تُعدّ هذه المقالة جزءًا من موضوع البحث "تقنيات المعالجة الحيوية المتقدمة وعمليات إعادة تدوير المركبات العضوية الاصطناعية". اطلع على جميع المقالات الـ 14
تُستخدم الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ذات الوزن الجزيئي المنخفض، مثل النفثالين ومشتقاته (ميثيل نفثالين، وحمض النفثويك، و1-نفثيل-N-ميثيل كاربامات، وغيرها)، على نطاق واسع في مختلف الصناعات، وهي مواد سامة جينياً، ومسببة للطفرات، و/أو مسرطنة للكائنات الحية. تُصنف هذه المركبات العضوية الاصطناعية، أو ما يُعرف بالمواد الغريبة بيولوجياً، ضمن الملوثات ذات الأولوية، وتشكل تهديداً خطيراً للبيئة العالمية والصحة العامة. وتحدد كثافة الأنشطة البشرية (مثل تغويز الفحم، وتكرير النفط، وانبعاثات المركبات، والتطبيقات الزراعية) تركيز هذه المركبات المنتشرة والمستمرة، ومصيرها، وانتقالها. وإلى جانب طرق المعالجة/الإزالة الفيزيائية والكيميائية، برزت تقنيات صديقة للبيئة، مثل المعالجة الحيوية، التي تستخدم الكائنات الدقيقة القادرة على تحليل الملوثات العضوية الجسيمية بشكل كامل أو تحويلها إلى منتجات ثانوية غير سامة، كبديل آمن وفعال من حيث التكلفة وواعد. أظهرت أنواع بكتيرية متنوعة تنتمي إلى شعبة البروتيوكتيريا (مثل Pseudomonas و Comamonas و Burkholderia و Neosphingobacterium)، وشعبة الفيرميكوتس (مثل Bacillus و Paenibacillus)، وشعبة الأكتينوبكتيريا (مثل Rhodococcus و Arthrobacter) في الميكروبات الموجودة في التربة، قدرتها على تحليل مركبات عضوية مختلفة. تساعدنا الدراسات الأيضية، وعلم الجينوم، وتحليل الميتاجينوم على فهم التعقيد والتنوع الأيضي الموجود في هذه الكائنات الحية البسيطة، والذي يمكن تطبيقه لاحقًا لتحسين التحلل البيولوجي. وقد أدى وجود الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAHs) لفترات طويلة إلى ظهور أنماط ظاهرية جديدة للتحلل من خلال النقل الأفقي للجينات باستخدام عناصر وراثية مثل البلازميدات، والترانسبوزونات، والعاثيات، والجزر الجينومية، وعناصر الاقتران التكاملية. يمكن لعلم الأحياء النظمي والهندسة الوراثية لعزلات محددة أو مجتمعات نموذجية (تجمعات) أن تُسهم في المعالجة الحيوية الشاملة والسريعة والفعالة لهذه الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات من خلال التأثيرات التآزرية. في هذه المراجعة، نركز على المسارات الأيضية المختلفة وتنوعها، والتركيب الجيني وتنوعه، والاستجابات/التكيفات الخلوية للبكتيريا المحللة للنفثالين ومشتقاته. سيوفر هذا معلومات بيئية للتطبيق الميداني وتحسين السلالات لتحقيق معالجة حيوية فعالة.
ساهم التطور السريع للصناعات (البتروكيماويات، والزراعة، والأدوية، وأصباغ المنسوجات، ومستحضرات التجميل، وغيرها) في الازدهار الاقتصادي العالمي وتحسين مستويات المعيشة. وقد أدى هذا التطور المتسارع إلى إنتاج عدد كبير من المركبات العضوية الاصطناعية، التي تُستخدم في تصنيع منتجات متنوعة. تشمل هذه المركبات الغريبة، أو المركبات العضوية الاصطناعية، الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات، والمبيدات الحشرية، ومبيدات الأعشاب، والملدنات، والأصباغ، والأدوية، والفوسفات العضوية، ومثبطات اللهب، والمذيبات العضوية المتطايرة، وغيرها. تُطلق هذه المركبات في الغلاف الجوي، والنظم البيئية المائية والبرية، حيث تُحدث تأثيرات متعددة الأبعاد، مُسببةً آثارًا ضارة على مختلف الكائنات الحية من خلال تغيير خصائصها الفيزيائية والكيميائية وبنية مجتمعاتها (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). تُلحق العديد من الملوثات العطرية أضرارًا بالغة ومدمرة بالعديد من النظم البيئية السليمة ومواقع التنوع البيولوجي الغنية (مثل الشعاب المرجانية، والصفائح الجليدية في القطبين الشمالي والجنوبي، وبحيرات الجبال العالية، ورواسب أعماق البحار، وغيرها) (جونز 2010؛ باير وآخرون 2020؛ نوردبورغ وآخرون 2020). وقد أظهرت دراسات جيولوجية دقيقة حديثة أن ترسب المواد العضوية الاصطناعية (مثل الملوثات العطرية) ومشتقاتها على أسطح المنشآت الاصطناعية (البيئة المبنية) (مثل مواقع التراث الثقافي والمعالم الأثرية المصنوعة من الجرانيت والحجر والخشب والمعادن) يُسرّع من تدهورها (جاد 2017؛ ليو وآخرون 2018). ويمكن للأنشطة البشرية أن تُفاقم التدهور البيولوجي للمعالم والمباني من خلال تلوث الهواء وتغير المناخ (ليو وآخرون 2020). تتفاعل هذه الملوثات العضوية مع بخار الماء في الغلاف الجوي وتترسب على المنشأة، مما يُسبب تدهورًا فيزيائيًا وكيميائيًا للمادة. يُعرف التحلل البيولوجي على نطاق واسع بأنه تغيرات غير مرغوب فيها في مظهر وخصائص المواد، ناجمة عن الكائنات الحية، مما يؤثر على حفظها (بوشون وجاتون، 1967). ويمكن أن يؤدي النشاط الميكروبي (الأيض) لهذه المركبات إلى تقليل السلامة الهيكلية، وفعالية الحفظ، والقيمة الثقافية (جاد، 2017؛ ليو وآخرون، 2018). من ناحية أخرى، في بعض الحالات، وُجد أن تكيف الميكروبات مع هذه الهياكل واستجابتها لها مفيد، حيث تُشكل أغشية حيوية وقشورًا واقية أخرى تُقلل من معدل التحلل (مارتينو، 2016). لذلك، يتطلب تطوير استراتيجيات فعالة ومستدامة طويلة الأجل لحفظ الآثار الحجرية والمعدنية والخشبية فهمًا دقيقًا للعمليات الرئيسية المُتضمنة في هذه العملية. بالمقارنة مع العمليات الطبيعية (العمليات الجيولوجية، حرائق الغابات، الانفجارات البركانية، تفاعلات النباتات والبكتيريا)، تُؤدي الأنشطة البشرية إلى إطلاق كميات كبيرة من الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAHs) وغيرها من الكربون العضوي (OC) في النظم البيئية. تُعدّ العديد من الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات المستخدمة في الزراعة (المبيدات الحشرية ومبيدات الآفات مثل DDT، والأترازين، والكاربارييل، والبنتكلوروفينول، وغيرها)، والصناعة (النفط الخام، ومخلفات النفط، والبلاستيك المشتق من البترول، ومركبات ثنائي الفينيل متعدد الكلور، والملدنات، والمنظفات، والمطهرات، والمبيدات الدخانية، والعطور، والمواد الحافظة)، ومنتجات العناية الشخصية (واقيات الشمس، والمطهرات، وطاردات الحشرات، والمسك متعدد الحلقات)، والذخائر (المتفجرات مثل 2,4,6-TNT) مواد غريبة عن البيئة قد تؤثر على صحة الكوكب (Srogi، 2007؛ Vamsee-Krishna وPhale، 2008؛ Petrie وآخرون، 2015). ويمكن توسيع هذه القائمة لتشمل المركبات المشتقة من البترول (زيوت الوقود، ومواد التشحيم، والأسفلتينات)، والبلاستيك الحيوي ذي الوزن الجزيئي العالي، والسوائل الأيونية (Amde وآخرون، 2015). يُبين الجدول 1 مجموعة متنوعة من الملوثات العطرية واستخداماتها في مختلف الصناعات. في السنوات الأخيرة، بدأت الانبعاثات البشرية المنشأ للمركبات العضوية المتطايرة، بالإضافة إلى ثاني أكسيد الكربون وغيره من غازات الدفيئة، في الازدياد (دفوراك وآخرون، 2017). ومع ذلك، فإن التأثيرات البشرية المنشأ تتجاوز التأثيرات الطبيعية بشكل ملحوظ. علاوة على ذلك، وجدنا أن عددًا من المركبات العضوية شبه المتطايرة تستمر في العديد من البيئات، وقد تم تحديدها كملوثات ناشئة ذات آثار ضارة على النظم البيئية (الشكل 1). وقد أدرجت الوكالات البيئية، مثل وكالة حماية البيئة الأمريكية، العديد من هذه الملوثات في قائمة أولوياتها نظرًا لخصائصها السامة للخلايا، والسامة للجينات، والمسببة للطفرات، والمسرطنة. لذلك، ثمة حاجة إلى لوائح صارمة للتخلص من النفايات واستراتيجيات فعالة لمعالجة النفايات وإزالتها من النظم البيئية الملوثة. إن طرق المعالجة الفيزيائية والكيميائية المختلفة، مثل التحلل الحراري، والمعالجة الحرارية التأكسدية، والتهوية الهوائية، والدفن، والحرق، وغيرها، غير فعالة ومكلفة، وتُنتج منتجات ثانوية أكالة وسامة ويصعب معالجتها. مع تزايد الوعي البيئي العالمي، تحظى الكائنات الدقيقة القادرة على تحليل هذه الملوثات ومشتقاتها (مثل الهالوجينات، والنيترو، والألكيل، والميثيل) باهتمام متزايد (فينيل وآخرون، 2004؛ هاريتاش وكوشيك، 2009؛ فال وآخرون، 2020؛ ساركار وآخرون، 2020؛ شوانيمان وآخرون، 2020). ويُعدّ استخدام هذه الكائنات الدقيقة المحلية، منفردةً أو في مزارع مختلطة (مستعمرات)، لإزالة الملوثات العطرية ذا مزايا من حيث السلامة البيئية، والتكلفة، والكفاءة، والفعالية، والاستدامة. كما يستكشف الباحثون دمج العمليات الميكروبية مع طرق الأكسدة والاختزال الكهروكيميائية، وتحديدًا الأنظمة الكهروكيميائية الحيوية، كتقنية واعدة لمعالجة الملوثات وإزالتها (هوانغ وآخرون، 2011). حظيت تقنية أنظمة الطاقة الكهروكيميائية الحيوية (BES) باهتمام متزايد نظرًا لكفاءتها العالية، وتكلفتها المنخفضة، وسلامتها البيئية، وإمكانية تشغيلها في درجة حرارة الغرفة، واستخدامها مواد متوافقة حيويًا، وقدرتها على استخلاص منتجات ثانوية قيّمة (مثل الكهرباء والوقود والمواد الكيميائية) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). وقد أتاح ظهور تقنيات التسلسل الجيني عالي الإنتاجية وأدوات/أساليب علم الجينوم (omics) كمًا هائلًا من المعلومات الجديدة حول التنظيم الجيني، وعلم البروتينات، وعلم تدفق التفاعلات في مختلف الكائنات الحية الدقيقة المحللة. وقد ساهم دمج هذه الأدوات مع علم الأحياء النظمي في تعزيز فهمنا لاختيار مسارات الهدم المستهدفة وضبطها بدقة في الكائنات الحية الدقيقة (أي التصميم الأيضي) لتحقيق تحلل حيوي فعال وكفؤ. ولتصميم استراتيجيات فعالة للمعالجة الحيوية باستخدام كائنات حية دقيقة مرشحة مناسبة، نحتاج إلى فهم الإمكانات البيوكيميائية، والتنوع الأيضي، والتركيب الجيني، والبيئة (البيئة الذاتية/البيئة الجماعية) لهذه الكائنات.
الشكل 1. مصادر ومسارات الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ذات الوزن الجزيئي المنخفض عبر بيئات بيئية متنوعة وعوامل مختلفة تؤثر على الكائنات الحية. تمثل الخطوط المتقطعة التفاعلات بين عناصر النظام البيئي.
في هذه المراجعة، حاولنا تلخيص البيانات المتعلقة بتحلل الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات البسيطة، مثل النفثالين ومشتقاته، بواسطة عزلات بكتيرية متنوعة، مُغطّين المسارات الأيضية وتنوعها، والإنزيمات المشاركة في التحلل، وتركيب/محتوى الجينات وتنوعها، والاستجابات الخلوية، وجوانب مختلفة من المعالجة الحيوية. إن فهم المستويات البيوكيميائية والجزيئية سيساعد في تحديد السلالات المضيفة المناسبة وهندستها الوراثية لاحقًا لتحقيق معالجة حيوية فعّالة لهذه الملوثات ذات الأولوية. وهذا بدوره سيساعد في تطوير استراتيجيات لإنشاء تجمعات بكتيرية مُخصصة لمواقع محددة لتحقيق معالجة حيوية فعّالة.
يشكل وجود عدد كبير من المركبات العطرية السامة والخطرة (التي تحقق قاعدة هوكل 4n + 2π إلكترون، حيث n = 1، 2، 3، ...) تهديدًا خطيرًا لمختلف الوسائط البيئية كالهواء والتربة والرواسب والمياه السطحية والجوفية (بوجليسي وآخرون، 2007). تحتوي هذه المركبات على حلقات بنزين مفردة (أحادية الحلقة) أو حلقات بنزين متعددة (متعددة الحلقات) مرتبة بشكل خطي أو زاوي أو عنقودي، وتُظهر استقرارًا (استقرارًا/عدم استقرار) في البيئة نظرًا لطاقة الرنين السالبة العالية وخمولًا (خمولًا)، وهو ما يُعزى إلى كرهها للماء وحالتها المختزلة. عند استبدال الحلقة العطرية بمجموعات الميثيل (-CH3) أو الكربوكسيل (-COOH) أو الهيدروكسيل (-OH) أو السلفونات (-HSO3)، تصبح أكثر استقرارًا، وتزداد ألفتها للجزيئات الكبيرة، وتتراكم حيويًا في الأنظمة البيولوجية (سيو وآخرون، 2009؛ فال وآخرون، 2020). وقد أدرجت وكالة حماية البيئة الأمريكية بعض الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ذات الوزن الجزيئي المنخفض، مثل النفثالين ومشتقاته [ميثيل نفثالين، وحمض النفثويك، ونفثالين سلفونات، و1-نفثيل N-ميثيل كاربامات (كارباريل)]، ضمن قائمة الملوثات العضوية ذات الأولوية باعتبارها سامة جينيًا، ومسببة للطفرات، و/أو مسرطنة (سيرنيجليا، 1984). قد يؤدي إطلاق هذه الفئة من المركبات العضوية العطرية متعددة الحلقات غير الميثانية في البيئة إلى التراكم الحيوي لهذه المركبات على جميع مستويات السلسلة الغذائية، مما يؤثر على صحة النظم البيئية (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
تنتقل الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAHs) إلى الكائنات الحية بشكل أساسي عبر الهجرة والتفاعلات بين مكونات النظام البيئي المختلفة، مثل التربة والمياه الجوفية والمياه السطحية والمحاصيل والغلاف الجوي (آري وأتكينسون، 2003). يوضح الشكل 1 تفاعلات وتوزيع أنواع مختلفة من الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ذات الوزن الجزيئي المنخفض في النظم البيئية، ومساراتها المؤدية إلى تعرض الكائنات الحية/الإنسان لها. تترسب هذه الهيدروكربونات على الأسطح نتيجة لتلوث الهواء، وعبر هجرة (انجراف) انبعاثات المركبات، وغازات العادم الصناعية (مثل تغويز الفحم واحتراقه وإنتاج فحم الكوك)، وترسبها. وتُعد الأنشطة الصناعية، مثل صناعة المنسوجات الاصطناعية والأصباغ والدهانات، وحفظ الأخشاب، ومعالجة المطاط، وصناعة الإسمنت، وإنتاج المبيدات، والتطبيقات الزراعية، مصادر رئيسية للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات في النظم الأرضية والمائية (بامفورث وسينغلتون، 2005؛ ويك وآخرون، 2011). أظهرت الدراسات أن التربة في المناطق شبه الحضرية والحضرية، وبالقرب من الطرق السريعة، وفي المدن الكبرى، أكثر عرضة للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAHs) نتيجةً لانبعاثات محطات توليد الطاقة، والتدفئة المنزلية، وحركة المرور الجوية والبرية، وأنشطة البناء (سومن وآخرون، 2016). وأظهرت دراسة (2008) أن تركيز الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات في التربة قرب الطرق في نيو أورليانز، لويزيانا، الولايات المتحدة الأمريكية، بلغ 7189 ميكروغرام/كيلوغرام، بينما لم يتجاوز 2404 ميكروغرام/كيلوغرام في المناطق المفتوحة. وبالمثل، سُجّلت مستويات من الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات تصل إلى 300 ميكروغرام/كيلوغرام في مناطق قريبة من مواقع تغويز الفحم في العديد من المدن الأمريكية (كانالي وهاراياما، 2000؛ بامفورث وسينغلتون، 2005). أُفيد أن تربة مدن هندية مختلفة، مثل دلهي (شارما وآخرون، 2008)، وأغرا (دوبي وآخرون، 2014)، ومومباي (كولكارني وفينكاتارامان، 2000)، وفيساخاباتنام (كولكارني وآخرون، 2014)، تحتوي على تركيزات عالية من الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات. تُمتص المركبات العطرية بسهولة أكبر على جزيئات التربة والمواد العضوية والمعادن الطينية، مما يجعلها مصارف رئيسية للكربون في النظم البيئية (سروجي، 2007؛ بينغ وآخرون، 2008). وتشمل المصادر الرئيسية للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات في النظم البيئية المائية: هطول الأمطار (الرطب والجاف وبخار الماء)، والجريان السطحي الحضري، وتصريف مياه الصرف الصحي، وتغذية المياه الجوفية، وغيرها (سروجي، 2007). تشير التقديرات إلى أن حوالي 80% من الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات في النظم البيئية البحرية مصدرها هطول الأمطار والترسبات وتصريف النفايات (موتيلاي-ماسي وآخرون، 2006؛ سروجي، 2007). وتؤدي التركيزات العالية من هذه الهيدروكربونات في المياه السطحية أو عصارة النفايات الصلبة إلى تسربها في نهاية المطاف إلى المياه الجوفية، مما يشكل تهديدًا كبيرًا للصحة العامة، حيث يشرب أكثر من 70% من سكان جنوب وجنوب شرق آسيا المياه الجوفية (دوتاجوبتا وآخرون، 2019). وقد وجدت دراسة حديثة أجراها دوتاجوبتا وآخرون (2020) لتحليل عينات من الأنهار (32 عينة) والمياه الجوفية (235 عينة) في ولاية البنغال الغربية بالهند، أن ما يقدر بنحو 53% من سكان المدن و44% من سكان الريف (بإجمالي 20 مليون نسمة) قد يتعرضون للنفثالين (4.9-10.6 ميكروغرام/لتر) ومشتقاته. تُعتبر أنماط استخدام الأراضي المتباينة وزيادة استخراج المياه الجوفية من العوامل الرئيسية التي تتحكم في النقل الرأسي (الانتقال) للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ذات الوزن الجزيئي المنخفض في باطن الأرض. وقد وُجد أن جريان المياه الزراعية، وتصريف مياه الصرف الصحي البلدية والصناعية، وتصريف النفايات الصلبة/القمامة تتأثر بالهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات في أحواض الأنهار ورواسب باطن الأرض. كما أن هطول الأمطار يزيد من تفاقم تلوث الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات. وقد سُجلت تركيزات عالية من الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ومشتقاتها الألكيلية (51 مركباً إجمالاً) في الأنهار/مستجمعات المياه حول العالم، مثل نهر فريزر، ونهر لوان، ونهر دينسو، ونهر ميسوري، ونهر أناكوستيا، ونهر إيبرو، ونهر ديلاوير (يونكر وآخرون، 2002؛ موتيلاي-ماسي وآخرون، 2006؛ لي وآخرون، 2010؛ أمواكو وآخرون، 2011؛ ​​كيم وآخرون، 2018). في رواسب حوض نهر الغانج، وُجد أن النفتالين والفينانثرين هما المركبان الأكثر وفرة (تم الكشف عنهما في 70% من العينات) (دوتاجوبتا وآخرون، 2019). علاوة على ذلك، أظهرت الدراسات أن معالجة مياه الشرب بالكلور قد تؤدي إلى تكوين مركبات الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات المؤكسدة والمكلورة الأكثر سمية (مانولي وسامارا، 1999). تتراكم هذه المركبات في الحبوب والفواكه والخضراوات نتيجة امتصاصها من قبل النباتات من التربة الملوثة والمياه الجوفية ومياه الأمطار (فيسميس وآخرون، 2002). تتلوث العديد من الكائنات المائية، مثل الأسماك وبلح البحر والمحار والروبيان، بهذه المركبات من خلال استهلاك الأغذية ومياه البحر الملوثة، وكذلك من خلال الأنسجة والجلد (ماكاي وفريزر، 2000). كما أن طرق الطهي والمعالجة، مثل الشواء والتحميص والتدخين والقلي والتجفيف والخبز والطهي على الفحم، قد تؤدي إلى وجود كميات كبيرة من هذه المركبات في الطعام. يعتمد هذا بشكل كبير على اختيار مادة التدخين، ومحتوى الهيدروكربونات الفينولية/العطرية، وطريقة الطهي، ونوع المدفأة، ومحتوى الرطوبة، وتوافر الأكسجين، ودرجة حرارة الاحتراق (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). كما تم الكشف عن الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAHs) في الحليب بتراكيز متفاوتة (0.75-2.1 ملغم/لتر) (Girelli et al., 2014). ويعتمد تراكم هذه الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات في الغذاء أيضًا على خصائصه الفيزيائية والكيميائية، بينما ترتبط آثارها السامة بالوظائف الفسيولوجية، والنشاط الأيضي، والامتصاص، والتوزيع، والتوزع في الجسم (Mechini et al., 2011).
تُعرف سمية الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAHs) وآثارها الضارة منذ زمن طويل (Cherniglia، 1984). تستطيع الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ذات الوزن الجزيئي المنخفض (LMW-PAHs) (حلقتان إلى ثلاث حلقات) الارتباط تساهميًا بجزيئات كبيرة متنوعة مثل الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA والبروتينات، وهي مواد مسرطنة (Santarelli et al.، 2008). ونظرًا لطبيعتها الكارهة للماء، فإنها تُفصل بواسطة أغشية دهنية. في البشر، تقوم إنزيمات السيتوكروم P450 أحادية الأكسجين بأكسدة الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات إلى إيبوكسيدات، بعضها شديد التفاعل (مثل إيبوكسيد البايديول) ويمكن أن يؤدي إلى تحول الخلايا الطبيعية إلى خلايا سرطانية (Marston et al.، 2001). بالإضافة إلى ذلك، فإن نواتج تحول الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات، مثل الكينونات والفينولات والإيبوكسيدات والديولات، وغيرها، أكثر سمية من المركبات الأصلية. يمكن لبعض الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAHs) ونواتجها الأيضية الوسيطة أن تؤثر على الهرمونات والعديد من الإنزيمات في عمليات الأيض، مما يؤثر سلبًا على النمو والجهاز العصبي المركزي والجهاز التناسلي والمناعي (سويثا وفال، 2005؛ فامسي-كريشنا وآخرون، 2006؛ أوستينغ وآخرون، 2008). وقد أشارت التقارير إلى أن التعرض قصير الأمد للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ذات الوزن الجزيئي المنخفض يُسبب ضعفًا في وظائف الرئة وتجلط الدم لدى مرضى الربو، ويزيد من خطر الإصابة بسرطانات الجلد والرئة والمثانة والجهاز الهضمي (أولسون وآخرون، 2010؛ ديغز وآخرون، 2011). كما أظهرت الدراسات التي أُجريت على الحيوانات أن التعرض للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات قد يكون له آثار ضارة على الوظائف التناسلية والنمو، وقد يُسبب إعتام عدسة العين وتلف الكلى والكبد واليرقان. وقد ثبت أن العديد من نواتج التحول الحيوي للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات، مثل الديولات والإيبوكسيدات والكينونات والجذور الحرة (الكاتيونات)، تُشكل نواتج إضافة الحمض النووي (DNA). أظهرت الدراسات أن المركبات المستقرة تُغير آلية تضاعف الحمض النووي، بينما تُسبب المركبات غير المستقرة إزالة البيورينات من الحمض النووي (بشكل رئيسي إلى الأدينين وأحيانًا إلى الجوانين)؛ وكلاهما يُمكن أن يُؤدي إلى أخطاء تُسبب طفرات (شفايغرت وآخرون، 2001). بالإضافة إلى ذلك، يُمكن أن تُولد الكينونات (البنزو/البان) أنواع الأكسجين التفاعلية، مما يُسبب تلفًا قاتلًا للحمض النووي والجزيئات الكبيرة الأخرى، وبالتالي يُؤثر على وظيفة الأنسجة/حيويتها (إيوا ودانوتا، 2017). وقد أُفيد أن التعرض المزمن لتركيزات منخفضة من البيرين، وثنائي الفينيل، والنفثالين يُسبب السرطان في الحيوانات المخبرية (ديغز وآخرون، 2012). ونظرًا لسميتها القاتلة، يُعد تنظيف/إزالة هذه الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات من المواقع المتضررة/الملوثة أولوية قصوى.
استُخدمت طرق فيزيائية وكيميائية متنوعة لإزالة الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات من المواقع والبيئات الملوثة. وتعاني عمليات مثل الحرق، وإزالة الكلور، والأكسدة بالأشعة فوق البنفسجية، والتثبيت، والاستخلاص بالمذيبات من العديد من العيوب، بما في ذلك تكوين منتجات ثانوية سامة، وتعقيد العملية، ومسائل السلامة واللوائح التنظيمية، وانخفاض الكفاءة، وارتفاع التكلفة. ومع ذلك، يُعد التحلل الحيوي الميكروبي (المعروف بالمعالجة الحيوية) نهجًا بديلًا واعدًا يعتمد على استخدام الكائنات الحية الدقيقة في شكل مزارع نقية أو مستعمرات. وبالمقارنة مع الطرق الفيزيائية والكيميائية، تُعد هذه العملية صديقة للبيئة، وغير ضارة، وفعالة من حيث التكلفة، ومستدامة. يمكن إجراء المعالجة البيولوجية في الموقع المتضرر (في الموقع) أو في موقع مُجهز خصيصًا (خارج الموقع)، ولذلك تعتبر طريقة معالجة أكثر استدامة من الطرق الفيزيائية والكيميائية التقليدية (Juhasz and Naidu, 2000; Andreoni and Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
يُعدّ فهم الخطوات الأيضية الميكروبية المُشاركة في تحلل الملوثات العطرية ذا أهمية علمية واقتصادية بالغة الأهمية للاستدامة البيئية والإيكولوجية. يُقدّر أن 2.1 × 10¹⁸ غرام من الكربون مُخزّنة في الرواسب والمركبات العضوية (مثل النفط والغاز الطبيعي والفحم، أي الوقود الأحفوري) على مستوى العالم، مما يُساهم بشكل كبير في دورة الكربون العالمية. مع ذلك، فإنّ التوسع الصناعي السريع واستخراج الوقود الأحفوري والأنشطة البشرية تُستنزف خزانات الكربون الليثوسفيرية هذه، مُطلقةً ما يُقدّر بـ 5.5 × 10¹⁵ غرام من الكربون العضوي (كملوثات) في الغلاف الجوي سنويًا (غونزاليس-غايا وآخرون، 2019). يدخل معظم هذا الكربون العضوي إلى النظم البيئية البرية والبحرية من خلال الترسيب والنقل والجريان السطحي. بالإضافة إلى ذلك، تُلوِّث الملوثات الاصطناعية الجديدة المشتقة من الوقود الأحفوري، مثل البلاستيك والملدنات ومثبتات البلاستيك (الفثالات ومشتقاتها)، النظم البيئية البحرية والترابية والمائية وكائناتها الحية بشكل خطير، مما يُفاقم مخاطر تغير المناخ العالمي. وقد تراكمت أنواع مختلفة من اللدائن الدقيقة والنانوية وشظايا البلاستيك ومنتجاتها الأحادية السامة المشتقة من بولي إيثيلين تيريفثالات (PET) في المحيط الهادئ بين أمريكا الشمالية وجنوب شرق آسيا، مُشكِّلةً ما يُعرف بـ"بقعة القمامة الكبرى في المحيط الهادئ"، مما يُلحق الضرر بالحياة البحرية (نيويل وآخرون، 2020). وقد أثبتت الدراسات العلمية أنه من غير الممكن إزالة هذه الملوثات/النفايات بأي طريقة فيزيائية أو كيميائية. وفي هذا السياق، تُعد الكائنات الحية الدقيقة الأكثر فائدة هي تلك القادرة على استقلاب الملوثات تأكسديًا إلى ثاني أكسيد الكربون والطاقة الكيميائية وغيرها من المنتجات الثانوية غير السامة التي تدخل في نهاية المطاف في عمليات دورة المغذيات الأخرى (الهيدروجين، والأكسجين، والنيتروجين، والكبريت، والفوسفور، والحديد، إلخ). لذا، يُعدّ فهم الفيزيولوجيا البيئية الميكروبية لتحلل الملوثات العطرية والتحكم البيئي بها أمرًا بالغ الأهمية لتقييم دورة الكربون الميكروبية، وميزانية الكربون الصافية، ومخاطر المناخ المستقبلية. ونظرًا للحاجة المُلحة لإزالة هذه المركبات من البيئة، فقد ظهرت العديد من الصناعات البيئية التي تركز على التقنيات النظيفة. وبدلاً من ذلك، يُعتبر تثمين النفايات الصناعية/المواد الكيميائية المُتراكمة في النظم البيئية (أي نهج تحويل النفايات إلى ثروة) أحد أركان الاقتصاد الدائري وأهداف التنمية المستدامة (كلوز وآخرون، 2012). ولذلك، يُعدّ فهم الجوانب الأيضية والإنزيمية والوراثية لهذه المركبات المرشحة للتحلل الحيوي أمرًا في غاية الأهمية لإزالة هذه الملوثات العطرية ومعالجتها بيولوجيًا بفعالية.
من بين الملوثات العطرية العديدة، نولي اهتمامًا خاصًا بالهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ذات الوزن الجزيئي المنخفض، مثل النفثالين ومشتقاته. تُعد هذه المركبات مكونات رئيسية للوقود المشتق من البترول، وأصباغ المنسوجات، والمنتجات الاستهلاكية، والمبيدات الحشرية (كرات النفتالين وطاردات الحشرات)، والملدنات، والتانينات، ولذلك فهي منتشرة على نطاق واسع في العديد من النظم البيئية (برويس وآخرون، 2003). تُشير التقارير الحديثة إلى تراكم تركيزات النفثالين في رواسب طبقات المياه الجوفية، والمياه الجوفية، والتربة تحت السطحية، والمناطق غير المشبعة، وقيعان الأنهار، مما يُوحي بتراكمه الحيوي في البيئة (دوتاجوبتا وآخرون، 2019، 2020). يُلخص الجدول 2 الخصائص الفيزيائية والكيميائية، والتطبيقات، والآثار الصحية للنفثالين ومشتقاته. بالمقارنة مع مركبات الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات الأخرى ذات الوزن الجزيئي العالي، يتميز النفتالين ومشتقاته بانخفاض كراهيته للماء، وزيادة ذوبانه فيه، وانتشاره الواسع في النظم البيئية، لذا يُستخدم غالبًا كركائز نموذجية لدراسة استقلاب مركبات الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات، وعلم الوراثة الخاص بها، وتنوعها الأيضي. يستطيع عدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة استقلاب النفتالين ومشتقاته، وتتوفر معلومات شاملة حول مساراتها الأيضية، وإنزيماتها، وخصائصها التنظيمية (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). إضافةً إلى ذلك، يُصنف النفتالين ومشتقاته كمركبات نموذجية لتقييم التلوث البيئي نظرًا لوفرتها العالية وتوافرها الحيوي. تُقدّر وكالة حماية البيئة الأمريكية أن متوسط ​​مستويات النفتالين يبلغ 5.19 ميكروغرام لكل متر مكعب من دخان السجائر، الناتج أساسًا عن الاحتراق غير الكامل، ويتراوح بين 7.8 و46 ميكروغرام من الدخان الجانبي، بينما يكون التعرض للكريوزوت والنفتالين أعلى بمقدار 100 إلى 10000 مرة (برويس وآخرون، 2003). وقد وُجد أن للنفتالين، على وجه الخصوص، سمية تنفسية وسرطنة تختلف باختلاف الأنواع والمناطق والأجناس. واستنادًا إلى الدراسات التي أُجريت على الحيوانات، صنّفت الوكالة الدولية لأبحاث السرطان (IARC) النفتالين على أنه "مادة مسرطنة محتملة للإنسان" (المجموعة 2B)1. ويؤدي التعرض لمشتقات النفتالين، وخاصةً عن طريق الاستنشاق أو الإعطاء عن طريق الحقن (الفم)، إلى تلف أنسجة الرئة وزيادة معدل الإصابة بأورام الرئة لدى الفئران والجرذان (البرنامج الوطني لعلم السموم 2). تشمل الأعراض الحادة الغثيان والقيء وآلام البطن والإسهال والصداع والتشوش الذهني والتعرق الغزير والحمى وتسارع ضربات القلب، وغيرها. من جهة أخرى، أُفيد أن مبيد الكاربامات واسع الطيف كارباريل (1-نفثيل ن-ميثيل كاربامات) سام لللافقاريات المائية والبرمائيات ونحل العسل والبشر، وقد ثبت أنه يثبط إنزيم أستيل كولين إستراز مسببًا الشلل (سمولدرز وآخرون، 2003؛ بولين وديستل، 2011). لذا، يُعد فهم آليات التحلل الميكروبي والتنظيم الجيني والتفاعلات الإنزيمية والخلوية أمرًا بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات المعالجة الحيوية في البيئات الملوثة.
الجدول 2. معلومات تفصيلية عن الخصائص الفيزيائية والكيميائية والاستخدامات وطرق التعرف والأمراض المرتبطة بالنفثالين ومشتقاته.
في البيئات الملوثة، يمكن للملوثات العطرية الكارهة للماء والمحبة للدهون أن تُحدث تأثيرات خلوية متنوعة على الميكروبيوم البيئي (المجتمع الميكروبي)، مثل تغيرات في سيولة الغشاء، ونفاذيته، وتورم الطبقة الدهنية الثنائية، واضطراب نقل الطاقة (سلسلة نقل الإلكترون/قوة دافعة البروتون)، ونشاط البروتينات المرتبطة بالغشاء (سيكيما وآخرون، 1995). إضافةً إلى ذلك، تُنتج بعض المركبات الوسيطة الذائبة، مثل الكاتيكولات والكينونات، أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وتُشكل نواتج إضافة مع الحمض النووي والبروتينات (بينينغ وآخرون، 1999). وبالتالي، فإن وفرة هذه المركبات في النظم البيئية تُمارس ضغطًا انتقائيًا على المجتمعات الميكروبية لتصبح مُحللات فعالة على مستويات فسيولوجية مختلفة، بما في ذلك الامتصاص/النقل، والتحول داخل الخلايا، والاستيعاب/الاستخدام، والتجزئة الخلوية.
أظهر بحثٌ في مشروع قاعدة بيانات الريبوسومات-II (RDP-II) عزل 926 نوعًا من البكتيريا من أوساط أو مزارع مُخصبة ملوثة بالنفثالين أو مشتقاته. وكانت مجموعة البروتيوكتيريا الأكثر تمثيلًا (755 نوعًا)، تليها الفيرميكوتس (52 نوعًا)، ثم البكتيرويديتس (43 نوعًا)، ثم الأكتينوبكتيريا (39 نوعًا)، ثم التينيريكوتس (10 أنواع)، وأخيرًا البكتيريا غير المصنفة (8 أنواع) (الشكل 2). وسيطر ممثلو غاما بروتيوكتيريا (الزائفة والزانثوموناداليس) على جميع مجموعات البكتيريا سالبة الغرام ذات المحتوى العالي من الجوانين والسيتوزين (54%)، بينما كانت الكلوستريدياليس والباسيلاليس (30%) من مجموعات البكتيريا موجبة الغرام ذات المحتوى المنخفض من الجوانين والسيتوزين. أُفيد أن بكتيريا الزائفة (الأكثر عددًا، 338 نوعًا) قادرة على تحليل النفتالين ومشتقاته الميثيلية في مختلف النظم البيئية الملوثة (قطران الفحم، البترول، النفط الخام، الحمأة، بقع النفط، مياه الصرف الصحي، النفايات العضوية، ومكبات النفايات)، وكذلك في النظم البيئية السليمة (التربة، الأنهار، الرواسب، والمياه الجوفية) (الشكل 2). علاوة على ذلك، كشفت دراسات الإثراء والتحليل الميتاجينومي لبعض هذه المناطق أن أنواعًا غير مستزرعة من بكتيريا الليجيونيلا والكلوستريديوم قد تمتلك قدرة تحليلية، مما يشير إلى ضرورة استزراع هذه البكتيريا لدراسة مسارات جديدة وتنوع أيضي أوسع.
الشكل 2. التنوع التصنيفي والتوزيع البيئي للبكتيريا الممثلة في البيئات الملوثة بالنفثالين ومشتقات النفثالين.
من بين الكائنات الدقيقة المختلفة التي تحلل الهيدروكربونات العطرية، فإن معظمها قادر على تحليل النفتالين كمصدر وحيد للكربون والطاقة. وقد وُصفت سلسلة الأحداث المتضمنة في استقلاب النفتالين لبكتيريا الزائفة (Pseudomonas sp.). (السلالات: NCIB 9816-4، G7، AK-5، PMD-1، وCSV86)، وPseudomonas stutzeri AN10، وPseudomonas fluorescens PC20، وسلالات أخرى (ND6 وAS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis and Zylstra, 2004; Sota et al., 2006). تبدأ عملية الأيض بواسطة إنزيم ثنائي الأكسجين متعدد المكونات [ثنائي أكسجين النفثالين (NDO)، وهو ثنائي أكسجين مُهدرج للحلقة] الذي يحفز أكسدة إحدى الحلقات العطرية للنفثالين باستخدام الأكسجين الجزيئي كركيزة أخرى، محولًا النفثالين إلى cis-نفثالينيديول. (الشكل 3). يتحول ثنائي هيدرو ثنائيول السيس إلى 1،2-ثنائي هيدروكسي نافثالين بواسطة نازعة هيدروجين. يقوم ثنائي أوكسيجيناز قاطع الحلقة، ثنائي أوكسيجيناز 1،2-ثنائي هيدروكسي نافثالين (12DHNDO)، بتحويل 1،2-ثنائي هيدروكسي نافثالين إلى حمض 2-هيدروكسي كرومين-2-كربوكسيليك. ينتج عن عملية التماثل الإنزيمي بين السيس والترانس مركب ترانس-أو-هيدروكسي بنزيليدين بيروفات، الذي يُقطع بواسطة هيدراتاز ألدولاز إلى ساليسيل ألدهيد وبيروفات. كان حمض البيروفيك العضوي أول مركب C3 مشتق من الهيكل الكربوني للنافثالين، والذي تم توجيهه إلى مسار الكربون المركزي. بالإضافة إلى ذلك، يحول نازعة هيدروجين ساليسيل ألدهيد المعتمدة على NAD+ مركب ساليسيل ألدهيد إلى حمض الساليسيليك. يُطلق على عملية الأيض في هذه المرحلة اسم "المسار العلوي" للنافثالين. التحلل. هذا المسار شائع جدًا في معظم البكتيريا المحللة للنفثالين. ومع ذلك، هناك بعض الاستثناءات؛ على سبيل المثال، في بكتيريا Bacillus hamburgii 2 المحبة للحرارة، يبدأ تحلل النفثالين بواسطة إنزيم نفثالين 2،3-ديوكسيجيناز لتكوين 2،3-ثنائي هيدروكسي نفثالين (Annweiler et al., 2000).
الشكل 3. مسارات تحلل النفثالين، وميثيل النفثالين، وحمض النفثويك، والكاربارييل. تمثل الأرقام المحاطة بدوائر الإنزيمات المسؤولة عن التحويل المتسلسل للنفثالين ومشتقاته إلى المنتجات اللاحقة. 1 - ديوكسيجيناز النفثالين (NDO)؛ 2 - نازعة هيدروجين ثنائي هيدرو ثنائي سيس؛ 3 - ديوكسيجيناز 1،2-ثنائي هيدروكسي نفثالين؛ 4 - إيزوميراز حمض 2-هيدروكسي كرومين-2-كربوكسيليك؛ 5 - ألدولاز هيدراتاز ترانس-O-هيدروكسي بنزيليدين بيروفات؛ 6 - نازعة هيدروجين ساليسيل ألدهيد؛ 7 - هيدروكسيلاز ساليسيلات 1؛ 8 - ديوكسيجيناز كاتيكول 2،3 (C23DO)؛ 9 - نازعة هيدروجين 2-هيدروكسي موكونات سيمي ألدهيد. 10، هيدراتاز 2-أوكسوبنت-4-إينوات؛ 11، ألدولاز 4-هيدروكسي-2-أوكسوبنتانوات؛ 12، ديهيدروجينيز الأسيتالدهيد؛ 13، كاتيكول-1،2-ديوكسيجيناز (C12DO)؛ 14، سيكلوأيزوميراز الميوكونات؛ 15، دلتا-أيزوميراز الميوكونولاكتون؛ 16، هيدرولاز بيتا-كيتوأديباتينوللاكتون؛ 17، ناقل سكسينيل-CoA لبيتا-كيتوأديبات؛ 18، ثيولاز بيتا-كيتوأديبات-CoA؛ 19، سكسينيل-CoA: أسيتيل-CoA سكسينيل ترانسفيراز؛ 20، ساليسيلات 5-هيدروكسيلاز؛ 21 – جنتيسات 1،2-ديوكسيجيناز (GDO)؛ 22، إيزوميراز ماليلبيروفات؛ 23، هيدرولاز فوماريلبيروفات؛ 24، هيدروكسيلاز ميثيل نافثالين (NDO)؛ 25، ديهيدروجينيز هيدروكسي ميثيل نافثالين؛ 26، ديهيدروجينيز نافثالدهيد؛ 27، أوكسيداز حمض 3-فورميل ساليسيليك؛ 28، ديكاربوكسيلاز هيدروكسي إيزوفثالات؛ 29، هيدرولاز كارباريل (CH)؛ 30، 1-نافثول-2-هيدروكسيلاز.
اعتمادًا على الكائن الحي وتركيبه الجيني، يُستقلب حمض الساليسيليك الناتج إما عبر مسار الكاتيكول باستخدام إنزيم ساليسيلات 1-هيدروكسيلاز (S1H)، أو عبر مسار الجنتيسات باستخدام إنزيم ساليسيلات 5-هيدروكسيلاز (S5H) (الشكل 3). ولأن حمض الساليسيليك هو الوسيط الرئيسي في استقلاب النفثالين (المسار العلوي)، تُعرف الخطوات من حمض الساليسيليك إلى وسيط دورة حمض الستريك (TCA) بالمسار السفلي، وتُنظم الجينات في أوبيرون واحد. ومن الشائع ملاحظة أن الجينات في أوبيرون المسار العلوي (nah) وأوبيرون المسار السفلي (sal) تُنظم بواسطة عوامل تنظيمية مشتركة؛ فعلى سبيل المثال، يعمل كل من NahR وحمض الساليسيليك كمحفزات، مما يسمح لكلا الأوبيرونين باستقلاب النفثالين بشكل كامل (Phale et al., 2019, 2020).
بالإضافة إلى ذلك، ينشطر الكاتيكول حلقيًا إلى 2-هيدروكسي موكونات سيمي ألدهيد عبر المسار ميتا بواسطة إنزيم كاتيكول 2،3-ديوكسيجيناز (C23DO) (ين وآخرون، 1988)، ثم يتحلل مائيًا بواسطة إنزيم 2-هيدروكسي موكونات سيمي ألدهيد هيدرولاز لتكوين حمض 2-هيدروكسي بنت-2،4-ديينويك. بعد ذلك، يتحول 2-هيدروكسي بنت-2،4-ديينوات إلى بيروفات وأسيتالدهيد بواسطة إنزيم هيدراتاز (2-أوكسوبنت-4-إينوات هيدراتاز) وإنزيم ألدولاز (4-هيدروكسي-2-أوكسوبنتانوات ألدولاز)، ثم يدخل مسار الكربون المركزي (الشكل 3). بدلاً من ذلك، ينشطر الكاتيكول حلقيًا إلى سيس،سيس-موكونات عبر المسار أورثو بواسطة إنزيم كاتيكول 1،2-أوكسيجيناز (C12DO). تقوم إنزيمات Muconate cycloisomerase و muconolactone isomerase و β-ketoadipate-nollactone hydrolase بتحويل cis,cis-muconate إلى 3-oxoadipate، والذي يدخل مسار الكربون المركزي عبر succinyl-CoA و acetyl-CoA (Nozaki et al., 1968) (الشكل 3).
في مسار الجنتيسات (2،5-ثنائي هيدروكسي بنزوات)، تُكسر الحلقة العطرية بواسطة إنزيم جنتيسات 1،2-ديوكسيجيناز (GDO) لتكوين ماليلبيروفات. يمكن تحلل هذا الناتج مباشرةً إلى بيروفات ومالات، أو يمكن تحويله إلى فوماريل بيروفات، والذي يمكن تحلله بدوره إلى بيروفات وفومارات (لاركين وداي، 1986). وقد لوحظ اختيار المسار البديل في كل من البكتيريا سالبة الغرام وموجبة الغرام على المستويين البيوكيميائي والجيني (مورافسكي وآخرون، 1997؛ وايت وآخرون، 1997). تُفضل البكتيريا سالبة الغرام (الزائفة) استخدام حمض الساليسيليك، وهو مُحفز لعملية استقلاب النفثالين، حيث تقوم بإزالة مجموعة الكربوكسيل منه وتحويله إلى كاتيكول باستخدام إنزيم ساليسيلات 1-هيدروكسيلاز (جيبسون وسوبرامانيان، 1984). من ناحية أخرى، في البكتيريا موجبة الغرام (الرودوكوكوس)، يقوم إنزيم ساليسيلات 5-هيدروكسيلاز بتحويل حمض الساليسيليك إلى حمض الجنتيسيك، بينما لا يُؤثر حمض الساليسيليك على نسخ جينات النفثالين (جروند وآخرون، 1992) (الشكل 3).
أُفيد بأن أنواعًا من البكتيريا، مثل Pseudomonas CSV86 وOceanobacterium NCE312 وMarinhomonas naphthotrophicus وSphingomonas paucimobilis 2322 وVibrio cyclotrophus وPseudomonas fluorescens LP6a وأنواع أخرى من Pseudomonas وMycobacterium، قادرة على تحليل أحادي ميثيل النفثالين أو ثنائي ميثيل النفثالين (Dean-Raymond and Bartha, 1975; Cane and Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). ومن بينها، مسار تحليل 1-ميثيل النفثالين و2-ميثيل النفثالين في Pseudomonas sp. تمت دراسة سلالة CSV86 بشكلٍ وافٍ على المستويين البيوكيميائي والإنزيمي (ماهاجان وآخرون، 1994). يُستقلب 1-ميثيل نفثالين عبر مسارين. أولًا، تُهدرج الحلقة العطرية (الحلقة غير المستبدلة من ميثيل نفثالين) لتكوين cis-1,2-ثنائي هيدروكسي-1,2-ثنائي هيدرو-8-ميثيل نفثالين، والذي يتأكسد لاحقًا إلى ساليسيلات الميثيل وميثيل كاتيكول، ثم يدخل مسار الكربون المركزي بعد انشطار الحلقة (الشكل 3). يُسمى هذا المسار "مسار مصدر الكربون". في "مسار إزالة السمية" الثاني، يمكن هدرجة مجموعة الميثيل بواسطة NDO لتكوين 1-هيدروكسي ميثيل نفثالين، والذي يتأكسد لاحقًا إلى حمض 1-نفثويك ويُطرح في وسط الاستنبات كمنتج نهائي. أظهرت الدراسات أن سلالة CSV86 غير قادرة على النمو باستخدام حمض النفثويك-1 و2 كمصدر وحيد للكربون والطاقة، مما يؤكد مسار إزالة السموم لديها (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). في 2-ميثيل نفثالين، تخضع مجموعة الميثيل لعملية هيدروكسلة بواسطة إنزيم الهيدروكسيلاز لتكوين 2-هيدروكسي ميثيل نفثالين. بالإضافة إلى ذلك، تخضع الحلقة غير المستبدلة في حلقة النفثالين لعملية هيدروكسلة حلقية لتكوين ثنائي هيدروكسيل، والذي يتأكسد إلى 4-هيدروكسي ميثيل كاتيكول في سلسلة من التفاعلات المحفزة بالإنزيم، ويدخل مسار الكربون المركزي عبر مسار انشطار الحلقة ميتا. وبالمثل، تم الإبلاغ عن أن S. paucimobilis 2322 يستخدم NDO لهدرجة 2-ميثيل نافثالين، والذي يتأكسد بشكل أكبر لتكوين ساليسيلات الميثيل وميثيل كاتيكول (Dutta et al.، 1998).
تُعدّ أحماض النفثويك (المستبدلة وغير المستبدلة) نواتج ثانوية لإزالة السموم والتحول الحيوي، تتشكل أثناء تحلل ميثيل النفثالين والفينانثرين والأنثراسين، وتُطلق في وسط الاستزراع المستهلك. وقد أُفيد بأن عزلة التربة Stenotrophomonas maltophilia CSV89 قادرة على استقلاب حمض 1-نفثويك كمصدر للكربون (Phale et al., 1995). يبدأ الاستقلاب بإضافة مجموعتي هيدروكسيل إلى الحلقة العطرية لتكوين 1،2-ثنائي هيدروكسي-8-كربوكسي نفثالين. يتأكسد ثنائي الكحول الناتج إلى كاتيكول عبر 2-هيدروكسي-3-كربوكسي بنزيليدين بيروفات، وحمض 3-فورميل ساليسيليك، وحمض 2-هيدروكسي إيزوفثاليك، وحمض الساليسيليك، ثم يدخل مسار الكربون المركزي عبر مسار انشطار الحلقة ميتا (الشكل 3).
الكارباميل مبيد حشري من نوع نافثيل كاربامات. منذ الثورة الخضراء في الهند في سبعينيات القرن الماضي، أدى استخدام الأسمدة والمبيدات الكيميائية إلى زيادة انبعاثات الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات من مصادر زراعية غير محددة (بينغالي، 2012؛ دوتاجوبتا وآخرون، 2020). وتشير التقديرات إلى أن 55% (85,722,000 هكتار) من إجمالي الأراضي الزراعية في الهند تُعالج بالمبيدات الكيميائية. وخلال السنوات الخمس الماضية (2015-2020)، استخدم القطاع الزراعي الهندي ما بين 55,000 و60,000 طن من المبيدات سنويًا (إدارة التعاونيات ورفاهية المزارعين، وزارة الزراعة، حكومة الهند، أغسطس 2020). وفي سهول الغانج الشمالية والوسطى (الولايات ذات الكثافة السكانية الأعلى)، ينتشر استخدام المبيدات على المحاصيل على نطاق واسع، مع غلبة المبيدات الحشرية. الكارباميل (1-نفثيل-ن-ميثيل كاربامات) مبيد حشري واسع الطيف، متوسط ​​إلى شديد السمية، يُستخدم في الزراعة الهندية بمعدل 100-110 أطنان. يُباع عادةً تحت الاسم التجاري سيفين، ويُستخدم لمكافحة الحشرات (المن، النمل الناري، البراغيث، العث، العناكب، والعديد من الآفات الخارجية الأخرى) التي تُصيب محاصيل متنوعة (الذرة، فول الصويا، القطن، الفواكه، والخضراوات). كما يمكن استخدام بعض الكائنات الدقيقة، مثل الزائفة (NCIB 12042، 12043، C4، C5، C6، C7، الزائفة بوتيدا XWY-1)، والرودوكوكوس (NCIB 12038)، وأنواع السفينجوبكتيريوم (CF06)، والبوركولديريا (C3)، والميكروكوكس، والأرثروباكتر، لمكافحة آفات أخرى. أُفيد بأن إنزيم RC100 قادر على تحليل الكارباميل (لاركين وداي، 1986؛ تشابالامادوجو وتشودري، 1991؛ هاياستو وآخرون، 1999؛ سويثا وفال، 2005؛ تريفيدي وآخرون، 2017). دُرست آلية تحلل الكارباميل على نطاق واسع على المستويات البيوكيميائية والإنزيمية والوراثية في عزلات التربة من سلالات Pseudomonas sp. C4 وC5 وC6 (سويثا وفال، 2005؛ تريفيدي وآخرون، 2016) (الشكل 3). تبدأ هذه الآلية الأيضية بتحلل الرابطة الإسترية بواسطة إنزيم هيدرولاز الكارباميل (CH) لتكوين 1-نفثول وميثيل أمين وثاني أكسيد الكربون. يتحول 1-نفثول بعد ذلك إلى 1،2-ثنائي هيدروكسي نفثالين بواسطة إنزيم 1-نفثول هيدروكسيلاز (1-NH)، والذي يُستقلب لاحقًا عبر مسار الكربون المركزي بواسطة الساليسيلات والجنتيسات. وقد أُبلغ عن قيام بعض البكتيريا المحللة للكارباميل باستقلابه إلى حمض الساليسيليك عن طريق انشطار حلقة الكاتيكول أورثو (لاركين وداي، 1986؛ تشابالامادوجو وتشودري، 1991). والجدير بالذكر أن البكتيريا المحللة للنفثالين تستقلب حمض الساليسيليك بشكل أساسي عبر الكاتيكول، بينما تفضل البكتيريا المحللة للكارباميل استقلاب حمض الساليسيليك عبر مسار الجنتيسات.
يمكن استخدام مشتقات حمض النفثالين سلفونيك/حمض ثنائي السلفونيك وحمض النفثيلامين سلفونيك كمركبات وسيطة في إنتاج أصباغ الآزو، وعوامل الترطيب، والمشتتات، وغيرها. على الرغم من أن هذه المركبات ذات سمية منخفضة للإنسان، فقد أظهرت تقييمات السمية الخلوية أنها قاتلة للأسماك، والدفنيا، والطحالب (غريم وآخرون، 1994). وقد أُفيد أن ممثلين عن جنس الزائفة (السلالات A3 وC22) يبدأون عملية الأيض عن طريق الهيدروكسيل المزدوج للحلقة العطرية التي تحتوي على مجموعة حمض السلفونيك لتكوين ثنائي هيدروكسيول، والذي يتحول بدوره إلى 1،2-ثنائي هيدروكسي نفثالين عن طريق الانشطار التلقائي لمجموعة الكبريتيت (بريلون وآخرون، 1981). يُهدم مركب 1،2-ثنائي هيدروكسي نافثالين الناتج عبر مسار النافثالين الكلاسيكي، أي مسار الكاتيكول أو الجنتيسات (الشكل 4). وقد ثبت أن حمض أمينونافثالين سلفونيك وحمض هيدروكسي نافثالين سلفونيك يمكن أن يتحللا تمامًا بواسطة تجمعات بكتيرية مختلطة ذات مسارات هدم متكاملة (نورتيمان وآخرون، 1986). كما ثبت أن أحد أفراد التجمع البكتيري يُزيل الكبريت من حمض أمينونافثالين سلفونيك أو حمض هيدروكسي نافثالين سلفونيك عن طريق الأكسدة الثنائية 1،2، بينما يُطلق أمينوساليسيلات أو هيدروكسي ساليسيلات في وسط الاستنبات كناتج نهائي، ثم يُمتص لاحقًا بواسطة أفراد آخرين من التجمع البكتيري. يُعد حمض نافثالين ثنائي السلفونيك قطبيًا نسبيًا ولكنه ضعيف التحلل الحيوي، وبالتالي يمكن استقلابه عبر مسارات مختلفة. تحدث عملية إزالة الكبريت الأولى أثناء عملية إضافة مجموعتي هيدروكسيل انتقائية موضعية إلى الحلقة العطرية ومجموعة حمض السلفونيك؛ أما عملية إزالة الكبريت الثانية فتحدث أثناء عملية هيدروكسلة حمض 5-سلفوساليسيليك بواسطة إنزيم ساليسيليك أسيد 5-هيدروكسيلاز لتكوين حمض الجنتيسيك، الذي يدخل في مسار الكربون المركزي (بريلون وآخرون، 1981) (الشكل 4). وتُعد الإنزيمات المسؤولة عن تحلل النفثالين مسؤولة أيضًا عن استقلاب سلفونات النفثالين (بريلون وآخرون، 1981؛ كيك وآخرون، 2006).
الشكل 4. مسارات الأيض لتحلل سلفونات النفثالين. تمثل الأرقام داخل الدوائر الإنزيمات المسؤولة عن استقلاب سلفونات النفثيل، وهي مشابهة/مطابقة للإنزيمات الموضحة في الشكل 3.
تُعدّ الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ذات الوزن الجزيئي المنخفض (LMW-PAHs) قابلة للاختزال، وكارهة للماء، وقليلة الذوبان، ولذلك فهي غير قابلة للتحلل الطبيعي. مع ذلك، تستطيع الكائنات الحية الدقيقة الهوائية أكسدتها عن طريق امتصاص الأكسجين الجزيئي (O2). تنتمي هذه الإنزيمات بشكل رئيسي إلى فئة المؤكسدات المختزلة، ويمكنها القيام بتفاعلات متنوعة مثل هيدروكسلة الحلقة العطرية (أحادية أو ثنائية الهيدروكسيل)، ونزع الهيدروجين، وانشطار الحلقة العطرية. تكون نواتج هذه التفاعلات في حالة أكسدة أعلى، ويتم استقلابها بسهولة أكبر عبر مسار الكربون المركزي (Phale et al., 2020). وقد أشارت التقارير إلى أن الإنزيمات في مسار التحلل قابلة للتحفيز. يكون نشاط هذه الإنزيمات منخفضًا جدًا أو معدومًا عند زراعة الخلايا على مصادر كربون بسيطة مثل الجلوكوز أو الأحماض العضوية. يلخص الجدول 3 الإنزيمات المختلفة (الأكسيجيناز، والهيدرولاز، والديهيدروجيناز، والأوكسيداز، وما إلى ذلك) المشاركة في استقلاب النفثالين ومشتقاته.
الجدول 3. الخصائص البيوكيميائية للإنزيمات المسؤولة عن تحلل النفتالين ومشتقاته.
أظهرت دراسات النظائر المشعة (18O2) أن دمج الأكسجين الجزيئي (O2) في الحلقات العطرية بواسطة الأكسيجينازات هو الخطوة الأهم في تنشيط التحلل البيولوجي للمركب (هايايشي وآخرون، 1955؛ ماسون وآخرون، 1955). يبدأ دمج ذرة أكسجين واحدة (O) من الأكسجين الجزيئي (O2) في الركيزة بواسطة أحادي الأكسيجيناز الداخلي أو الخارجي (المعروف أيضًا باسم الهيدروكسيلاز). وتُختزل ذرة أكسجين أخرى إلى ماء. تختزل أحادي الأكسيجيناز الخارجي الفلافين باستخدام NADH أو NADPH، بينما في أحادي الأكسيجيناز الداخلي، يُختزل الفلافين بواسطة الركيزة. يؤدي موقع الهيدروكسيل إلى تنوع في تكوين الناتج. على سبيل المثال، يقوم هيدروكسيلاز ساليسيلات 1 بهيدروكسلة حمض الساليسيليك عند الموضع C1، مكونًا الكاتيكول. من ناحية أخرى، يقوم إنزيم ساليسيلات 5-هيدروكسيلاز متعدد المكونات (الذي يحتوي على وحدات فرعية من المختزلة والفيريدوكسين والأكسيجيناز) بهدرجة حمض الساليسيليك في الموضع C5، مكونًا حمض الجنتيسيك (Yamamoto et al.، 1965).
تُدمج ثنائيات الأكسجين ذرتي أكسجين في الركيزة. وبناءً على النواتج المتكونة، تُقسم إلى ثنائيات أكسجين مُهدرجة للحلقة وثنائيات أكسجين قاطعة للحلقة. تُحوّل ثنائيات الأكسجين المُهدرجة للحلقة الركائز العطرية إلى ثنائيات هيدروكسيل من نوع سيس (مثل النفثالين)، وهي شائعة الانتشار بين البكتيريا. وقد ثبت حتى الآن أن الكائنات الحية التي تحتوي على ثنائيات أكسجين مُهدرجة للحلقة قادرة على النمو على مصادر كربون عطرية متنوعة، وتُصنف هذه الإنزيمات إلى ثنائي أكسجين النفثالين (NDO)، وثنائي أكسجين التولوين (TDO)، وثنائي أكسجين ثنائي الفينيل (BPDO). يحفز كل من إنزيم NDO وإنزيم BPDO الأكسدة المزدوجة وهيدروكسيل السلسلة الجانبية للعديد من الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (مثل التولوين، نيتروتولوين، زيلين، إيثيل بنزين، نفثالين، ثنائي فينيل، فلورين، إندول، ميثيل نفثالين، نفثالين سلفونات، فينانثرين، أنثراسين، أسيتوفينون، وغيرها) (بويد وشيلدريك، 1998؛ فال وآخرون، 2020). يتكون إنزيم NDO من نظام متعدد المكونات يشمل مختزلة أكسدة، وفيريدوكسين، ومكون أوكسيجيناز يحتوي على موقع نشط (جيبسون وسوبرامانيان، 1984؛ ريسنيك وآخرون، 1996). تتكون الوحدة التحفيزية لإنزيم NDO من وحدة فرعية كبيرة α ووحدة فرعية صغيرة β مرتبة في تكوين α3β3. ينتمي إنزيم NDO إلى عائلة كبيرة من الأكسيجينازات، وتحتوي وحدته الفرعية ألفا على موقع ريسك [2Fe-2S] وذرة حديد أحادية النواة غير هيمية، مما يحدد خصوصية الركيزة لإنزيم NDO (Parales et al., 1998). في دورة تحفيزية واحدة، ينتقل إلكترونان من اختزال نيوكليوتيد البيريدين إلى أيون الحديد الثنائي Fe(II) في الموقع النشط عبر مختزلة وفيريدوكسين وموقع ريسك. تعمل المكافئات المختزلة على تنشيط الأكسجين الجزيئي، وهو شرط أساسي لثنائي هيدروكسيل الركيزة (Ferraro et al., 2005). حتى الآن، لم يُنقى ويُوصَف بالتفصيل سوى عدد قليل من إنزيمات NDO من سلالات مختلفة، كما دُرست السيطرة الجينية على المسارات المشاركة في تحلل النفثالين بالتفصيل (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). تعمل إنزيمات ثنائي الأكسجيناز التي تكسر الحلقة (إنزيمات كسر الحلقة الداخلية أو الأورثو، وإنزيمات كسر الحلقة الخارجية أو الميتا) على المركبات العطرية المهدرجة. على سبيل المثال، إنزيم ثنائي الأكسجيناز الذي يكسر الحلقة الأورثو هو كاتيكول-1،2-ثنائي الأكسجيناز، بينما إنزيم ثنائي الأكسجيناز الذي يكسر الحلقة الميتا هو كاتيكول-2،3-ثنائي الأكسجيناز (كوجيما وآخرون، 1961؛ نوزاكي وآخرون، 1968). بالإضافة إلى أنواع الأكسجيناز المختلفة، توجد أيضًا أنواع مختلفة من نازعات الهيدروجين المسؤولة عن نزع الهيدروجين من ثنائي هيدروديولات العطرية والكحولات والألدهيدات، باستخدام NAD+/NADP+ كمستقبلات للإلكترونات، وهي من الإنزيمات المهمة المشاركة في عملية الأيض (جيبسون وسوبرامانيان، 1984؛ شو وهاراياما، 1990؛ فاهل وآخرون، 2020).
تُعدّ الإنزيمات، مثل الهيدرولازات (الإسترازات والأميدازات)، فئةً ثانيةً مهمةً من الإنزيمات التي تستخدم الماء لكسر الروابط التساهمية، وتتميز بنطاق واسع من التخصص في الركائز. يُعتبر هيدرولاز الكارباميل، إلى جانب أنواع أخرى من الهيدرولازات، من مكونات الحيز المحيط بالبلازما (الغشاء العابر) في أنواع البكتيريا سالبة الغرام (كاميني وآخرون، 2018). يحتوي الكارباميل على رابطة أميدية وإسترية؛ لذا، يمكن تحلله مائيًا بواسطة الإستراز أو الأميداز لتكوين 1-نفثول. وقد أُفيد أن الكارباميل في سلالة ريزوبيوم ريزوبيوم AC10023 وسلالة أرثروباكتر RC100 يعمل كإستراز وأميداز على التوالي. كما يعمل الكارباميل في سلالة أرثروباكتر RC100 أيضًا كأميداز. أظهرت الدراسات أن إنزيم RC100 قادر على تحليل أربعة مبيدات حشرية من فئة N-ميثيل كاربامات، مثل الكارباميل والميثوميل وحمض الميفيناميك وXMC (هاياتسو وآخرون، 2001). وقد ذُكر أن إنزيم CH في بكتيريا Pseudomonas sp. C5pp قادر على تحليل الكارباميل (بفعالية 100%) وأسيتات 1-نفثيل (بفعالية 36%)، ولكنه غير قادر على تحليل 1-نفثيل أسيتاميد، مما يشير إلى أنه إنزيم إستراز (تريفيدي وآخرون، 2016).
أظهرت الدراسات البيوكيميائية، وأنماط تنظيم الإنزيمات، والتحليلات الجينية أن جينات تحلل النفتالين تتكون من وحدتين تنظيميتين قابلتين للتحفيز، أو ما يُعرف بـ"الأوبيرون": nah (المسار العلوي، الذي يحول النفتالين إلى حمض الساليسيليك) و sal (المسار السفلي، الذي يحول حمض الساليسيليك إلى مسار الكربون المركزي عبر الكاتيكول). يمكن لحمض الساليسيليك ومشتقاته أن تعمل كمحفزات (شمس الزمان وبارنزلي، 1974). في وجود الجلوكوز أو الأحماض العضوية، يتم تثبيط الأوبيرون. يوضح الشكل 5 التنظيم الجيني الكامل لتحلل النفتالين (في شكل أوبيرون). تم وصف العديد من المتغيرات/الأشكال المسماة لجين nah (ndo/pah/dox)، ووجد أنها تتمتع بتشابه تسلسلي عالٍ (90%) بين جميع أنواع الزائفة (عباسيان وآخرون، 2016). رُتِّبت جينات مسار النفثالين العلوي عمومًا بترتيب توافقي كما هو موضح في الشكل 5أ. وأُشير أيضًا إلى أن جينًا آخر، هو nahQ، يشارك في استقلاب النفثالين، ويقع عادةً بين nahC وnahE، لكن وظيفته الفعلية لا تزال غير واضحة. وبالمثل، وُجد جين nahY، المسؤول عن الانجذاب الكيميائي الحساس للنفثالين، في الطرف البعيد من أوبيرون nah في بعض الأنواع. وفي بكتيريا Ralstonia sp.، وُجد أن جين U2 الذي يُشفِّر إنزيم غلوتاثيون إس-ترانسفيراز (gsh) يقع بين nahAa وnahAb، لكنه لا يؤثر على خصائص استخدام النفثالين (Zylstra et al., 1997).
الشكل 5. التنظيم الجيني والتنوع الملاحظ أثناء تحلل النفتالين بين أنواع البكتيريا؛ (أ) مسار النفتالين العلوي، استقلاب النفتالين إلى حمض الساليسيليك؛ (ب) مسار النفتالين السفلي، حمض الساليسيليك عبر الكاتيكول إلى مسار الكربون المركزي؛ (ج) حمض الساليسيليك عبر الجنتيسات إلى مسار الكربون المركزي.
يتكون "المسار السفلي" (أوبيرون سال) عادةً من الجينات nahGTHINLMOKJ، ويحول الساليسيلات إلى بيروفات وأسيتالدهيد عبر مسار انشطار حلقة الكاتيكول. وقد وُجد أن جين nahG (الذي يرمز إلى هيدروكسيلاز الساليسيلات) محفوظ في الطرف القريب من الأوبيرون (الشكل 5ب). بالمقارنة مع سلالات أخرى محللة للنفثالين، فإن أوبيروني nah وsal في بكتيريا Pseudomonas putida CSV86 متجاوران ومرتبطان ارتباطًا وثيقًا جدًا (حوالي 7.5 كيلوبايت). في بعض البكتيريا سالبة الغرام، مثل Ralstonia sp. U2 وPolaromonas naphthalenivorans CJ2 وPseudomonas putida AK5، يُستقلب النفثالين كمستقلب كربوني مركزي عبر مسار الجنتيسات (في صورة أوبيرون sgp/nag). يتم تمثيل كاسيت الجينات عادةً بالشكل nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI، حيث يوجد nagR (الذي يرمز إلى منظم من نوع LysR) في الطرف العلوي (الشكل 5C).
يدخل الكارباميل دورة الكربون المركزية عبر استقلاب 1-نفثول، و1،2-ثنائي هيدروكسي نفثالين، وحمض الساليسيليك، وحمض الجنتيسيك (الشكل 3). وبناءً على الدراسات الجينية والاستقلابية، اقتُرح تقسيم هذا المسار إلى "المرحلة الأولية" (تحويل الكارباميل إلى حمض الساليسيليك)، و"المرحلة الوسطى" (تحويل حمض الساليسيليك إلى حمض الجنتيسيك)، و"المرحلة النهائية" (تحويل حمض الجنتيسيك إلى وسائط مسار الكربون المركزي) (سينغ وآخرون، 2013). كشف التحليل الجينومي لـ C5pp (supercontig A، 76.3 كيلوبايت) أن جين mcbACBDEF يشارك في تحويل الكارباميل إلى حمض الساليسيليك، يليه mcbIJKL في تحويل حمض الساليسيليك إلى حمض الجنتيسيك، و mcbOQP في تحويل حمض الجنتيسيك إلى وسائط الكربون المركزية (الفومارات والبيروفات، تريفيدي وآخرون، 2016) (الشكل 6).
أُفيد بأن الإنزيمات المشاركة في تحلل الهيدروكربونات العطرية (بما في ذلك النفثالين وحمض الساليسيليك) يمكن تحفيزها بواسطة المركبات المقابلة وتثبيطها بواسطة مصادر كربونية بسيطة مثل الجلوكوز أو الأحماض العضوية (شينغلر، 2003؛ فال وآخرون، 2019، 2020). ومن بين المسارات الأيضية المختلفة للنفثالين ومشتقاته، دُرست الخصائص التنظيمية للنفثالين والكاربارييل إلى حد ما. بالنسبة للنفثالين، تُنظم الجينات في كل من المسارين العلوي والسفلي بواسطة NahR، وهو مُنظم إيجابي عابر من نوع LysR. وهو ضروري لتحفيز جين nah بواسطة حمض الساليسيليك والتعبير عنه بمستوى عالٍ لاحقًا (ين وجونسالوس، 1982). علاوة على ذلك، أظهرت الدراسات أن عامل المضيف التكاملي (IHF) ومنظم النسخ المعتمد على سيجما 54 (XylR) ضروريان أيضًا لتنشيط نسخ الجينات في استقلاب النفثالين (راموس وآخرون، 1997). كما أظهرت الدراسات أن إنزيمات مسار فتح حلقة الكاتيكول ميتا، وتحديدًا إنزيم الكاتيكول 2،3-ديوكسيجيناز، تُحفز في وجود النفثالين و/أو حمض الساليسيليك (باسيو وآخرون، 2006). وأظهرت الدراسات أيضًا أن إنزيمات مسار فتح حلقة الكاتيكول أورثو، وتحديدًا إنزيم الكاتيكول 1،2-ديوكسيجيناز، تُحفز في وجود حمض البنزويك وميوكونات سيس،سيس (بارسيك وآخرون، 1994؛ توفر وآخرون، 2001).
في السلالة C5pp، تشفر خمسة جينات، هي mcbG وmcbH وmcbN وmcbR وmcbS، منظمات تنتمي إلى عائلة LysR/TetR من منظمات النسخ المسؤولة عن التحكم في تحلل الكارباميل. وقد وُجد أن الجين المتماثل mcbG هو الأقرب صلةً بمنظم النسخ PhnS من نوع LysR (بنسبة تطابق 58% في الأحماض الأمينية) والذي يشارك في استقلاب الفينانثرين في بكتيريا Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). كما وُجد أن الجين mcbH يشارك في المسار الوسيط (تحويل حمض الساليسيليك إلى حمض الجنتيسيك) وينتمي إلى منظم النسخ NagR/DntR/NahR من نوع LysR في بكتيريا Pseudomonas وBurkholderia. وقد أُفيد أن أفراد هذه العائلة يتعرفون على حمض الساليسيليك كجزيء مُؤثر مُحدد لتحفيز جينات التحلل. من ناحية أخرى، تم تحديد ثلاثة جينات، mcbN و mcbR و mcbS، تنتمي إلى منظمات النسخ من نوع LysR و TetR، في المسار السفلي (مستقلبات مسار الكربون المركزي للجنتيسات).
في بدائيات النوى، تُعدّ عمليات النقل الجيني الأفقي (الاكتساب، أو التبادل، أو النقل) عبر البلازميدات، والترانسبوزونات، والبروفاجات، والجزر الجينومية، وعناصر الاقتران التكاملية (ICE) من الأسباب الرئيسية لمرونة الجينومات البكتيرية، مما يؤدي إلى اكتساب أو فقدان وظائف/صفات محددة. يسمح هذا للبكتيريا بالتكيف السريع مع الظروف البيئية المختلفة، مما يوفر مزايا أيضية تكيفية محتملة للمضيف، مثل تحلل المركبات العطرية. غالبًا ما تتحقق التغيرات الأيضية من خلال الضبط الدقيق لأوبيرونات التحلل، وآلياتها التنظيمية، وخصوصيات الإنزيمات، مما يُسهّل تحلل نطاق أوسع من المركبات العطرية (نوجيري وآخرون، 2004؛ فالي وآخرون، 2019، 2020). وُجد أن كاسيتات الجينات المسؤولة عن تحلل النفتالين تقع على مجموعة متنوعة من العناصر المتحركة، مثل البلازميدات (الاقترانية وغير الاقترانية)، والترانسبوزونات، والجينومات، وعناصر التكامل والتحويل (ICEs)، ومجموعات من أنواع بكتيرية مختلفة (الشكل 5). في بكتيريا Pseudomonas G7، يُنسخ كل من أوبيرون nah و sal الخاص بالبلازميد NAH7 في نفس الاتجاه، وهما جزء من ترانسبوزون معيب يتطلب إنزيم الترانسبوزاز Tn4653 للتحرك (Sota et al., 2006). أما في سلالة Pseudomonas NCIB9816-4، فقد وُجد الجين على البلازميد الاقتراني pDTG1 على شكل أوبيرونين (يفصل بينهما حوالي 15 كيلوبايت) يُنسخان في اتجاهين متعاكسين (Dennis and Zylstra, 2004). في سلالة Pseudomonas putida AK5، يحمل البلازميد غير المقترن pAK5 جين الإنزيم المسؤول عن تحلل النفتالين عبر مسار الجنتيسات (إزمالكوفا وآخرون، 2013). في سلالة Pseudomonas PMD-1، يقع أوبيرون nah على الكروموسوم، بينما يقع أوبيرون sal على البلازميد المقترن pMWD-1 (زونيغا وآخرون، 1981). مع ذلك، في Pseudomonas stutzeri AN10، تقع جميع جينات تحلل النفتالين (أوبيرون nah وsal) على الكروموسوم، ويُفترض أنها تُستَخدَم من خلال عمليات النقل وإعادة التركيب وإعادة الترتيب (بوش وآخرون، 2000). في Pseudomonas sp. يقع جينوم فيروس CSV86، الذي يضمّ الأوبيرونين nah و sal، على شكل عنصر ICE (ICECSV86). يحمي هذا العنصر جزيء tRNAGly متبوعًا بتكرارات مباشرة تشير إلى مواقع إعادة التركيب/الارتباط (attR و attL)، بالإضافة إلى إنزيم إنتغراز شبيه بالفيروسات يقع على طرفي tRNAGly، مما يجعله مشابهًا بنيويًا لعنصر ICEclc (ICEclcB13 في بكتيريا Pseudomonas knackmusii المسؤول عن تحلل الكلوركاتيكول). وقد أشارت الدراسات إلى إمكانية نقل الجينات الموجودة على عنصر ICE عن طريق الاقتران بتردد منخفض للغاية (10-8)، ناقلةً بذلك خصائص التحلل إلى الكائن المُستقبِل (Basu and Phale, 2008; Phale et al., 2019).
تقع معظم الجينات المسؤولة عن تحلل الكارباميل على البلازميدات. تحتوي بكتيريا Arthrobacter sp. RC100 على ثلاثة بلازميدات (pRC1 وpRC2 وpRC300)، منها بلازميدان مترافقان، هما pRC1 وpRC2، يحملان جينات الإنزيمات التي تحول الكارباميل إلى جنتيسات. في المقابل، تقع الإنزيمات المشاركة في تحويل الجنتيسات إلى مستقلبات الكربون المركزية على الكروموسوم (Hayaatsu et al., 1999). أما بكتيريا جنس Rhizobium، السلالة AC100، المستخدمة لتحويل الكارباميل إلى 1-نفثول، فتحتوي على البلازميد pAC200، الذي يحمل جين cehA الذي يرمز إلى CH كجزء من ناقل Tnceh محاط بتسلسلات شبيهة بعناصر الإدخال (istA وistB) (Hashimoto et al., 2002). في سلالة Sphingomonas CF06، يُعتقد أن جين تحلل الكارباميل موجود في خمسة بلازميدات: pCF01، وpCF02، وpCF03، وpCF04، وpCF05. ويُشير التشابه العالي في الحمض النووي لهذه البلازميدات إلى حدوث تضاعف جيني (Feng et al., 1997). وفي كائن حيّ مُتَكافل مُحلل للكارباميل، مُكوّن من نوعين من Pseudomonas، تحتوي السلالة 50581 على بلازميد مُتَزاوج pCD1 (50 كيلوبايت) يُشفّر جين هيدرولاز الكارباميل mcd، بينما يُشفّر البلازميد المُتَزاوج في السلالة 50552 إنزيمًا مُحللًا لـ 1-نفثول (Chapalamadugu and Chaudhry, 1991). في سلالة Achromobacter WM111، يقع جين هيدرولاز فورادان mcd على بلازميد بحجم 100 كيلوبايت (pPDL11). وقد ثبت وجود هذا الجين على بلازميدات مختلفة (100، 105، 115، أو 124 كيلوبايت) في أنواع مختلفة من البكتيريا من مناطق جغرافية متباينة (Parekh et al., 1995). أما في Pseudomonas sp. C5pp، فتقع جميع الجينات المسؤولة عن تحلل الكارباميل في جينوم يمتد على تسلسل بطول 76.3 كيلوبايت (Trivedi et al., 2016). كشف تحليل الجينوم (6.15 ميجابايت) عن وجود 42 عنصرًا جينيًا متحركًا (MGEs) و36 عنصرًا جينيًا تفاعليًا (GEIs)، منها 17 عنصرًا جينيًا متحركًا تقع في الجزء الفائق A (76.3 كيلوبايت) بمتوسط ​​محتوى غير متماثل من الجوانين والسيتوزين (54-60 مول%)، مما يشير إلى احتمالية حدوث انتقال جيني أفقي (تريفيدي وآخرون، 2016). ويُظهر سلالة P. putida XWY-1 ترتيبًا مشابهًا لجينات تحلل الكارباميل، ولكن هذه الجينات تقع على بلازميد (تشو وآخرون، 2019).
بالإضافة إلى الكفاءة الأيضية على المستويين البيوكيميائي والجيني، تُظهر الكائنات الحية الدقيقة أيضًا خصائص أو استجابات أخرى مثل الانجذاب الكيميائي، وخصائص تعديل سطح الخلية، والتجزئة، والاستخدام التفضيلي، وإنتاج المواد الفعالة بالسطح الحيوي، وما إلى ذلك، مما يساعدها على استقلاب الملوثات العطرية بشكل أكثر كفاءة في البيئات الملوثة (الشكل 7).
الشكل 7. استراتيجيات الاستجابة الخلوية المختلفة للبكتيريا المثالية لتحليل الهيدروكربونات العطرية من أجل التحلل البيولوجي الفعال للمركبات الملوثة الغريبة.
تُعتبر الاستجابات الكيميائية من العوامل التي تُعزز تحلل الملوثات العضوية في النظم البيئية الملوثة بشكل غير متجانس. وقد أظهرت دراسة (2002) أن انجذاب بكتيريا Pseudomonas sp. G7 نحو النفتالين يزيد من معدل تحلله في الأنظمة المائية. وقد حلل السلالة البرية G7 النفتالين بسرعة أكبر بكثير من سلالة متحولة تفتقر إلى الانجذاب الكيميائي. ووجد أن بروتين NahY (المكون من 538 حمضًا أمينيًا ذو بنية غشائية) يُنسخ بالتزامن مع جينات مسار الميتاكليفز على بلازميد NAH7، ومثل مُحولات الانجذاب الكيميائي، يبدو أن هذا البروتين يعمل كمستقبل كيميائي لتحلل النفتالين (Grimm and Harwood 1997). وأظهرت دراسة أخرى أجراها Hansel وآخرون (2009) أن البروتين جاذب كيميائيًا، لكن معدل تحلله مرتفع. أظهرت دراسة أجريت عام 2011 استجابةً كيميائيةً لبكتيريا الزائفة (P. putida) تجاه غاز النفثالين، حيث أدى انتشار الغاز إلى تدفق مستمر للنفثالين إلى الخلايا، مما ساهم في التحكم في هذه الاستجابة. استغل الباحثون هذا السلوك الكيميائي لهندسة ميكروبات تُعزز معدل التحلل. وقد أظهرت الدراسات أن المسارات الكيميائية الحسية تُنظم أيضًا وظائف خلوية أخرى، مثل انقسام الخلايا، وتنظيم دورة الخلية، وتكوين الأغشية الحيوية، مما يُساعد في التحكم في معدل التحلل. مع ذلك، فإن تسخير هذه الخاصية (الانجذاب الكيميائي) لتحقيق تحلل فعال يواجه عدة عقبات، أبرزها: (أ) تعرف مستقبلات متماثلة مختلفة على نفس المركبات/الروابط؛ (ب) وجود مستقبلات بديلة، مثل الانجذاب الطاقي؛ (ج) اختلافات كبيرة في تسلسل المجالات الحسية لنفس عائلة المستقبلات. (د) نقص المعلومات حول البروتينات الحسية البكتيرية الرئيسية (أورتيغا وآخرون، 2017؛ مارتن-مورا وآخرون، 2018). في بعض الأحيان، ينتج عن التحلل البيولوجي للهيدروكربونات العطرية نواتج أيضية/وسيطة متعددة، قد تكون جاذبة كيميائيًا لمجموعة من البكتيريا، ولكنها طاردة لمجموعات أخرى، مما يزيد من تعقيد العملية. لتحديد تفاعلات الروابط (الهيدروكربونات العطرية) مع المستقبلات الكيميائية، قمنا بإنشاء بروتينات حسية هجينة (PcaY وMcfR وNahY) عن طريق دمج نطاقات الاستشعار والإشارة لبكتيريا Pseudomonas putida وEscherichia coli، والتي تستهدف مستقبلات الأحماض العطرية، ووسائط دورة حمض الستريك، والنفثالين، على التوالي (لو وآخرون، 2019).
تحت تأثير النفثالين والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات الأخرى، تخضع بنية الغشاء البكتيري وسلامة الكائنات الدقيقة لتغيرات كبيرة. وقد أظهرت الدراسات أن النفثالين يعيق تفاعل السلسلة الأسيلية من خلال التفاعلات الكارهة للماء، مما يزيد من انتفاخ الغشاء وسيولته (سيكيما وآخرون، 1995). ولمواجهة هذا التأثير الضار، تنظم البكتيريا سيولة الغشاء عن طريق تغيير نسبة وتركيب الأحماض الدهنية المتفرعة السلسلة من نوعي إيزو وأنتي إيزو، وتحويل الأحماض الدهنية غير المشبعة من نوع سيس إلى نظائرها من نوع ترانس (هايبيبر ودي بونت، 1994). في بكتيريا Pseudomonas stutzeri المُنمّاة على النفثالين، ارتفعت نسبة الأحماض الدهنية المشبعة إلى غير المشبعة من 1.1 إلى 2.1، بينما ارتفعت هذه النسبة في بكتيريا Pseudomonas JS150 من 7.5 إلى 12.0 (Mrozik et al., 2004). عند نموها على النفثالين، أظهرت خلايا Achromobacter KAs 3–5 تجمعات خلوية حول بلورات النفثالين وانخفاضًا في شحنة سطح الخلية (من -22.5 إلى -2.5 ملي فولت) مصحوبًا بتكثف السيتوبلازم وتكوّن الفجوات، مما يشير إلى تغيرات في بنية الخلية وخصائص سطحها (Mohapatra et al., 2019). على الرغم من أن التغيرات الخلوية/السطحية ترتبط ارتباطًا مباشرًا بتحسين امتصاص الملوثات العطرية، إلا أن استراتيجيات الهندسة الحيوية ذات الصلة لم تُحسّن بشكل كامل. نادرًا ما استُخدم التلاعب بشكل الخلية لتحسين العمليات البيولوجية (Volke and Nikel, 2018). يؤدي حذف الجينات المؤثرة على انقسام الخلايا إلى تغييرات في شكلها. في بكتيريا Bacillus subtilis، ثبت أن بروتين الحاجز الخلوي SepF يشارك في تكوين الحاجز وهو ضروري للخطوات اللاحقة من انقسام الخلية، ولكنه ليس جينًا أساسيًا. وقد أدى حذف الجينات التي تشفر إنزيمات تحلل السكريات الببتيدية في بكتيريا Bacillus subtilis إلى استطالة الخلايا، وزيادة معدل النمو النوعي، وتحسين قدرة إنتاج الإنزيم (Cui et al., 2018).
تم اقتراح تقسيم مسار تحلل الكارباميل لتحقيق تحلل فعال لسلالتيّ الزائفة C5pp وC7 (كاميني وآخرون، 2018). ويُفترض أن الكارباميل يُنقل إلى الحيز المحيط بالبلازما عبر الحاجز الغشائي الخارجي و/أو عبر البورينات القابلة للانتشار. إنزيم CH هو إنزيم موجود في الحيز المحيط بالبلازما، ويحفز تحلل الكارباميل إلى 1-نفثول، وهو مركب أكثر استقرارًا وكراهية للماء وسمية. يتمركز إنزيم CH في الحيز المحيط بالبلازما، وله ألفة منخفضة للكارباميل، مما يتحكم في تكوين 1-نفثول، وبالتالي يمنع تراكمه في الخلايا ويقلل من سميته لها (كاميني وآخرون، 2018). يتم نقل 1-نفثول الناتج إلى السيتوبلازم عبر الغشاء الداخلي عن طريق التقسيم و/أو الانتشار، ثم يتم هيدروكسيله إلى 1،2-ثنائي هيدروكسي نفثالين بواسطة الإنزيم عالي الألفة 1NH لمزيد من الأيض في مسار الكربون المركزي.
على الرغم من امتلاك الكائنات الدقيقة القدرات الجينية والأيضية اللازمة لتحليل مصادر الكربون الغريبة، إلا أن الترتيب الهرمي لاستخدامها (أي الاستخدام التفضيلي لمصادر الكربون البسيطة على المعقدة) يُشكل عائقًا رئيسيًا أمام التحلل البيولوجي. يؤدي وجود مصادر الكربون البسيطة واستخدامها إلى تثبيط الجينات المسؤولة عن ترميز الإنزيمات التي تُحلل مصادر الكربون المعقدة/غير المفضلة، مثل الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات. ومن الأمثلة المدروسة جيدًا، أنه عند تغذية بكتيريا الإشريكية القولونية بالجلوكوز واللاكتوز معًا، يتم استخدام الجلوكوز بكفاءة أعلى من اللاكتوز (جاكوب ومونود، 1965). وقد أُبلغ عن قدرة بكتيريا الزائفة على تحليل مجموعة متنوعة من الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات والمركبات الغريبة كمصادر للكربون. ويتمثل الترتيب الهرمي لاستخدام مصادر الكربون في بكتيريا الزائفة في: الأحماض العضوية > الجلوكوز > المركبات العطرية (هايليمون وفيبس، 1972؛ كولير وآخرون، 1996). ومع ذلك، هناك استثناء. ومن المثير للاهتمام أن بكتيريا Pseudomonas sp. CSV86 تُظهر بنية هرمية فريدة، حيث تستخدم الهيدروكربونات العطرية (حمض البنزويك، والنفثالين، وغيرها) بشكل تفضيلي بدلاً من الجلوكوز، وتُجري استقلابًا مشتركًا للهيدروكربونات العطرية مع الأحماض العضوية (Basu et al., 2006). في هذه البكتيريا، لا تتأثر جينات تحلل ونقل الهيدروكربونات العطرية سلبًا حتى في وجود مصدر كربوني ثانٍ مثل الجلوكوز أو الأحماض العضوية. عند زراعتها في وسط يحتوي على الجلوكوز والهيدروكربونات العطرية، لوحظ انخفاض في مستوى التعبير الجيني لجينات نقل الجلوكوز واستقلابه، واستخدام الهيدروكربونات العطرية في المرحلة اللوغاريتمية الأولى، واستخدام الجلوكوز في المرحلة اللوغاريتمية الثانية (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). من ناحية أخرى، لم يؤثر وجود الأحماض العضوية على التعبير عن استقلاب الهيدروكربونات العطرية، لذلك من المتوقع أن تكون هذه البكتيريا سلالة مرشحة لدراسات التحلل البيولوجي (Phale et al.، 2020).
من المعروف أن التحول الحيوي للهيدروكربونات قد يُسبب الإجهاد التأكسدي وزيادة نشاط الإنزيمات المضادة للأكسدة في الكائنات الدقيقة. ويؤدي عدم كفاءة التحلل الحيوي للنفثالين، سواء في خلايا الطور الثابت أو في وجود مركبات سامة، إلى تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) (كانغ وآخرون، 2006). ولأن الإنزيمات المُحللة للنفثالين تحتوي على تجمعات من الحديد والكبريت، فإنه في ظل الإجهاد التأكسدي، يتأكسد الحديد الموجود في الهيم والبروتينات الحديدية الكبريتية، مما يؤدي إلى تعطيل البروتين. ويقوم إنزيم مختزلة الفيريدوكسين-NADP+ (Fpr)، إلى جانب إنزيم ديسموتاز الفائق (SOD)، بالتوسط في تفاعل الأكسدة والاختزال العكسي بين NADP+/NADPH وجزيئين من الفيريدوكسين أو الفلافودوكسين، وبالتالي التخلص من أنواع الأكسجين التفاعلية واستعادة مركز الحديد والكبريت في ظل الإجهاد التأكسدي (لي وآخرون، 2006). أُفيد بأن الإجهاد التأكسدي يحفز كلاً من إنزيم Fpr وإنزيم SodA (SOD) في بكتيريا الزائفة، ولوحظ ارتفاع في نشاط إنزيمي SOD والكاتالاز في أربع سلالات من الزائفة (O1، W1، As1، وG1) أثناء نموها في ظروف تحتوي على النفثالين (كانغ وآخرون، 2006). وأظهرت الدراسات أن إضافة مضادات الأكسدة، مثل حمض الأسكوربيك أو الحديدوز (Fe2+)، تزيد من معدل نمو البكتيريا في وسط يحتوي على النفثالين. فعندما نمت بكتيريا رودوكوكوس إريثروبوليس في وسط يحتوي على النفثالين، ازداد نسخ جينات السيتوكروم P450 المرتبطة بالإجهاد التأكسدي، بما في ذلك sodA (ديسموتاز الفائق الأكسيد الحديدي/المنغنيزي)، وsodC (ديسموتاز الفائق الأكسيد النحاسي/الزنكي)، وrecA (سازيكين وآخرون، 2019). أظهر التحليل البروتيني الكمي المقارن لخلايا الزائفة المزروعة في النفثالين أن زيادة تنظيم البروتينات المختلفة المرتبطة باستجابة الإجهاد التأكسدي هي استراتيجية للتكيف مع الإجهاد (Herbst et al., 2013).
أُفيد أن الكائنات الدقيقة تُنتج مواد فعالة سطحية حيوية تحت تأثير مصادر الكربون الكارهة للماء. هذه المواد الفعالة سطحية هي مركبات فعالة سطحية ذات طبيعة مزدوجة، قادرة على تكوين تجمعات عند أسطح التماس بين الزيت والماء أو الهواء والماء. يُعزز هذا التجمع عملية الذوبان الزائف ويُسهل امتصاص الهيدروكربونات العطرية، مما يؤدي إلى تحلل حيوي فعال (رحمن وآخرون، 2002). وبفضل هذه الخصائص، تُستخدم المواد الفعالة سطحية الحيوية على نطاق واسع في مختلف الصناعات. يُمكن أن تُحسّن إضافة المواد الفعالة سطحية الكيميائية أو الحيوية إلى مزارع البكتيريا من كفاءة وسرعة تحلل الهيدروكربونات. ومن بين المواد الفعالة سطحية الحيوية، حظيت الرامنوليبيدات التي تُنتجها بكتيريا الزائفة الزنجارية بدراسة وتوصيف مُستفيضين (هيساتسوكا وآخرون، 1971؛ رحمن وآخرون، 2002). بالإضافة إلى ذلك، تشمل أنواع أخرى من المواد الفعالة سطحياً الحيوية: الليبوببتيدات (الميوسينات من بكتيريا الزائفة المتألقة)، والمستحلب 378 (من بكتيريا الزائفة المتألقة) (روزنبرغ ورون، 1999)، ودهون ثنائي السكاريد من التريهالوز من بكتيريا الرودوكوكوس (رامدال، 1985)، والليكنين من بكتيريا العصوية (ساراسواتي وهالبرغ، 2002)، والمواد الفعالة سطحياً من بكتيريا العصوية الرقيقة (سيغموند وواغنر، 1991) وبكتيريا العصوية المحللة للنشا (زي وآخرون، 2017). وقد ثبت أن هذه المواد الفعالة سطحياً القوية تقلل التوتر السطحي من 72 داين/سم إلى أقل من 30 داين/سم، مما يسمح بامتصاص أفضل للهيدروكربونات. أُفيد بأن أنواعًا بكتيرية أخرى، مثل الزائفة، والعصوية، والرودوكوكوس، والبوركولديريا، قادرة على إنتاج مواد فعالة سطحية حيوية متنوعة، تعتمد على الرامنوليبيدات والجليكوليبيدات، عند زراعتها في أوساط تحتوي على النفثالين وميثيل النفثالين (كانغا وآخرون، 1997؛ بونتوس وآخرون، 2005). كما أن بكتيريا الزائفة المالتوفيليا CSV89 قادرة على إنتاج مادة فعالة سطحية حيوية خارج الخلية تُسمى Biosur-Pm عند زراعتها على مركبات عطرية مثل حمض النفثويك (فال وآخرون، 1995). وأظهرت حركية تكوين Biosur-Pm أن عملية تصنيعه تعتمد على النمو ودرجة الحموضة. وقد وُجد أن كمية Biosur-Pm التي تنتجها الخلايا عند درجة حموضة متعادلة أعلى منها عند درجة حموضة 8.5. كانت الخلايا التي نُمت عند درجة حموضة 8.5 أكثر كراهية للماء، ولها ألفة أكبر للمركبات العطرية والأليفاتية، مقارنةً بالخلايا التي نُمت عند درجة حموضة 7.0. في بكتيريا رودوكوكوس N6، تُعد نسبة الكربون إلى النيتروجين المرتفعة (C:N) ونقص الحديد من الظروف المثلى لإنتاج المواد الفعالة سطحيًا خارج الخلية (موتاليك وآخرون، 2008). وقد بُذلت محاولات لتحسين التخليق الحيوي للمواد الفعالة سطحيًا (السورفاكتينات) من خلال تحسين السلالات وعمليات التخمر. ومع ذلك، فإن تركيز المادة الفعالة سطحيًا في وسط الاستنبات منخفض (1.0 غ/لتر)، مما يُشكل تحديًا للإنتاج على نطاق واسع (جياو وآخرون، 2017؛ وو وآخرون، 2019). لذلك، استُخدمت أساليب الهندسة الوراثية لتحسين تخليقها الحيوي. مع ذلك، يُعدّ تعديلها هندسيًا أمرًا صعبًا نظرًا لكبر حجم الأوبيرون (حوالي 25 كيلوبايت) والتنظيم الحيوي المعقد لنظام استشعار النصاب (جياو وآخرون، 2017؛ وو وآخرون، 2019). وقد أُجريت عدة تعديلات هندسية وراثية على بكتيريا العصوية، بهدف رئيسي هو زيادة إنتاج السورفاكتين عن طريق استبدال المحفز (أوبيرون srfA)، والإفراط في التعبير عن بروتين تصدير السورفاكتين YerP، والعوامل التنظيمية ComX وPhrC (جياو وآخرون، 2017). إلا أن هذه الطرق الهندسية الوراثية لم تُحقق سوى تعديل وراثي واحد أو بضعة تعديلات، ولم تصل بعد إلى مرحلة الإنتاج التجاري. لذا، فإن إجراء المزيد من الدراسات حول أساليب التحسين القائمة على المعرفة أمر ضروري.
تُجرى دراسات التحلل البيولوجي للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات بشكل رئيسي في ظروف المختبر القياسية. ومع ذلك، في المواقع الملوثة أو البيئات الملوثة، تبين أن العديد من العوامل اللاأحيائية والأحيائية (درجة الحرارة، ودرجة الحموضة، والأكسجين، وتوافر المغذيات، والتوافر البيولوجي للركيزة، والمواد الغريبة الأخرى، وتثبيط المنتج النهائي، وما إلى ذلك) تُغير وتؤثر على قدرة الكائنات الحية الدقيقة على التحلل.
تؤثر درجة الحرارة بشكل كبير على التحلل البيولوجي للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات. فمع ارتفاع درجة الحرارة، ينخفض ​​تركيز الأكسجين المذاب، مما يؤثر على استقلاب الكائنات الحية الدقيقة الهوائية، إذ تحتاج هذه الكائنات إلى الأكسجين الجزيئي كأحد الركائز الأساسية للأكسيجينازات التي تُجري تفاعلات الهيدروكسيل أو انشطار الحلقة. ومن الملاحظ أن ارتفاع درجة الحرارة يحول الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات الأصلية إلى مركبات أكثر سمية، مما يُعيق التحلل البيولوجي (مولر وآخرون، 1998).
لوحظ أن العديد من المواقع الملوثة بالهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAHs) تتميز بقيم حموضة متطرفة، مثل مواقع تصريف المياه الحمضية من المناجم (الأس الهيدروجيني 1-4) ومواقع تغويز الغاز الطبيعي/الفحم الملوثة بالرشاحة القلوية (الأس الهيدروجيني 8-12). تؤثر هذه الظروف بشكل خطير على عملية التحلل البيولوجي. لذا، قبل استخدام الكائنات الدقيقة في المعالجة البيولوجية، يُنصح بضبط الأس الهيدروجيني بإضافة مواد كيميائية مناسبة (ذات جهد أكسدة-اختزال متوسط ​​إلى منخفض جدًا) مثل كبريتات الأمونيوم أو نترات الأمونيوم للتربة القلوية، أو إضافة الجير باستخدام كربونات الكالسيوم أو كربونات المغنيسيوم للمواقع الحمضية (Bowlen et al. 1995; Gupta and Sar 2020).
يُعدّ توفير الأكسجين للمنطقة المتضررة العامل المحدد لمعدل التحلل البيولوجي للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات. ونظرًا لظروف الأكسدة والاختزال في البيئة، تتطلب عمليات المعالجة البيولوجية في الموقع عادةً إدخال الأكسجين من مصادر خارجية (مثل الحراثة، وضخ الهواء، وإضافة المواد الكيميائية) (بارديك وآخرون، 1992). وقد أثبت أودينكرانز وآخرون (1996) أن إضافة بيروكسيد المغنيسيوم (مركب مُطلق للأكسجين) إلى طبقة مياه جوفية ملوثة يمكن أن تُعالج مركبات BTEX بيولوجيًا بكفاءة. كما بحثت دراسة أخرى التحلل البيولوجي للفينول وBTEX في طبقة مياه جوفية ملوثة عن طريق حقن نترات الصوديوم وإنشاء آبار استخراج لتحقيق معالجة بيولوجية فعالة (بيولي وويب، 2001).