDB) 5Y5S] (9)، وسلالة Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (معرّف PDB 7C9R) (12)، والطحالب الخضراء (Blc.viridis) (معرّف PDB 6ET5) (10). بعد المُحاذاة، لوحظت انحرافات طفيفة فقط في مواقع ثنائيات αβ غير المتجانسة، وخاصةً 1-5 و15 و16 (الشكل S6). يُؤثّر وجود البروتين W بشكلٍ كبير على بنية LH1. ترتبط مجالاته الثلاثة عبر الغشائية (TMHs) بحلقات قصيرة، حيث يقع الطرف الأميني (N-terminal) على جانب تجويف المُركّب، بينما يقع الطرف الكربوكسيلي (C-terminal) على الجانب السيتوبلازمي (الشكلان 1A و3، من A إلى D). يُعدّ البروتين W كارهًا للماء إلى حد كبير (الشكل 3ب)، ويتفاعل كل من TMH2 وTMH3 مع LH1αβ-14 لتشكيل سطح عبر غشائي (الشكل 3، ب وهـ إلى ز). يتكون هذا السطح بشكل أساسي من بقايا فينيل ألانين، وليوسين، وفالين في المنطقة عبر الغشائية. تتراص هذه البقايا مع الأحماض الأمينية الكارهة للماء وأصباغ αβ-14. تساهم بعض البقايا القطبية أيضًا في هذا التفاعل، بما في ذلك الرابطة الهيدروجينية بين W-Thr68 وβ-Trp42 على سطح تجويف المركب (الشكل 3، و وز). على سطح السيتوبلازم، يقع Gln34 بجوار مجموعة الكيتو في كاروتينات αβ-14. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد جزيء n-دوديسيل β-د-مالتوزيد (β-DDM)، وامتد ذيله الكاره للماء إلى منطقة التماس بين البروتين W و αβ-14، وقد يقع الذيل الدهني في جسم البروتين. لاحظنا أيضًا أن مناطق التحديد الطرفية C للبروتين W و RCH متقاربة جدًا، ولكنها لا تقع ضمن نطاق تكوين تفاعلات محددة (الشكل 1، A و E). مع ذلك، قد توجد تفاعلات في الأحماض الأمينية الطرفية C غير المحددة لهذين البروتينين، مما قد يوفر آلية لاستقطاب البروتين W أثناء تجميع معقد RC-LH114-W.
(أ) يُظهر الشكل الكرتوني بروتين W، المواجه للسطح البيني مع LH1αβ14، بسلسلة جانبية على شكل قضيب (باللون الأحمر)، معروضة في جزء من مخطط الجهد الكهروستاتيكي (سطح رمادي شفاف بمستوى كفاف 0.13). (ب) يُمثل بروتين W بسطح ملون كاره للماء. تُعرض المناطق القطبية والمشحونة باللون السماوي، والمناطق الكارهة للماء باللون الأبيض، والمناطق شديدة الكراهية للماء باللون البرتقالي. (جـ و د) يُمثل بروتين W بشكل كرتوني، ويكون اتجاهه مماثلاً لما هو عليه في (أ) (جـ)، ومُدارًا بزاوية 180 درجة (د). وفقًا لموقعه في التسلسل، تتبنى البقايا المميزة نظام ألوان قوس قزح، حيث يكون الطرف الأميني أزرقًا والطرف الكربوكسيلي أحمر. (هـ) يُمثل بروتين W بنفس المنظر كما في (أ)، وتُمثل البقايا عند السطح البيني بين بروتين W وLH1 بقضبان عليها علامات. (F) تم تدوير البروتين W بزاوية 90 درجة بالنسبة إلى (E) وLH1αβ14 في التمثيل الكرتوني، وبالنسبة إلى بقايا الواجهة في التمثيل الشريطي. تم تمييز البقايا المتدلية من عديد الببتيد بيتا. يظهر العامل المساعد كشريط مطابق للون الشكل 1، ويظهر β-DDM المتحلل باللون الرمادي، ويظهر الأكسجين باللون الأحمر. (G) تم تدوير المنظر في (F) بزاوية 180 درجة، مع البقايا البارزة من عديد الببتيد ألفا المميز.
يستبدل البروتين W ثنائيًا غير متجانس αβ (الخامس عشر في الشكل 1F)، مما يمنع انغلاق الحلقة ويؤدي إلى إمالة الثنائيات غير المتجانسة الثلاثة الأولى αβ. لوحظ أن زاوية الميل القصوى للثنائي غير المتجانس الأول αβ-1 بالنسبة للعمود المقام على الغشاء تتراوح بين 25° و29° (الشكل 1، A وE)، والتي تشكلت نتيجة ميل αβ-1 في RC A sharp contrast-LH116 بمقدار 2° إلى 8° (الشكل 1، B وF). أما الثنائيان غير المتجانسان الثاني والثالث فيميلان بزوايا تتراوح بين 12° ​​و22°، وبين 5° و10° على التوالي. بسبب الإعاقة الفراغية لمركز التفاعل، لا يشمل ميل الوحدة الفرعية αβ-1 الزوج الثاني من αβ (الذي يُقابل الوحدة الفرعية αβ رقم 16 في الشكل 1F)، مما يُشكل فجوة واضحة في حلقة LH1 (الشكل 1، A وE). ونظرًا لغياب وحدتين فرعيتين غير متجانستين من αβ، مصحوبًا بفقدان أربعة جزيئات من الكلوروفيل البكتيري واثنين من الكاروتينات، لا يرتبط أي من الكاروتينات بالوحدة الفرعية αβ-1 الملتوية، مما ينتج عنه حلقة LH114-W تحتوي على 13 كاروتينًا نباتيًا و28 جزيئًا من الكلوروفيل البكتيري. تُعد تقديرات الدقة الموضعية للمركبين في المناطق من αβ1 إلى 7 أقل من تلك الخاصة ببقية حلقة LH1، وهو ما قد يعكس المرونة الكامنة في الوحدة الفرعية LH1 المجاورة لموقع مركز التفاعل QB (الشكل 4).
تُظهر الصورتان RC-LH114-W (أ و ب) وRC-LH116 (ج و د) نفس المنظر العلوي/الجانبي (أ و ب) (أ و ج) وسطح التجويف في الشكل 1 (ب و د). وتظهر مفاتيح الألوان على اليمين.
المركب الأساسي المميز الآخر الوحيد بنسبة قياس العناصر 1:14 هو ثنائي Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). ومع ذلك، لا يوجد تشابه واضح بين البروتين W وPufX، ولهما تأثير كبير على بنية LH1 الخاصة بهما. PufX هو نطاق حلقي عبر غشائي واحد (TMH) ذو نطاق سيتوبلازمي طرفي N يتفاعل مع الجانب السيتوبلازمي للوحدة الفرعية RC-H (13) في موضع يُطابق Rps. palustris LH116αβ-16. يُنشئ PufX قناة لتبادل الكينون/الكينولون بين RC-LH1 ومركب السيتوكروم bcl، وهو موجود في جميع المركبات الأساسية لـ Rba. sphaeroides (13). على الرغم من أن واجهة المونومر-مونومر موجودة في Rba. يقع ثنائي RC-LH1-PufX من بكتيريا Sphaeroides في موضع ارتباط البروتين W في RC-LH114-W، وتقع الفجوة الناتجة عن PufX والبروتين W في موضع مماثل (الشكل S7A). كما تتوافق الفجوة في RC-LH114-W مع قناة الكينون الافتراضية (8) في Pseudomonas rosea LH1، والتي تتكون من ببتيدات لا علاقة لها بالبروتين W أو PufX (الشكل S7B). بالإضافة إلى ذلك، تقع قناة الكينون في Blc. the emerald green LH1، المتكونة باستبعاد وحدة فرعية γ واحدة (7)، في موضع مشابه (الشكل S7C). على الرغم من اختلاف البروتينات التي تتوسط هذه القنوات، إلا أن ظهور قنوات الكينون/الكينولول هذه في موضع مشترك في مركب RC-LH1 يُعد مثالًا على التطور التقاربي، مما يشير إلى أن الفجوة التي يُحدثها البروتين W قد تعمل كقناة كينون.
تسمح الفجوة في حلقة LH114-W بتكوين منطقة غشائية متصلة بين الحيز الداخلي لمركب RC-LH114-W والغشاء الخارجي (الشكل 1G)، بدلاً من ربط النطاقين عبر مسام بروتينية كما هو الحال في البروتينات. يشبه مركب RC-LH116 مركب Tch. المغلق الشبيه بالإبرة (22) (الشكل 1H). بما أن انتشار الكينون عبر الغشاء أسرع من انتشاره عبر القناة البروتينية الضيقة، فإن حلقة LH114-W المفتوحة تسمح بدوران أسرع لمركز التفاعل (RC) مقارنةً بحلقة LH116 المغلقة، وقد يكون انتشار الكينون إلى مركز التفاعل أكثر تقييدًا. لاختبار ما إذا كان البروتين W يؤثر على تحويل الكينونات عبر مركز التفاعل، أجرينا اختبار أكسدة السيتوكروم على تركيز معين من يوبيكوينون 2 (UQ2) (وهو نظير لـ UQ10 الطبيعي ذي ذيل إيزوبرين أقصر) (الشكل 2E). على الرغم من أن وجود الكينون المخلبي يعيق التحديد الدقيق لثابت مايكليس الظاهري (RC-LH114-W و RC-LH116 مناسبان لـ 0.2±0.1 ميكرومتر و 0.5±0.2 ميكرومتر على التوالي)، فإن المعدل الأقصى لـ RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) أكبر بنسبة 28±5% من RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
قدّرنا مبدئيًا أن البروتين W موجود في حوالي 10% من المركب الأساسي (16)؛ وهنا، تبلغ معدلات التواجد في خلايا النمو في ظروف الإضاءة المنخفضة والمتوسطة والعالية 15±0.6% و11±1% و0.9±0.5% على التوالي (الشكل 2F). أظهرت المقارنة الكمية باستخدام مطياف الكتلة أن إضافة علامة الهيستيدين لم تُقلل من الوفرة النسبية للبروتين W مقارنةً بالسلالات البرية (P = 0.59)، لذا فإن هذه المستويات ليست ناتجة عن تعديل البروتين W (الشكل S10). مع ذلك، قد يسمح هذا التواجد المنخفض للبروتين W في مركب RC-LH1 لبعض مراكز التفاعل بالانقلاب بمعدل متسارع، مما يُخفف من بطء تبادل الكينون/الكينولون في مركب RC-LH116. لاحظنا أن معدل إشغال الضوء المرتفع لا يتوافق مع بيانات علم الجينوم الوظيفي الحديثة، والتي تشير إلى أن التعبير الجيني لـ pufW يزداد تحت الضوء القوي (الشكل S11) (23). إن الاختلاف بين نسخ pufW ودمج البروتين W في معقد RC-LH1 أمرٌ مُحيّر، وقد يعكس التنظيم المعقد لهذا البروتين.
في المركب RC-LH114-W، تم تخصيص 6 جزيئات من الكارديوليبين (CDL)، و7 جزيئات من الفوسفاتيديل كولين (POPC)، وجزيء واحد من الفوسفاتيديل جليسرول (POPG)، و29 جزيء من β-DDM، ونمذجتها في المركب RC-LH116 (الشكل 5، أ و ب). في هذين التركيبين، يقع الكارديوليبين (CDL) تقريبًا على الجانب السيتوبلازمي للمركب، بينما تقع جزيئات الفوسفاتيديل كولين (POPC) والفوسفاتيديل جليسرول (POPG) وβ-DDM في الغالب على الجانب اللمعي. تم عزل جزيئين من الليبيدات والمنظفات في المنطقة من αβ-1 إلى αβ-6 من المركب RC-LH114-W (الشكل 5أ)، وخمسة جزيئات في المنطقة المكافئة من المركب RC-LH116 (الشكل 5ب). وُجدت المزيد من الدهون على الجانب الآخر من المركب، وخاصةً CDL، متراكمة بين RC و αβ-7 إلى αβ-13 (الشكل 5، أ و ب). تقع دهون ومنظفات أخرى محددة التركيب خارج حلقة LH1، وتمتد سلاسل أسيل محددة جيدًا بين وحدات LH1 الفرعية، والتي يُشار إليها مبدئيًا باسم β-DDM في RC-LH114-W، وتُعرف باسم β-DDM في RC A، وهو مزيج من β-DDM و POPC-LH116. تشير المواقع المتشابهة للدهون والمنظفات المخلبية في تركيبنا إلى أنها مواقع ارتباط ذات أهمية فسيولوجية (الشكل S12A). كما أن مواقع الجزيئات المتكافئة في Tch تتسم بتناسق جيد. Gentle و Trv. أظهرت السلالة 970 RC-LH1s (الشكل S12، من B إلى E) (9، 12) وبقايا الروابط الهيدروجينية لمجموعة رأس الدهون حفظًا جيدًا إلى حد ما في محاذاة التسلسل (الشكل S13)، مما يشير إلى أن CDL المحفوظ الذي يرتبط بـ RC (24)، قد تكون هذه المواقع محفوظة في مركب RC-LH1.
(أ و ب) يُمثَّل الببتيدان RC-LH114-W (أ) وRC-LH116 (ب) برسومات كرتونية، وتُمثَّل الأصباغ بقضبان، باستخدام نظام الألوان في الشكل 1. تظهر الدهون باللون الأحمر، والمنظفات باللون الرمادي. يظهر اليوكوينون المرتبط بمواقع QA وQB في RC باللون الأصفر، بينما يظهر اليوكوينون المنفرد باللون الأزرق. (ج و د) نفس المنظرين (أ) و(ب)، مع حذف الدهون. (هـ إلى ز) عرض مُكبَّر لـ Q1 (هـ)، وQ2 (و)، وQ3 (ز) من RC-LH116، مع السلاسل الجانبية التي تؤثر على بعضها البعض. تظهر الروابط الهيدروجينية بخطوط سوداء متقطعة.
في المركب RC-LH116، يتحلل كل من RC QA وQB UQ، اللذان يشاركان في نقل الإلكترونات في عملية فصل الشحنة، في مواقع ارتباطهما. مع ذلك، في المركب RC-LH114-W، لم يتم تحديد موقع الكينون QB، وسيتم مناقشته بالتفصيل لاحقًا. بالإضافة إلى الكينونات QA وQB، تم تحديد موقع جزيئين من UQ المخلبي (يقعان بين حلقتي RC وLH1) في بنية RC-LH114-W وفقًا لمجموعاتهما الرأسية المحددة جيدًا (الموجودة في Q1 وQ2، على التوالي). (الشكل 5C). تم تخصيص وحدتي إيزوبرين لـ Q1، وتُظهر خريطة الكثافة ذيول الإيزوبرين العشرة الكاملة لـ Q2. في بنية RC-LH116، تم تحديد موقع ثلاثة جزيئات UQ10 مخلبية (من Q1 إلى Q3، الشكل 5D)، وتتمتع جميع الجزيئات بكثافة واضحة على امتداد الذيل (الشكل 5، من D إلى G). في البنيتين، تتطابق مواقع مجموعات الكينون الرأسية لـ Q1 وQ2 بشكل ممتاز (الشكل S12F)، وتتفاعل فقط مع RC. يقع Q1 عند مدخل فجوة W في RC-LH114-W (الشكل 1G و5، C وD وE)، بينما يقع Q2 بالقرب من موقع ارتباط QB (الشكل 5، C وD وF). تقع بقايا L-Trp143 وL-Trp269 المحفوظة بالقرب من Q1 وQ2، مما يوفر تفاعلات تكديس π محتملة (الشكل 5، E وF، والشكل S12). يوفر L-Gln88، الذي يبعد 3.0 أنغستروم عن ذرة الأكسجين البعيدة لـ Q1، رابطة هيدروجينية قوية (الشكل 5E)؛ هذه البقايا محفوظة في جميع RCs باستثناء تلك الأبعد (الشكل S13). يُستبدل L-Ser91 بـ Thr بشكل محافظ في معظم مراكز التفاعل الأخرى (الشكل S13)، ويبعد 3.8 أنغستروم عن ذرة أكسجين الميثيل في Q1، وقد يُكوّن روابط هيدروجينية ضعيفة (الشكل 5E). لا يبدو أن Q3 له تفاعل محدد، ولكنه يقع في المنطقة الكارهة للماء بين الوحدة الفرعية RC-M والوحدة الفرعية LH1-α من 5 إلى 6 (الشكل 5، D وG). كما تم تحديد Q1 وQ2 وQ3 أو الكينونات المخلبية المجاورة في Tch. Gentle وTrv. Strain 970 وBlc. يشير تركيب القزحية (9، 10، 12) إلى موقع ارتباط كينوني مساعد محفوظ في معقد RC-LH1 (الشكل S12G). تتوافق قيم اليوكونينات الخمسة المتحللة في RC-LH116 بشكل جيد مع قيمة 5.8±0.7 لكل مركب تم تحديدها بواسطة كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)، بينما قيم اليوكونينات الثلاثة المتحللة في RC-LH114-W أقل من القيمة المقاسة البالغة 6.2±0.3 (الشكل S14) مما يشير إلى وجود جزيئات يوكينون غير مفصولة في التركيب.
تحتوي عديدات الببتيد L وM شبه المتناظرة على خمسة نطاقات غشائية حلقية (TMHs)، وتشكل ثنائيًا غير متجانس يجمع بين ثنائي واحد من الكلوروفيل البكتيري (BChl)، واثنين من مونومرات الكلوروفيل البكتيري، واثنين من مونومرات العاثية البكتيرية (BPh)، وذرة حديد غير هيمية واحدة، وجزيء واحد أو جزيئين من اليوكوينون 10 (UQ10). وبفضل وجود روابط هيدروجينية على مجموعة الكيتون الطرفية وتراكمها المعروف في الببتيدات المقاومة للكاروتينات (Rps)، تُدمج الكاروتينات في الوحدة الفرعية M، والتي تُسمى سيس-3،4-ديهيدروورودوبين. (النوع 25). يرتبط نطاق الغشاء الخارجي لـ RC-H بالغشاء بواسطة نطاق غشائي حلقي واحد. يشبه التركيب العام لمركز التفاعل (RC) مركز التفاعل ثلاثي الوحدات للأنواع ذات الصلة (مثل Rba). sphaeroides (معرف بنك بيانات البروتين: 3I4D). تتداخل الحلقات الكبيرة لـ BChl و BPh، والعمود الفقري للكاروتينويد والحديد غير الهيمي ضمن نطاق دقة هذه الهياكل، وكذلك مجموعة رأس UQ10 في موقع QA والكينون QB في RC-LH116 (الشكل S15).
يُتيح توفر بنيتين لـ RC بمعدلات إشغال مختلفة لمواقع QB فرصةً جديدةً لدراسة التغيرات البنيوية المتسقة المصاحبة لارتباط الكينون QB. في مُركّب RC-LH116، يقع الكينون QB في الموضع "القريب" المرتبط بالكامل (26)، بينما لا يحتوي مُركّب RC-LH114-W على الكينون QB. يُعدّ غياب الكينون QB في RC-LH114-W أمرًا مُثيرًا للدهشة نظرًا لنشاط هذا المُركّب، بل ونشاطه يفوق نشاط مُركّب RC-LH116 الذي يحتوي على كينون QB مُحدّد بنيويًا. على الرغم من أن حلقتي LH1 تُخَلِّبان حوالي ستة كينونات، إلا أن خمسة منها مُحدّدة بنيويًا في حلقة RC-LH116 المُغلقة، بينما ثلاثة فقط مُحدّدة بنيويًا في حلقة RC-LH114-W المفتوحة. قد يعكس هذا الاضطراب البنيوي المُتزايد سرعة استبدال مواقع QB في RC-LH114-W، وسرعة حركية الكينون في المُركّب، وزيادة احتمالية عبور حلقة LH1. نقترح أن نقص اليوكوينون في موقع RC QB الخاص بـ RC-LH114-W قد يكون نتيجة لمركب أكثر تعقيدًا ونشاطًا، وأن موقع QB الخاص بـ RC-LH114-W قد تم تجميده على الفور في دورة اليوكوينون. المرحلة المحددة (تم إغلاق مدخل موقع QB) تعكس شكل هذا النشاط.
في غياب QB، يحدث دوران مصاحب لـ L-Phe217 إلى موضع غير متوافق مع ارتباط UQ10، لأنه سيؤدي إلى تصادم مكاني مع وحدة الأيزوبرين الأولى في الذيل (الشكل 6A). بالإضافة إلى ذلك، فإن التغيرات الهيكلية الرئيسية واضحة، لا سيما في اللولب de (اللولب القصير في الحلقة بين TMH D وE) حيث ينتقل L-Phe217 إلى جيب ارتباط QB، ودوران L-Tyr223 (الشكل 6A) لكسر الرابطة الهيدروجينية مع إطار M-Asp45 وإغلاق مدخل موقع ارتباط QB (الشكل 6B). يدور اللولب de عند قاعدته، وينزاح Cα لـ L-Ser209 بمقدار 0.33 أنغستروم، بينما ينزاح Cα لـ L-Val221 بمقدار 3.52 أنغستروم. لا توجد تغييرات ملحوظة في نطاقي TMH D و E، وهما متطابقان في كلا البنيتين (الشكل 6أ). على حد علمنا، هذه هي البنية الأولى في مركز التفاعل الطبيعي التي تُغلق موقع QB. تُظهر المقارنة مع البنية الكاملة (المرتبطة بـ QB) أنه قبل اختزال الكينون، يلزم حدوث تغيير في التكوين الفراغي لتمكينه من الدخول في الكينون. يدور L-Phe217 ليشكل تفاعل تكديس π مع المجموعة الرأسية للكينون، وينزاح الحلزون للخارج، مما يسمح لهيكل L-Gly222 والسلسلة الجانبية لـ L-Tyr223 بتكوين شبكة روابط هيدروجينية ذات بنية روابط هيدروجينية مستقرة (الشكل 6، أ و ج).
(أ) رسم توضيحي متراكب للهولوغرام (السلسلة L، برتقالي/السلسلة M، أرجواني) وبنية البروتين الخالي من الركيزة (رمادي)، حيث تُعرض البقايا الرئيسية على شكل قضيب. يُمثل UQ10 بشريط أصفر. يشير الخط المنقط إلى الروابط الهيدروجينية المتكونة في البنية بأكملها. (ب وج) تمثيل سطحي للبروتين الخالي من الركيزة وبنية الحلقة بأكملها، مع إبراز ذرة الأكسجين في السلسلة الجانبية لـ L-Phe217 باللون الأزرق وL-Tyr223 باللون الأحمر، على التوالي. الوحدة الفرعية L برتقالية اللون؛ أما الوحدتان الفرعيتان M وH فليستا ملونتين. (د وهـ) البروتين الخالي من الركيزة (د) ومواقع RC QB الكاملة (هـ) [ملونة حسب (أ) على التوالي] وThermophilus thermophilus PSII (أخضر، أزرق مع كينون بلاستيكي؛ معرف PDB: 3WU2) محاذاة (58).
على نحو غير متوقع، ورغم توفر العديد من هياكل معقدات التفاعل (RCs) التي تفتقر إلى QB وLH1، فإن التغيرات البنيوية الملاحظة في هذه الدراسة لم تُنشر سابقًا. وتشمل هذه التغيرات بنية استنزاف QB من Blc. viridis (معرف بنك بيانات البروتين: 3PRC) (27)، وTch. tepidum (معرف بنك بيانات البروتين: 1EYS) (28)، وRba. sphaeroides (معرف بنك بيانات البروتين: 1OGV) (29)، وجميعها متطابقة تقريبًا مع بنية QB العامة. كشف الفحص الدقيق لـ 3PRC أن جزيئات منظف LDAO (أكسيد لوريل ثنائي ميثيل أمين) ترتبط بمدخل موقع QB، مما قد يمنع إعادة الترتيب إلى بنية مغلقة. ورغم أن LDAO لا يتحلل في الموضع نفسه في 1EYS أو 1OGV، إلا أن معقدات التفاعل هذه مُحضّرة باستخدام المنظف نفسه، وبالتالي قد تُنتج التأثير نفسه. البنية البلورية لـ Rba. يبدو أن مركب Sphaeroides RC المتبلور مع السيتوكروم c2 (معرف بنك بيانات البروتين: 1L9B) يمتلك أيضًا موقع ارتباط مغلقًا. مع ذلك، في هذه الحالة، تتخذ المنطقة الطرفية الأمينية لببتيد RC-M (المتفاعل مع موقع ارتباط QB عبر الرابطة الهيدروجينية لبقايا التيروسين على حلزون Q) هيئة غير طبيعية، ولم يتم استكشاف التغير في هيئة QB بشكل أعمق (30). ومما يبعث على الاطمئنان أننا لم نرَ هذا النوع من التشوه في ببتيد M في بنية RC-LH114-W، والتي تكاد تكون مطابقة للمنطقة الطرفية الأمينية لمركب RC-LH116 RC. تجدر الإشارة أيضًا إلى أنه بعد إزالة هوائي LH1 القائم على المنظفات، تم فصل معقدات البروتين الشحمي في قاعدة بيانات البروتينات (PDB)، مما أدى إلى إزالة تجمعات الكينون والدهون الداخلية في الفجوة بين المعقد والسطح الداخلي لحلقة LH1 المحيطة (31، 32). يظل المعقد فعالًا لأنه يحتفظ بجميع العوامل المساعدة، باستثناء كينون QB القابل للتحلل، وهو أقل استقرارًا وغالبًا ما يُفقد أثناء عملية التحضير (33). بالإضافة إلى ذلك، من المعروف أن إزالة LH1 والدهون الحلقية الطبيعية من المعقد قد تؤثر على وظائفه، مثل تقصير عمر حالة P+QB المفصولة الشحنة (31، 34، 35). لذلك، نفترض أن وجود حلقة LH1 المحلية المحيطة بالمعقد قد يحافظ على موقع QB "المغلق"، وبالتالي يحافظ على البيئة المحلية بالقرب من QB.
على الرغم من أن البروتين الشحمي (بدون كينون QB) والبنية الكاملة لا يمثلان سوى لقطتين من دورة موقع QB، وليس سلسلة من الأحداث، إلا أن هناك مؤشرات على إمكانية التحكم في الارتباط لمنع إعادة الارتباط بواسطة الهيدروكينون، وذلك لتثبيط تثبيط الركيزة. قد يختلف تفاعل الكينولول والكينون بالقرب من موقع QB في البروتين الشحمي، مما يؤدي إلى رفضه بواسطة مركز التفاعل. لطالما اقتُرح أن التغيرات التركيبية تلعب دورًا في ارتباط الكينونات واختزالها. تتأثر قدرة مراكز التفاعل المجمدة على اختزال الكينونات بعد التكيف مع الظلام (36)؛ ويُظهر علم البلورات بالأشعة السينية أن هذا التلف ناتج عن انحصار كينونات QB في بنية "بعيدة" على بُعد حوالي 4.5 أنغستروم من الموضع القريب النشط (26، 37). نقترح أن هذا التكوين الرابط البعيد هو لقطة للحالة الوسيطة بين البروتين الشحمي وبنية الحلقة الكاملة، والتي تتبع التفاعل الأولي مع الكينون وفتح موقع QB.
يتميز مركز التفاعل من النوع الثاني (RC) الموجود في معقد النظام الضوئي الثاني (PSII) لبعض البكتيريا الضوئية والبكتيريا الزرقاء والطحالب والنباتات، بحفظ بنيوي ووظيفي (38). ويؤكد التوافق البنيوي الموضح في الشكل 6 (D وE) التشابه بين مراكز التفاعل في النظام الضوئي الثاني وموقع ارتباط الكينون (QB) في معقد التفاعل البكتيري. لطالما شكلت هذه المقارنة نموذجًا لدراسة الأنظمة وثيقة الصلة بربط الكينون واختزاله. وقد أشارت منشورات سابقة إلى أن التغيرات التركيبية تترافق مع اختزال الكينونات في النظام الضوئي الثاني (39، 40). لذلك، وبالنظر إلى الحفظ التطوري لمركز التفاعل، قد تكون آلية الارتباط هذه، التي لم تُلاحظ سابقًا، قابلة للتطبيق أيضًا على موقع ارتباط الكينون في مركز التفاعل في النظام الضوئي الثاني في النباتات الضوئية المؤكسجة.
تم وصف سلالات Rps ΔpufW (حذف جين pufW غير الموسوم) وPufW-His (بروتين W موسوم بعشرة هيستيدين في الطرف الكربوكسيلي، مُعبر عنه من موقع جين pufW الطبيعي). وقد تم استخلاص هذه السلالات، بالإضافة إلى السلالة الأصلية المتماثلة جينيًا من النوع البري، من المُجمد عن طريق زرع عدد قليل من الخلايا على طبق أجار PYE (بتركيز 5 غ/لتر لكل منها) (مُخزن في وسط LB عند درجة حرارة -80 درجة مئوية، يحتوي على 50% (وزن/حجم) جلسرين) [بروتين، مستخلص خميرة، وساكسينات] [1.5% (وزن/حجم)]. حُضنت الصفيحة طوال الليل في الظلام عند درجة حرارة الغرفة في ظروف لاهوائية، ثم عُرِّضت لضوء أبيض (حوالي 50 ميكرومول/م² ثانية) من مصابيح هالوجين OSRAM بقوة 116 واط (RS Components، المملكة المتحدة) لمدة 3 إلى 5 أيام حتى ظهور مستعمرة واحدة. استُخدمت هذه المستعمرة لتلقيح 10 مل من وسط M22+ (41) المُضاف إليه 0.1% (وزن/حجم) من الأحماض الأمينية الكازينية (يُشار إليه فيما يلي بـ M22). نُمت المزرعة في ظروف منخفضة الأكسجين في الظلام عند 34 درجة مئوية مع الرجّ بسرعة 180 دورة في الدقيقة لمدة 48 ساعة، ثم لُقِّحت 70 مل من المزرعة في نفس الظروف لمدة 24 ساعة. استُخدمت مزرعة شبه هوائية بحجم 1 مل لتلقيح 30 مل من وسط M22 في زجاجة زجاجية شفافة ذات غطاء لولبي سعة 30 مل، ثم عُرِّضت للإشعاع مع التحريك (حوالي 50 ميكرومول/م² ثانية) لمدة 48 ساعة باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي معقم. بعد ذلك، لُقِّح 30 مل من المزرعة بحوالي لتر واحد من المزرعة تحت نفس الظروف، ثم استُخدمت هذه المزرعة لتلقيح حوالي 9 لترات من المزرعة المُعرَّضة للإشعاع بكثافة حوالي 200 ميكرومول/م² ثانية لمدة 72 ساعة. جُمعت الخلايا بالطرد المركزي عند قوة طرد مركزي نسبية 7132 لمدة 30 دقيقة، ثم أُعيد تعليقها في حوالي 10 مل من محلول تريس-هيدروكلوريد بتركيز 20 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 8.0)، وحُفظت عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
بعد إذابة الخلايا، أضف بعض بلورات ديوكسي ريبونوكلياز I (ميرك، المملكة المتحدة)، وليزوزيم (ميرك، المملكة المتحدة)، وقرصين من مثبطات بروتياز هولوإنزيم من روش (ميرك، المملكة المتحدة) إلى الخلايا المُعلقة. في خلية ضغط فرنسية بقوة 20,000 رطل لكل بوصة مربعة (أمينكو، الولايات المتحدة الأمريكية)، تم تكسير الخلايا من 8 إلى 12 مرة. بعد إزالة الخلايا غير المكسورة والحطام غير الذائب بالطرد المركزي عند 18,500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، تم ترسيب الغشاء من المحلول الملون بالطرد المركزي عند 113,000 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين عند 43,000 درجة مئوية. تخلص من الجزء الذائب وأعد تعليق الغشاء الملون في 100 إلى 200 مل من محلول تريس-هيدروكلوريد بتركيز 20 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 8.0) وقم بالتجانس حتى لا تظهر أي تجمعات مرئية. تم تحضين الغشاء المعلق في محلول Tris-HCl بتركيز 20 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 8.0) (Anatrace، الولايات المتحدة الأمريكية) يحتوي على 2% (وزن/حجم) من β-DDM لمدة ساعة واحدة في الظلام عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع التحريك اللطيف. ثم تم طرده مركزيًا عند درجة حرارة 70 درجة مئوية لإذابة 150,000 RCF عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة لإزالة المواد غير الذائبة المتبقية.
تم تطبيق الغشاء المُذيب من سلالة ΔpufW على عمود تبادل أيوني من نوع DEAE Sepharose سعة 50 مل، مع ثلاثة أحجام عمودية (CV) من محلول الربط [20 ملي مولار من Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 8.0) يحتوي على 0.03% (وزن/حجم) من β-DDM]. غُسل العمود بحجمين عموديين من محلول الربط، ثم غُسل العمود مرة أخرى بحجمين عموديين من محلول الربط يحتويان على 50 ملي مولار من كلوريد الصوديوم. تم فصل مُركب RC-LH116 باستخدام تدرج خطي من 150 إلى 300 ملي مولار من كلوريد الصوديوم (في محلول الربط) عند حجم عمودي 1.75، وتم فصل مُركب الربط المتبقي باستخدام محلول ربط يحتوي على 300 ملي مولار من كلوريد الصوديوم عند حجم عمودي 0.5. قم بجمع طيف الامتصاص بين 250 و1000 نانومتر، واحتفظ بالجزء ذي نسبة الامتصاص (A880/A280) الأكبر من 1 عند 880 إلى 280 نانومتر، وخففه مرتين في محلول الربط، ثم اتبع نفس الإجراء مرة أخرى على عمود DEAE للتنقية. خفف الأجزاء ذات نسب A880/A280 الأعلى من 1.7 ونسب A880/A805 الأعلى من 3.0، وقم بإجراء الجولة الثالثة من التبادل الأيوني، واحتفظ بالأجزاء ذات نسب A880/A280 الأعلى من 2.2 ونسب A880/A805 الأعلى من 5.0. تم تركيز المركب المنقى جزئيًا إلى حوالي 2 مل في مرشح طرد مركزي من نوع Amicon ذي حد قطع جزيئي (MWCO) يبلغ 100,000 (شركة ميرك، المملكة المتحدة)، ثم تم تحميله على عمود فصل حجمي Superdex 200 16/600 (شركة GE Healthcare، الولايات المتحدة) يحتوي على محلول منظم من كلوريد الصوديوم بتركيز 200 ملي مولار، ثم تم فصله في نفس المحلول المنظم عند 1.5 حجم عمود. تم جمع أطياف الامتصاص لجزء الفصل الحجمي، وتركيز أطياف الامتصاص بنسب A880/A280 التي تزيد عن 2.4 ونسب A880/A805 التي تزيد عن 5.8 إلى 100 A880، واستخدامها فورًا لتحضير شبكات المجهر الإلكتروني فائق البرودة أو تخزينها. يُحفظ عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لحين الحاجة.
تم تطبيق الغشاء المُذيب من سلالة PufW-His على عمود HisPrep FF Ni-NTA Sepharose سعة 20 مل (محلول Tris-HCl بتركيز 20 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 8.0) يحتوي على 200 ملي مولار من كلوريد الصوديوم و0.03% (وزن/وزن)) في محلول IMAC (شركة GE Healthcare). تم غسل العمود بخمسة أحجام عمودية من محلول IMAC، ثم بخمسة أحجام عمودية من محلول IMAC يحتوي على 10 ملي مولار من الهيستيدين. تم استخلاص المركب الأساسي من العمود بخمسة محاليل IMAC تحتوي على 100 ملي مولار من الهيستيدين. يتم تركيز الجزء الذي يحتوي على مركب RC-LH114-W إلى حوالي 10 مل في خزان محرك مزود بمرشح Amicon 100,000 MWCO (Merck، المملكة المتحدة)، ويتم تخفيفه 20 مرة باستخدام محلول الربط، ثم يضاف إلى 25 مل في عمود DEAE Sepharose، ويتم استخدام أربعة CVs مرتبطة بالمحلول مسبقًا. اغسل العمود بأربعة محاليل ربط CV، ثم قم بفصل المركب على ثمانية CVs على تدرج خطي من 0 إلى 100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم (في محلول الربط)، والأربعة CVs المتبقية التي تحتوي على 100 ملي مولار من محلول الربط. تم تركيز المركبات المتبقية التي تم فصلها على كلوريد الصوديوم مع نسبة A880/A280 أعلى من 2.4 ونسبة A880/A805 أعلى من 4.6 إلى حوالي 2 مل في مرشح طرد مركزي Amicon 100,000 MWCO، وملؤه بـ 1.5 CV IMAC في عمود استبعاد الحجم Superdex 200 16/600 المتوازن مسبقًا بالمحلول، ثم تم فصلها في نفس المحلول على مدى 1.5 CV. قم بجمع أطياف الامتصاص لأجزاء الاستبعاد الحجمي وقم بتركيز أطياف الامتصاص بنسب A880/A280 التي تزيد عن 2.1 ونسب A880/A805 التي تزيد عن 4.6 إلى 100 A880، والتي يتم استخدامها على الفور لإعداد شبكة TEM المجمدة أو تخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الحاجة إليها.
استُخدم مُجمد غمر من نوع Leica EM GP لتحضير شبكات المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) ذات درجة الحرارة المنخفضة. خُفف المركب في محلول IMAC إلى امتصاص ضوئي عند 880 نانومتر بقيمة 50، ثم وُضع 5 ميكرولتر منه على شبكة نحاسية مطلية بالكربون من نوع QUANTIFOIL 1.2/1.3 (Agar Scientific، المملكة المتحدة) بعد تفريغها بالغاز. حُضنت الشبكة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية ورطوبة نسبية 60% لمدة 30 ثانية، ثم جُففت لمدة 3 ثوانٍ، ثم غُمرت في الإيثان السائل عند درجة حرارة -176 درجة مئوية.
تم تسجيل بيانات مُركّب RC-LH114-W على جهاز eBIC (مركز التصوير الحيوي الإلكتروني) (مصدر الضوء الماسي البريطاني) باستخدام مجهر Titan Krios، الذي يعمل بجهد تسريع 300 كيلو فولت، وتكبير اسمي 130,000 ضعف، وطاقة فاصلة قدرها 20 إلكترون فولت. استُخدم جهاز Gatan 968 GIF Quantum مزودًا بكاشف ذروة K2 لتسجيل الصور في وضع العد لجمع البيانات. يبلغ حجم البكسل المُعاير 1.048 أنغستروم، ومعدل الجرعة 3.83 إلكترون/أنغستروم.ثانية. جُمع الفيلم في 11 ثانية وقُسّم إلى 40 جزءًا. استُخدمت المنطقة المطلية بالكربون لإعادة ضبط بؤرة المجهر، ثم جُمعت ثلاثة أفلام لكل فتحة. في المجمل، جُمع 3130 فيلمًا، بقيم انحراف بؤري تتراوح بين -1 و-3 ميكرومتر.
جُمعت بيانات مُركّب RC-LH116 باستخدام المجهر نفسه في مختبر أستربوري للبنية الحيوية (جامعة ليدز، المملكة المتحدة). جُمعت البيانات في وضع العدّ بتكبير 130 ألف مرة، وضُبط حجم البكسل على 1.065 أنغستروم بجرعة 4.6 إلكترون/أنغستروم.ثانية. سُجّل الفيلم في 12 ثانية وقُسّم إلى 48 جزءًا. في المجمل، جُمع 3359 فيلمًا، بقيم انحراف بؤري تتراوح بين -1 و-3 ميكرومتر.
تُجرى جميع عمليات معالجة البيانات في برنامج Relion 3.0 (42). يُستخدم برنامج Motioncorr 2 (43) لتصحيح حركة الشعاع عن طريق ترجيح الجرعة، ثم يُستخدم برنامج CTFFIND 4.1 (44) لتحديد مُعامل CTF (دالة نقل التباين). تُظهر الصورة المجهرية النموذجية بعد مراحل المعالجة الأولية هذه في الشكل 2. S16. يتم إنشاء قالب التحديد التلقائي عن طريق اختيار حوالي 250 بكسل يدويًا من بين 1000 جسيم في إطار مكون من 250 بكسل، دون أي تصنيف ثنائي الأبعاد مرجعي، وبالتالي رفض التصنيفات التي تُشير إلى تلوث العينة أو التي لا تحتوي على خصائص مميزة. بعد ذلك، تم إجراء التحديد التلقائي على جميع الصور المجهرية، وبلغ عدد جسيمات RC-LH114-W 849,359 جسيمًا، بينما بلغ عدد جسيمات مُركب RC-LH116 476,547 جسيمًا. خضعت جميع الجسيمات المختارة لجولتين من التصنيف ثنائي الأبعاد بدون مرجع، وبعد كل جولة، تم استبعاد الجسيمات التي تحتوي على منطقة كربون، أو تلوث العينة، أو التي لا تتميز بخصائص واضحة، أو التي تتداخل بشكل كبير، مما أسفر عن استخدام 772,033 جسيمًا (90.9%) و359,678 جسيمًا (75.5%) للتصنيف ثلاثي الأبعاد لـ RC-LH114-W وRC-LH116 على التوالي. تم إنشاء النموذج المرجعي ثلاثي الأبعاد الأولي باستخدام طريقة التدرج العشوائي. وباستخدام هذا النموذج كمرجع، تم تصنيف الجسيمات المختارة إلى أربع فئات ثلاثية الأبعاد. وباستخدام النموذج في هذه الفئة كمرجع، تم إجراء تحسين ثلاثي الأبعاد على الجسيمات في الفئة الأكبر، ثم استخدام مرشح تمرير منخفض أولي بتردد 15 أنغستروم لتغطية منطقة المذيب، وإضافة 6 بكسلات لحواف ناعمة، ومعالجة البكسلات لاحقًا لتصحيح دالة نقل تعديل ذروة Gatan K2 للكاشف العلوي. بالنسبة لمجموعة بيانات RC-LH114-W، تم تعديل النموذج الأولي بإزالة الكثافة العالية عند حواف القناع (المنفصلة عن كثافة المركب الأساسي في برنامج UCSF Chimera). استُخدمت النماذج الناتجة (بدقة 3.91 أنغستروم لـ RC-LH114-W و4.16 أنغستروم لـ RC-LH116) كمرجع للجولة الثانية من التصنيف ثلاثي الأبعاد. جُمعت الجسيمات المستخدمة في الفئة ثلاثية الأبعاد الأولية، ولم تُظهر ارتباطًا قويًا مع الجوار، أو تداخلًا، أو غيابًا لخصائص هيكلية واضحة. بعد الجولة الثانية من التصنيف ثلاثي الأبعاد، تم اختيار الفئة ذات الدقة الأعلى [بالنسبة لـ RC-LH114-W، تتكون فئة واحدة من 377,703 جسيمًا (44.5%)، وبالنسبة لـ RC-LH116، توجد فئتان، بإجمالي 260,752 جسيمًا (54.7%)، حيث تتطابقان فقط عند محاذاتهما بعد الدوران الأولي مع اختلاف طفيف]. تُعاد استخلاص الجسيمات المختارة في صندوق بحجم 400 بكسل، ثم تُحسّن باستخدام تقنية التحسين ثلاثي الأبعاد. يُنشأ قناع المذيب باستخدام مرشح تمرير منخفض أولي بتردد 15 أنغستروم، وتوسيع الخريطة بمقدار 3 بكسل، وقناع ناعم بمقدار 3 بكسل. بعد كل خطوة، تُجرى عمليات تحسين CTF لكل جسيم، وتصحيح حركة كل جسيم، والجولة الثانية من تحسين CTF لكل جسيم، والتحسين ثلاثي الأبعاد، وقناع المذيب، والمعالجة اللاحقة، وذلك لزيادة تحسين النسيج الناتج. باستخدام قيمة قطع معامل ارتباط غلاف فورييه (FSC) البالغة 0.143، تبلغ دقة النموذجين النهائيين لـ RC-LH114-W وRC-LH116 2.65 و2.80 أنغستروم على التوالي. يظهر منحنى FSC للنموذج النهائي في الشكل 2. S17.
تم تنزيل جميع تسلسلات البروتينات من قاعدة بيانات UniProtKB: LH1-β (PufB؛ معرف UniProt: Q6N9L5)؛ LH1-α (PufA؛ معرف UniProt: Q6N9L4)؛ RC-L (PufL؛ معرف UniProt: O83005)؛ RC-M (PufM؛ معرف UniProt: A0A4Z7)؛ RC-H (PufA؛ معرف UniProt: A0A4Z9)؛ البروتين W (PufW؛ معرف UniProt: Q6N1K3). استُخدم برنامج SWISS-MODEL (45) لإنشاء نموذج تماثلي لـ RC، والذي يحتوي على تسلسلات البروتينات RC-L وRC-M وRC-H، كما استُخدم التركيب البلوري لـ Rba. sphaeroides RC كقالب (معرف PDB: 5LSE) (46). استخدم أداة "fit map" في برنامج UCSF Chimera لمطابقة النموذج المُنشأ مع الخريطة (47)، وتحسين بنية البروتين، وإضافة العوامل المساعدة [4×BChl a (اسم بقايا مكتبة المونومر = BCL)، و2×BPh a (BPH)، ونوع واحد أو نوعين من UQ10 (U10)، وذرة حديد غير هيمية واحدة (Fe)، و3،4-ثنائي هيدروهيكساكربونيل كولين واحد (QAK)] باستخدام برنامج Coot (48). ولأن QAK غير متوفر في مكتبة المونومر، فقد تمت معايرته باستخدام أداة eLBOW في برنامج PHENIX (49).
بعد ذلك، تم بناء الوحدة الفرعية LH1. في البداية، استُخدمت أداة البناء التلقائي في برنامج PHENIX (49) لبناء جزء من تسلسل LH1 تلقائيًا باستخدام الخريطة وتسلسلات بروتين LH1-α وLH1-β كمدخلات. تم اختيار الوحدة الفرعية LH1 الأكثر اكتمالًا، واستخراجها وتحميلها في برنامج Coot، وإضافة التسلسل الناقص إليها يدويًا، وتحسين البنية بالكامل يدويًا قبل إضافة اثنين من جزيء BCL (BCL) وجزيء سبيريلوكسانثين (CRT) [وفقًا لكثافة معقد LH1 ذات الصلة ومحتوى الكاروتينويد المعروف. الأنواع (17)]. تم نسخ الوحدة الفرعية LH1 الكاملة، واستخدام أداة "خريطة الإرساء" في برنامج UCSF Chimera لإرساء الوحدة في المنطقة غير النموذجية المجاورة لكثافة LH1، ثم تحسينها في برنامج Coot؛ وتكرر العملية حتى يتم نمذجة جميع الوحدات الفرعية LH1. بالنسبة لبنية RC-LH114-W، يتم استخراج الكثافة غير المخصصة في برنامج Coot، ثم يُفصل البروتين عن المكونات غير البروتينية المتبقية في خريطة USCF Chimera، وتُستخدم أداة Autobuild لإنشاء النموذج الأولي، ونمذجة الوحدات الفرعية المتبقية (بروتين W) في برنامج PHENIX (49). تُضاف أي تسلسلات مفقودة إلى النموذج الناتج في برنامج Coot (48)، ثم تُحسّن الوحدة الفرعية بالكامل يدويًا. تتناسب الكثافة غير المخصصة المتبقية مع مزيج من الدهون (معرف مكتبة مونومر PDB: CDL = CDL، POPC = 6PL، وPOPG = PGT)، ومنظف β-DDM (LMT)، وجزيئات UQ10 (U10). يُستخدم تحسين PHENIX (49) والتحسين اليدوي في Coot (48) لتحسين النموذج الأولي بالكامل إلى أن يتعذر تحسين إحصائيات النموذج وجودة المطابقة المرئية. وأخيرًا، استخدم LocScale (50) لتحسين الخريطة المحلية، ثم قم بتنفيذ عدة دورات أخرى من نمذجة الكثافة غير المخصصة والتحسين التلقائي واليدوي.
تُظهر الأشكال 1 و2 الببتيدات والعوامل المساعدة والدهون والكينونات الأخرى المرتبطة بكثافاتها الخاصة. من S18 إلى S23. وتُعرض المعلومات الإحصائية للنموذج النهائي في الجدول S1.
ما لم يُذكر خلاف ذلك، تم جمع أطياف الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية/المرئية/الأشعة تحت الحمراء القريبة على جهاز قياس الطيف الضوئي Cary60 (Agilent، الولايات المتحدة الأمريكية) على فترات 1 نانومتر من 250 نانومتر إلى 1000 نانومتر ووقت تكامل قدره 0.1 ثانية.
قم بتخفيف العينة في خلية كوارتز ذات مسار ضوئي 2 مم حتى يصل امتصاصها عند 880 نانومتر إلى 1، ثم قم بتسجيل طيف الامتصاص بين 400 و1000 نانومتر. تم تسجيل أطياف الاستقطاب الدائري باستخدام مطياف الاستقطاب Jasco 810 (Jasco، اليابان) بفواصل 1 نانومتر بين 400 و950 نانومتر بمعدل مسح 20 نانومتر/دقيقة.
يُحدد معامل الامتصاص المولي بتخفيف المركب الأساسي إلى امتصاص عند 880 نانومتر (A880) يُقارب 50. يُخفف حجم 10 ميكرولتر في 990 ميكرولتر من محلول الربط أو الميثانول، ويُسجل طيف الامتصاص فورًا لتقليل تحلل الكلوروفيل البكتيري (BChl). حُسب محتوى الكلوروفيل البكتيري في كل عينة ميثانول باستخدام معامل الامتصاص عند 771 نانومتر، والذي يساوي 54.8 ملي مول⁻¹ سم⁻¹، وتم تحديد معامل الامتصاص (51). يُقسم تركيز الكلوروفيل البكتيري المقاس على 32 (RC-LH114-W) أو 36 (RC-LH116) لتحديد تركيز المركب الأساسي، والذي يُستخدم بعد ذلك لتحديد طيف امتصاص العينة نفسها المجمعة في محلول الربط. أُجريت ثلاث قياسات متكررة لكل عينة، واستُخدم متوسط ​​امتصاص ذروة الكلوروفيل البكتيري (Qy) في الحساب. معامل الامتصاص لـ RC-LH114-W المقاس عند 878 نانومتر هو 3280±140 ملي مول-1 سم-1، بينما معامل الامتصاص لـ RC-LH116 المقاس عند 880 نانومتر هو 3800±30 ملي مول-1 سم-1.
تم تحديد كمية UQ10 وفقًا للطريقة المذكورة في (52). باختصار، أُجري فصل كروماتوغرافي سائل عالي الأداء ذو ​​طور عكسي (RP-HPLC) باستخدام نظام Agilent 1200 HPLC. يُذاب حوالي 0.02 نانومول من RC-LH116 أو RC-LH114-W في 50 ميكرولتر من خليط الميثانول والكلوروفورم بنسبة 50:50 يحتوي على 0.02% (وزن/حجم) من كلوريد الحديديك، ويُحقن في عمود Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 مم المُعاير مسبقًا بمعدل 1 مل/دقيقة عند 40 درجة مئوية في مذيب HPLC (80:20 ميثانول:2-بروبانول) على عمود بطول 25 سم. يُجرى فصل متساوي التركيز في مذيب HPLC لمراقبة الامتصاص عند 275 نانومتر (UQ10)، و450 نانومتر (الكاروتينات)، و780 نانومتر (BChl) لمدة ساعة واحدة. تم حساب مساحة الذروة في مخطط الكروماتوغرافيا عند 275 نانومتر عند 25.5 دقيقة، والتي لم تحتوي على أي مركبات أخرى قابلة للكشف. استُخدمت المساحة المُحسوبة لحساب الكمية المولية لـ UQ10 المستخلصة بالرجوع إلى منحنى المعايرة المحسوب من حقن معايير نقية بتراكيز تتراوح من 0 إلى 5.8 نانومول (الشكل S14). تم تحليل كل عينة بثلاثة تكرارات، والخطأ المذكور يُمثل الانحراف المعياري للمتوسط.
تم تحضير محلول يحتوي على مُركّب RC-LH1 ذي امتصاص Qy أقصى قدره 0.1 باستخدام 30 ميكرومول من سيتوكروم c2 المُختزل من قلب الحصان (ميرك، المملكة المتحدة) وتركيزات تتراوح من 0 إلى 50 ميكرومول من UQ2 (ميرك، المملكة المتحدة). تم تحضير ثلاث عينات بحجم 1 مل لكل تركيز من UQ2، وحُضنت طوال الليل في الظلام عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لضمان التكيف الكامل مع الظلام قبل القياس. وُضع المحلول في مطياف ضوئي معياري OLIS RSM1000 مزود بشبكة حيود ذات لهب 300 نانومتر/خط 500 نانومتر، وفتحات دخول 1.24 مم، وفتحة وسطى 0.12 مم، وفتحة خروج 0.6 مم. وُضع مرشح تمرير طويل بطول موجي 600 نانومتر عند مدخل أنبوب العينة الضوئي وأنبوب المضاعف الضوئي المرجعي لاستبعاد ضوء الإثارة. تمت مراقبة الامتصاص عند 550 نانومتر بزمن تكامل 0.15 ثانية. يُصدر ضوء الإثارة من صمام ثنائي باعث للضوء M880F2 (من شركة Thorlabs Ltd.، المملكة المتحدة) بطول موجي 880 نانومتر، عبر كابل ألياف بصرية بكثافة 90%، من خلال وحدة تحكم DC2200 (من شركة Thorlabs Ltd.، المملكة المتحدة)، ويُوجّه إلى مصدر الضوء بزاوية 90 درجة. يُوجّه شعاع القياس عكس المرآة لإعادة أي ضوء لم يمتصه النموذج في البداية. تُراقَب قيمة الامتصاص لمدة 10 ثوانٍ قبل بدء الإضاءة لمدة 50 ثانية. ثم تُراقَب قيمة الامتصاص لمدة 60 ثانية أخرى في الظلام لتقييم مدى اختزال الكينولول التلقائي للسيتوكروم c23+ (انظر الشكل S8 للبيانات الأولية).
تمت معالجة البيانات عن طريق حساب معدل أولي خطي خلال فترة تتراوح بين 0.5 و10 ثوانٍ (بحسب تركيز UQ2)، ثم حساب متوسط ​​معدلات جميع العينات الثلاث عند كل تركيز من UQ2. استُخدم تركيز RC-LH1، المحسوب باستخدام معامل الامتصاص الخاص به، لتحويل المعدل إلى كفاءة تحفيزية، ورُسمت النتائج باستخدام برنامج Origin Pro 2019 (OriginLab، الولايات المتحدة الأمريكية)، ووُفقت مع نموذج مايكليس-مينتين لتحديد قيم Km وKcat الظاهرية.
لإجراء قياسات الامتصاص العابر، تم تخفيف عينة RC-LH1 إلى تركيز 2 ميكرومول تقريبًا في محلول منظم IMAC يحتوي على 50 ملي مول من أسكوربات الصوديوم (ميرك، الولايات المتحدة الأمريكية) و0.4 ملي مول من تيربوتين (ميرك، الولايات المتحدة الأمريكية). يُستخدم حمض الأسكوربيك كمانح إلكترونات تضحوي، ويُستخدم ثالثي بوتاكلوفين كمثبط لـ QB لضمان بقاء مانح RC الرئيسي مختزلًا (أي غير مؤكسد ضوئيًا) طوال عملية القياس. يُضاف حوالي 3 مل من العينة إلى خلية دوارة مصممة خصيصًا (قطرها حوالي 0.1 متر، وسرعتها 350 دورة في الدقيقة) بطول مسار بصري 2 مم لضمان حصول العينة الموجودة في مسار الليزر على وقت كافٍ للتكيف مع الظلام بين نبضات الإثارة. استُخدمت نبضات ليزرية مدتها حوالي 100 فيمتوثانية لتضخيم نظام ليزر التيتانيوم: الياقوت (Spectra Physics، الولايات المتحدة الأمريكية) لإثارة العينة عند 880 نانومتر بمعدل تكرار 1 كيلوهرتز (20 نانو جول للأشعة تحت الحمراء القريبة أو 100 نانو جول للضوء المرئي). قبل جمع البيانات، عُرِّضت العينة لضوء الإثارة لمدة 30 دقيقة تقريبًا. سيؤدي التعريض إلى تعطيل QA (ربما تقليل QA مرة أو مرتين). ولكن يُرجى ملاحظة أن هذه العملية قابلة للعكس، لأنه بعد فترة طويلة من التكيف مع الظلام، سيعود RC ببطء إلى نشاط QA. استُخدم مطياف هيليوس (Ultrafast Systems، الولايات المتحدة الأمريكية) لقياس الأطياف العابرة بزمن تأخير من -10 إلى 7000 بيكوثانية. استُخدم برنامج Surface Xplorer (Ultrafast Systems، الولايات المتحدة الأمريكية) لفك تجميع مجموعات البيانات، ثم دمجها وتوحيدها. استخدم حزمة برامج CarpetView (شركة Light Conversion Ltd.، ليتوانيا) لاستخدام مجموعة البيانات المدمجة للحصول على أطياف تفاضلية متعلقة بالانحلال، أو استخدم دالة تقوم بدمج أسس متعددة مع استجابة الجهاز لتناسب التطور الطيفي أحادي الطول الموجي في Origin (OriginLab، الولايات المتحدة الأمريكية).
كما ذُكر سابقًا (53)، تم تحضير غشاء ضوئي يحتوي على مُركّب LH1 يفتقر إلى كلٍّ من مركز التفاعل (RC) وهوائي LH2 المحيطي. خُفِّف الغشاء في محلول تريس بتركيز 20 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 8.0)، ثم وُضِع في خلية كوارتز ذات مسار بصري 2 مم. استُخدمت نبضة ليزرية بقوة 30 نانو جول لإثارة العينة عند طول موجي 540 نانومتر، مع زمن تأخير يتراوح بين -10 و7000 بيكو ثانية. عُولِجت مجموعة البيانات كما هو موضح لعينة Rps. pal.
تم ترسيب الغشاء بالطرد المركزي عند قوة طرد مركزي نسبية 150,000 لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، ثم أُعيد تعليقه في محلول من 20 ملي مولار من Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 8.0) و200 ملي مولار من كلوريد الصوديوم. أُذيب الغشاء بالتحريك البطيء في محلول β-DDM بتركيز 2% (وزن/حجم) لمدة ساعة واحدة في الظلام عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. خُففت العينة في محلول كربونات ثلاثي إيثيل الأمونيوم بتركيز 100 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 8.0) (TEAB؛ شركة ميرك، المملكة المتحدة) ليصل تركيز البروتين إلى 2.5 ملغم/مل (تحليل Bio-Rad). أُجريت المعالجة اللاحقة وفقًا للطريقة المنشورة سابقًا (54)، بدءًا بتخفيف 50 ميكروغرام من البروتين في 50 ميكرولتر من محلول TEAB يحتوي على 1% (وزن/حجم) من لورات الصوديوم (شركة ميرك، المملكة المتحدة). بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 60 ثانية، تم اختزال العينة باستخدام 5 ملي مول من ثلاثي (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (ميرك، المملكة المتحدة) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ولعملية الألكلة الكبريتية، تم تحضين العينة مع 10 ملي مول من ميثيل إس-ميثيل ثيوميثان سلفونات (ميرك، المملكة المتحدة) وإضافته من محلول مخزون إيزوبروبانول بتركيز 200 ملي مول لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تم إجراء الهضم البروتيني بإضافة 2 ميكروغرام من خليط التربسين/إندو بروتينيز ليس-سي (بروميج، المملكة المتحدة) والتحضين عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. تم استخلاص المادة الفعالة السطحية من نوع لورات بإضافة 50 ميكرولتر من أسيتات الإيثيل و10 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) بنسبة 10% (حجم/حجم) من الدرجة المستخدمة في كروماتوغرافيا السائل (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، المملكة المتحدة) والخلط باستخدام جهاز الخلط الدوامي لمدة 60 ثانية. تم تعزيز فصل الطورين بالطرد المركزي عند قوة طرد مركزي نسبية تبلغ 15700 لمدة 5 دقائق. ووفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة، استُخدم عمود طرد مركزي C18 (Thermo Fisher Scientific، المملكة المتحدة) لسحب وإزالة الأملاح من الطور السفلي المحتوي على الببتيد بعناية. بعد التجفيف بالطرد المركزي الفراغي، أُذيبت العينة في محلول مكون من 0.5% من حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك و3% من الأسيتونيتريل، ثم حُلِّل 500 نانوغرام منها باستخدام كروماتوغرافيا الطور العكسي النانوية المقترنة بقياس الطيف الكتلي، وذلك باستخدام معايير النظام الموضحة سابقًا.
استخدم برنامج MaxQuant الإصدار 1.5.3.30 (56) لتحديد البروتينات وقياس كميتها، وذلك للبحث في قاعدة بيانات بروتينات Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). وقد تم إيداع بيانات البروتينات المُستخلصة بتقنية قياس الطيف الكتلي في تحالف ProteomeXchange Alliance من خلال مستودع PRIDE الشريك (http://proteomecentral.proteomexchange.org) تحت مُعرّف مجموعة البيانات PXD020402.
لتحليل معقد RC-LH1 باستخدام تقنية الاستشراب السائل العكسي الطور المقترن بقياس الطيف الكتلي بتقنية التأين بالرذاذ الإلكتروني، تم تحضيره من بروتينات Rps من النوع البري. وباستخدام الطريقة المنشورة سابقًا (16)، بلغ تركيز البروتين المُنتَج في خلايا palustris 2 ملغم/مل في محلول مكون من 20 ملي مولار هيبس (الأس الهيدروجيني 7.8)، و100 ملي مولار كلوريد الصوديوم، و0.03% (وزن/حجم) من β-DDM (تحليل Bio-Rad). ووفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة، تم استخدام مجموعة تنقية ثنائية الأبعاد (GE Healthcare، الولايات المتحدة الأمريكية) لاستخلاص 10 ميكروغرام من البروتين بطريقة الترسيب، ثم إذابة الراسب في 20 ميكرولتر من محلول مكون من 60% (حجم/حجم) حمض الفورميك، و20% (حجم/حجم) أسيتونيتريل، و20% (حجم/حجم) ماء. تم تحليل خمسة ميكرولترات باستخدام تقنية الاستشراب السائل العكسي (Dionex RSLC) المقترنة بمطياف الكتلة (Maxis UHR-TOF، Bruker). استُخدم عمود MabPac 1.2×100 مم (Thermo Fisher Scientific، المملكة المتحدة) للفصل عند درجة حرارة 60 درجة مئوية ومعدل تدفق 100 ميكرولتر/دقيقة، مع تدرج من 85% (حجم/حجم) من المذيب A [0.1% (حجم/حجم) حمض الفورميك و0.02% (حجم/حجم) محلول مائي من حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك] إلى 85% (حجم/حجم) من المذيب B [0.1% (حجم/حجم) حمض الفورميك و0.02% (حجم/حجم) في 90% (حجم/حجم) أسيتونيتريل ثلاثي فلورو الأسيتيك]. باستخدام مصدر تأين بالرذاذ الإلكتروني القياسي والمعايير الافتراضية لأكثر من 60 دقيقة، حصل مطياف الكتلة على نطاق من 100 إلى 2750 m/z (نسبة الكتلة إلى الشحنة). بمساعدة أداة FindPept (https://web.expasy.org/findpept/) الخاصة ببوابة موارد المعلوماتية الحيوية ExPASy، قم برسم خريطة طيف الكتلة للوحدات الفرعية للمركب.
تمت زراعة الخلايا لمدة 72 ساعة تحت إضاءة منخفضة (10 ميكرومول/م² ثانية)، أو متوسطة (30 ميكرومول/م² ثانية)، أو عالية (300 ميكرومول/م² ثانية) في 100 مل من وسط NF. استُخدم وسط M22 (وسط M22 مُستغنى فيه عن كبريتات الأمونيوم واستُبدل سكسينات الصوديوم بأسيتات الصوديوم) في زجاجة ذات غطاء لولبي سعة 100 مل (23). في خمس دورات مدة كل منها 30 ثانية، تم وضع خرز زجاجي بقطر 0.1 ميكرون بنسبة حجمية 1:1 لتحليل الخلايا، ثم تم تبريدها على الجليد لمدة 5 دقائق. أُزيلت المواد غير الذائبة والخلايا غير المتكسرة والخرز الزجاجي بالطرد المركزي عند 16000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي دقيق مكتبي. تم فصل الغشاء في دوار Ti 70.1 بقوة 100000 RCF في 20 ملي مولار من tris-HCl (الأس الهيدروجيني 8.0) مع تدرج السكروز 40/15% (وزن/وزن) لمدة 10 ساعات.
كما هو موضح في دراستنا السابقة، تم الكشف المناعي عن علامة الهيستيدين على بروتين PufW (16). باختصار، تم استخدام المركب الأساسي المنقى (11.8 نانومتر) أو الغشاء الذي يحتوي على نفس تركيز RC (تم تحديده عن طريق الأكسدة، وطرح طيف الفرق المختزل، ومطابقة الحمل على الهلام المصبوغ) في محلول تحميل SDS 2x (شركة ميرك، المملكة المتحدة) مخفف مرتين. تم فصل البروتينات على هلام NuPage ثنائي التريس بنسبة 12% (شركة ثيرمو فيشر ساينتيفيك، المملكة المتحدة). تم تلوين الهلام بصبغة كوماسي الزرقاء اللامعة (شركة بيو-راد، المملكة المتحدة) لتحميل وتصوير الوحدة الفرعية RC-L. تم نقل البروتين الموجود على الهلام الثاني إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) المنشط بالميثانول (شركة ثيرمو فيشر ساينتيفيك، المملكة المتحدة) لإجراء الفحص المناعي. تم حجب غشاء PVDF في 50 مليمولار من tris-HCl (pH 7.6)، و150 مليمولار من NaCl، و0.2% (حجم/حجم) من Tween-20، و5% (وزن/حجم) من مسحوق الحليب منزوع الدسم، ثم تم تحضينه مع الجسم المضاد الأولي المضاد للهيستيدين (في محلول تخفيف الجسم المضاد [50 مليمولار من tris-HCl (pH 7.6)، و150 مليمولار من NaCl، و0.05% (حجم/حجم) من Tween-20] بنسبة 1:1000 A190-114A، مختبرات بيثيل، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 4 ساعات. بعد الغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق في محلول الأجسام المضادة، تم دمج الغشاء مع بيروكسيداز الفجل (Sigma-Aldrich، المملكة المتحدة) والأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر (مخففة بنسبة 1:10000 في محلول الأجسام المضادة). يتم التحضين للسماح بالكشف (5 دقائق بعد 3 غسلات في محلول الأجسام المضادة) باستخدام ركيزة التلألؤ الكيميائي WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen، إيطاليا) وجهاز Amersham Imager 600 (GE Healthcare، المملكة المتحدة).
من خلال رسم توزيع شدة كل هلام ملون أو مسار في اختبار المناعة، وحساب المساحة تحت الذروة، ونسبة شدة RC-L (الهلام الملون) إلى البروتين W (اختبار المناعة)، في برنامج ImageJ (57)، تتم معالجة الصورة. ثم تُحوّل هذه النسب إلى نسب مولية بافتراض أن نسبة RC-L إلى البروتين W في عينة RC-LH114-W النقية هي 1:1، وتطبيع مجموعة البيانات بأكملها وفقًا لذلك.
للاطلاع على المواد التكميلية لهذه المقالة، يرجى زيارة الرابط التالي: http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
هذه مقالة متاحة للجميع بموجب شروط رخصة المشاع الإبداعي (CC BY). تسمح المقالة بالاستخدام والتوزيع وإعادة الإنتاج غير المقيد في أي وسيلة إعلامية بشرط الإشارة إلى العمل الأصلي بشكل صحيح.
ملاحظة: نطلب منك فقط تزويدنا بعنوان بريدك الإلكتروني لكي يعلم الشخص الذي توصي به للصفحة أنك ترغب في أن يرى الرسالة وأنها ليست رسالة مزعجة. لن نقوم بتسجيل أي عناوين بريد إلكتروني.
يُستخدم هذا السؤال لاختبار ما إذا كنت زائرًا ولمنع إرسال الرسائل غير المرغوب فيها تلقائيًا.
ديفيد جيه كيه سوينسبري، بارك تشيان، فيليب جيه جاكسون، كايتلين إم فاريس، داريوس إم نيدزفيدزكي، إليزابيث سي مارتن، ديفيد إيه فارمر، لورنا إيه مالون، ريبيكا إف تومسون، نيل إيه رانسون، دانيال بي كانيف، مارك جيه ديكمان، ديوي هولتن، كريستين كيرماير، أندرو هيتشكوك، سي نيل هنتر
يوفر التركيب عالي الدقة لمركب مصيدة الضوء 1 في مركز التفاعل رؤى جديدة حول ديناميكيات الكينون.
ديفيد جيه كيه سوينسبري، بارك تشيان، فيليب جيه جاكسون، كايتلين إم فاريس، داريوس إم نيدزفيدزكي، إليزابيث سي مارتن، ديفيد إيه فارمر، لورنا إيه مالون، ريبيكا إف تومسون، نيل إيه رانسون، دانيال بي كانيف، مارك جيه ديكمان، ديوي هولتن، كريستين كيرماير، أندرو هيتشكوك، سي نيل هنتر
يوفر التركيب عالي الدقة لمركب مصيدة الضوء 1 في مركز التفاعل رؤى جديدة حول ديناميكيات الكينون.
©2021 الجمعية الأمريكية لتقدم العلوم. جميع الحقوق محفوظة. AAAS هي شريك لـ HINARI، وAGORA، وOARE، وCHORUS، وCLOCKSS، وCrossRef، وCOUNTER. تقدم العلوم ISSN 2375-2548.