العنوان الحالي: كولونيا 50931، ألمانيا، مجموعة كولونيا للتميز البحثي حول استجابة الإجهاد الخلوي في الأمراض المرتبطة بالشيخوخة (CECAD).
يُعتبر التنكس العصبي الناتج عن أمراض الميتوكوندريا غير قابل للعكس نظرًا لمحدودية المرونة الأيضية للخلايا العصبية، إلا أن تأثير خلل الميتوكوندريا على استقلالية استقلاب الخلايا العصبية في الجسم لا يزال غير مفهوم بشكل كافٍ. في هذه الدراسة، نقدم البروتينات الخاصة بخلايا بوركنجي العصبية التي تعاني من نقص تدريجي في الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) نتيجة لاضطراب ديناميكيات اندماج الميتوكوندريا. وقد وجدنا أن خلل الميتوكوندريا يُحدث تغييرًا جذريًا في مجال البروتينات، مما يؤدي في النهاية إلى التنشيط المتسلسل لبرامج أيضية دقيقة قبل موت الخلية. وبشكل غير متوقع، لاحظنا تحفيزًا واضحًا لإنزيم بيروفات كاربوكسيلاز (PCx) وإنزيمات أخرى مضادة للشيخوخة تُكمل وسائط دورة حمض الستريك (TCA). وقد أدى تثبيط إنزيم PCx إلى تفاقم الإجهاد التأكسدي والتنكس العصبي، مما يشير إلى أن تصلب الشرايين له تأثير وقائي على الخلايا العصبية التي تفتقر إلى الفسفرة التأكسدية. إن استعادة اندماج الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المتضررة نهائيًا يعكس تمامًا هذه الخصائص الأيضية، وبالتالي يمنع موت الخلايا. تحدد نتائجنا مسارات غير معروفة سابقًا تمنح الخلايا مرونة في مواجهة خلل الميتوكوندريا، وتُظهر أن التنكس العصبي قابل للعكس حتى في المراحل المتأخرة من المرض.
يتجلى الدور المحوري للميتوكوندريا في الحفاظ على استقلاب الطاقة في الخلايا العصبية من خلال الأعراض العصبية الواسعة النطاق المرتبطة بأمراض الميتوكوندريا لدى الإنسان. ينجم معظم هذه الأمراض عن طفرات جينية تنظم التعبير الجيني للميتوكوندريا (1، 2) أو عن تلف الجينات المرتبط بديناميكيات الميتوكوندريا، مما يؤثر بشكل غير مباشر على استقرار الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) (3، 4). أظهرت الدراسات على نماذج حيوانية أنه استجابةً لاختلال وظائف الميتوكوندريا في الأنسجة المحيطة، يمكن تنشيط مسارات أيضية محافظة (5-7)، مما يوفر معلومات مهمة لفهم معمق لآلية حدوث هذه الأمراض المعقدة. في المقابل، يُعد فهمنا للتغيرات الأيضية في أنواع خلايا محددة نتيجةً للفشل العام في إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) في ميتوكوندريا الدماغ أمرًا أساسيًا (8)، مما يؤكد الحاجة إلى تحديد أهداف علاجية يمكن استخدامها للوقاية من الأمراض أو منع التنكس العصبي (9). يكمن نقص المعلومات في أن الخلايا العصبية تُعتبر عمومًا ذات مرونة أيضية محدودة للغاية مقارنةً بأنواع الخلايا في الأنسجة المحيطة (10). ونظرًا لأن هذه الخلايا تلعب دورًا محوريًا في تنسيق إمداد الخلايا العصبية بالمواد الأيضية لتعزيز النقل المشبكي والاستجابة لحالات الإصابة والمرض، فإن قدرة الخلايا على تكييف أيضها مع الظروف الصعبة لأنسجة الدماغ تكاد تقتصر على الخلايا الدبقية (11-14). إضافةً إلى ذلك، فإن التباين الخلوي المتأصل في أنسجة الدماغ يعيق إلى حد كبير دراسة التغيرات الأيضية التي تحدث في مجموعات فرعية عصبية محددة. ونتيجةً لذلك، لا يُعرف إلا القليل عن العواقب الخلوية والأيضية الدقيقة لاختلال وظائف الميتوكوندريا في الخلايا العصبية.
لفهم التداعيات الأيضية لاختلال وظائف الميتوكوندريا، قمنا بعزل خلايا بوركنجي العصبية في مراحل مختلفة من التنكس العصبي الناجم عن تدمير بروتين Mfn2 المسؤول عن اندماج الغشاء الخارجي للميتوكوندريا. على الرغم من أن طفرات Mfn2 لدى البشر ترتبط بنوع من الاعتلال العصبي الحركي الحسي الوراثي المعروف باسم شاركو-ماري-توث من النوع 2A (15)، فإن التدمير المشروط لبروتين Mfn2 في الفئران يُعد آلية معروفة لتحفيز خلل في عملية الفسفرة التأكسدية. تترافق الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا العصبية (16-19) والنمط الظاهري التنكسي العصبي الناتج مع أعراض عصبية متفاقمة، مثل اضطرابات الحركة (18، 19) أو ترنح المخيخ (16). باستخدام مزيج من تقنيات البروتينات الكمية غير الموسومة (LFQ)، وعلم الأيض، والتصوير، والأساليب الفيروسية، أظهرنا أن التنكس العصبي التدريجي يحفز بقوة إنزيم بيروفات كاربوكسيلاز (PCx) وعوامل أخرى متورطة في تصلب الشرايين في الخلايا العصبية المحيطية في الجسم الحي. وللتحقق من أهمية هذه النتيجة، قمنا بتثبيط التعبير عن PCx بشكل خاص في الخلايا العصبية المحيطية التي تعاني من نقص Mfn2، ووجدنا أن هذه العملية فاقمت الإجهاد التأكسدي وعجلت التنكس العصبي، مما يثبت أن انعدام النطاف يؤدي إلى موت الخلايا. كما أن التعبير الشديد عن MFN2 يمكن أن ينقذ تمامًا الخلايا العصبية المحيطية المتنكسة في مراحلها النهائية والتي تعاني من نقص حاد في الفسفرة التأكسدية، واستهلاك هائل للحمض النووي للميتوكوندريا، وشبكة ميتوكوندريا متضررة بشكل واضح، مما يؤكد أن هذا النوع من التنكس العصبي يمكن أن يتعافى حتى في المراحل المتقدمة من المرض قبل موت الخلايا.
بهدف تصوير الميتوكوندريا في الخلايا العصبية الهرمية (PNs) المُعدّلة جينيًا بحذف جين Mfn2، استخدمنا سلالة من الفئران تسمح للميتوكوندريا المعتمدة على إنزيم Cre باستهداف بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP) (mtYFP) (20) والتعبير عن Cre، وفحصنا مورفولوجيا الميتوكوندريا في الجسم الحي. وجدنا أن تعطيل جين Mfn2 في الخلايا العصبية الهرمية يؤدي إلى انقسام تدريجي لشبكة الميتوكوندريا (الشكل S1A)، وقد لوحظ أول تغيير في عمر 3 أسابيع. في المقابل، لم يبدأ التدهور الكبير في طبقة خلايا PN، كما يتضح من فقدان التلوين المناعي للكالبيندين، إلا في عمر 12 أسبوعًا (الشكل 1، A وB). دفعنا التباين الزمني بين أول تغيرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا وبداية موت الخلايا العصبية إلى دراسة التغيرات الأيضية الناجمة عن خلل الميتوكوندريا قبل موت الخلايا. طوّرنا استراتيجية فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) لعزل الخلايا العصبية الهرمية (PN) المُعبِّرة عن بروتين YFP (YFP+) (الشكل 1C)، وفي فئران ضابطة (Mfn2+/loxP::mtYFP loxP-stop-loxP::L7-cre)، والتي يُشار إليها فيما يلي بـ CTRL (الشكل S1B). سمح لنا تحسين استراتيجية الفرز، بناءً على الشدة النسبية لإشارة YFP، بتنقية الجسم المُعبِّر عن YFP+ (YFPhigh) في الخلايا العصبية الهرمية من الخلايا غير الهرمية (YFPneg) (الشكل S1B) أو أجزاء المحاور/التغصنات العصبية المُفترضة المُشعّة (YFPlow؛ الشكل S1D، يسار)، وهو ما تم تأكيده بواسطة المجهر متحد البؤر (الشكل S1D، يمين). وللتحقق من هوية المجموعة المصنفة، أجرينا تحليلًا بروتينيًا باستخدام تقنية LFQ، ثم تحليل المكونات الرئيسية، ووجدنا فصلًا واضحًا بين خلايا YFPhigh وخلايا YFPneg (الشكل S1C). أظهرت خلايا YFPhigh زيادة صافية في مؤشرات الخلايا العصبية الهرمية المعروفة (مثل Calb1 وPcp2 وGrid2 وItpr3) (21، 22)، ولكن لم تُلاحظ زيادة في البروتينات الشائعة التعبير في الخلايا العصبية أو أنواع الخلايا الأخرى (الشكل 1D). وأظهرت مقارنة بين عينات خلايا YFPhigh المصنفة، التي جُمعت في تجارب مستقلة، معامل ارتباط أكبر من 0.9، مما يدل على قابلية تكرار جيدة بين النسخ البيولوجية (الشكل S1E). باختصار، أكدت هذه البيانات صحة خطتنا للعزل الحاد والمحدد للخلايا العصبية الهرمية الممكنة. ولأن نظام L7-cre المُستخدم يُحفز إعادة التركيب الفسيفسائي في الأسبوع الأول بعد الولادة (23)، بدأنا باستبعاد الفئران من مجموعتي التحكم (CTRL) والفئران المُعدلة وراثيًا (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) لجمع الخلايا العصبية. وبعد اكتمال إعادة التركيب، تُسمى هذه الفئران Mfn2cKO عند بلوغها أربعة أسابيع من العمر. اخترنا الأسبوع الثامن من العمر كنقطة نهاية، حيث كانت طبقة النواة المحيطة بالبطين سليمة رغم التفتت الواضح للميتوكوندريا (الشكل 1ب والشكل S1أ). قمنا بقياس 3013 بروتينًا كميًا، منها حوالي 22% استنادًا إلى بيانات MitoCarta 2.0 المُستندة إلى بروتيوم الميتوكوندريا (الشكل 1هـ) (24). أظهر تحليل التعبير الجيني التفاضلي الذي أُجري في الأسبوع الثامن أن 10.5% فقط من جميع البروتينات شهدت تغيرات ملحوظة (الشكل 1و والشكل S1و)، منها 195 بروتينًا انخفض تعبيرها و120 بروتينًا ارتفع تعبيرها (الشكل 1و). تجدر الإشارة إلى أن "تحليل المسارات المبتكرة" لهذه البيانات يُظهر أن الجينات المُعبَّر عنها تفاضليًا تنتمي في الغالب إلى مجموعة محدودة من مسارات أيضية مُحددة (الشكل 1ز). ومن المثير للاهتمام، أنه على الرغم من أن انخفاض تنظيم المسارات المتعلقة بالفسفرة التأكسدية وإشارات الكالسيوم يؤكد حدوث خلل في وظائف الميتوكوندريا في الخلايا العصبية الطرفية التي تعاني من نقص في الاندماج، إلا أن فئات أخرى تشمل بشكل أساسي استقلاب الأحماض الأمينية ترتفع بشكل ملحوظ، وهو ما يتوافق مع عملية الأيض التي تحدث في الخلايا العصبية الطرفية الميتوكوندرية.
(أ) صور مجهرية بؤرية نموذجية لمقاطع مخيخية من فئران CTRL وفئران Mfn2cKO تُظهر فقدانًا تدريجيًا للخلايا العصبية البوركنجية (كالبايندين، رمادي)؛ تم تلوين النوى بصبغة DAPI. (ب) قياس كمي لـ (أ) (تحليل التباين أحادي الاتجاه، ***P<0.001؛ ن = 4 إلى 6 دوائر من ثلاثة فئران). (ج) سير العمل التجريبي. (د) خريطة حرارية لتوزيع المؤشرات الخاصة بخلايا بوركنجي (أعلى) وأنواع الخلايا الأخرى (وسط). (هـ) مخطط فين يوضح عدد بروتينات الميتوكوندريا التي تم تحديدها في الخلايا العصبية البوركنجية المصنفة. (و) مخطط فولكانو للبروتينات المُعبر عنها بشكل مختلف في عصبونات Mfn2cKO عند 8 أسابيع (قيمة قطع الدلالة 1.3). (ز) يُظهر تحليل مسار الإبداع أهم خمسة مسارات تنظيمية تصاعدية (أحمر) وتنازلية (أزرق) في الخلايا العصبية البوركنجية Mfn2cKO المصنفة عند 8 أسابيع. يُعرض متوسط ​​مستوى التعبير لكل بروتين تم الكشف عنه. خريطة حرارية بتدرج الرمادي: قيمة P مُعدّلة. ns، غير مهم.
أظهرت بيانات البروتينات انخفاضًا تدريجيًا في التعبير البروتيني للمركبات I وIII وIV. احتوت جميع المركبات I وIII وIV على وحدات فرعية أساسية مشفرة بواسطة الحمض النووي للميتوكوندريا، بينما لم يتأثر المركب II، المشفر نوويًا فقط، بشكل أساسي (الشكل 2A والشكل S2A). وتماشيًا مع نتائج البروتينات، أظهر الفحص المناعي النسيجي لقطاعات أنسجة المخيخ انخفاضًا تدريجيًا في مستوى الوحدة الفرعية MTCO1 (الوحدة الفرعية 1 لأكسيداز السيتوكروم C الميتوكوندري) للمركب IV في PN (الشكل 2B). كما انخفضت الوحدة الفرعية Mtatp8 المشفرة بواسطة الحمض النووي للميتوكوندريا بشكل ملحوظ (الشكل S2A)، بينما ظل مستوى الوحدة الفرعية ATP synthase المشفرة نوويًا ثابتًا، وهو ما يتوافق مع استقرار مُركب التجميع الفرعي F1 المعروف لـ ATP synthase عند استقرار التعبير عن الحمض النووي للميتوكوندريا. أكد تقييم مستوى الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) في الخلايا العصبية الهرمية (PNs) المُفرزة من فئران Mfn2cKO باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) الانخفاض التدريجي في عدد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة، عند عمر 8 أسابيع، احتُفظ بنحو 20% فقط من مستوى الحمض النووي للميتوكوندريا (الشكل 2C). وتماشياً مع هذه النتائج، استُخدم تلوين الخلايا العصبية الهرمية (PNs) من فئران Mfn2cKO باستخدام المجهر متحد البؤر للكشف عن الحمض النووي، مما أظهر استهلاك نيوكليوتيدات الميتوكوندريا مع مرور الوقت (الشكل 2D). ووجدنا أن بعض المرشحين فقط، ممن لهم دور في تحلل بروتينات الميتوكوندريا والاستجابة للإجهاد، قد ارتفع مستوى تعبيرهم، بما في ذلك Lonp1 وAfg3l2 وClpx، وعوامل تجميع معقد الفسفرة التأكسدية. ولم تُلاحظ أي تغييرات ملحوظة في مستويات البروتينات المشاركة في موت الخلايا المبرمج (الشكل S2B). وبالمثل، وجدنا أن قنوات الميتوكوندريا والشبكة الإندوبلازمية المشاركة في نقل الكالسيوم لم تشهد سوى تغييرات طفيفة (الشكل S2C). بالإضافة إلى ذلك، لم يُظهر تقييم البروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي أي تغييرات جوهرية، وهو ما يتوافق مع الحث المرئي للجسيمات الالتهامية الذاتية الذي لوحظ في الجسم الحي بواسطة الكيمياء المناعية النسيجية والمجهر الإلكتروني (الشكل S3). ومع ذلك، فإن الخلل التدريجي في الفسفرة التأكسدية في الخلايا العصبية الهرمية يترافق مع تغييرات واضحة في البنية الدقيقة للميتوكوندريا. يمكن رؤية تجمعات الميتوكوندريا في أجسام الخلايا والأشجار الشجرية للخلايا العصبية الهرمية Mfn2cKO في عمر 5 و8 أسابيع، وقد خضعت بنية الغشاء الداخلي لتغييرات عميقة (الشكل S4، A وB). وتماشياً مع هذه التغييرات في البنية الدقيقة والانخفاض الكبير في الحمض النووي للميتوكوندريا، أظهر تحليل شرائح المخيخ الحادة باستخدام إستر ميثيل رباعي ميثيل رودامين (TMRM) أن جهد غشاء الميتوكوندريا في الخلايا العصبية الهرمية Mfn2cKO قد انخفض بشكل ملحوظ (الشكل S4C).
(أ) تحليل التغيرات الزمنية لمستوى التعبير عن مُركّب الفسفرة التأكسدية. يُؤخذ في الاعتبار فقط البروتينات التي تقل قيمة P لها عن 0.05 عند 8 أسابيع (تحليل التباين ثنائي الاتجاه). الخط المنقط: بدون تعديل مقارنةً بالمجموعة الضابطة. (ب) اليسار: مثال على مقطع من المخيخ مُوسَم بأجسام مضادة لـ MTCO1 (مقياس الرسم: 20 ميكرومتر). المنطقة التي تشغلها أجسام خلايا بوركنجي مُغطاة باللون الأصفر. اليمين: قياس مستويات MTCO1 (تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ عدد الخلايا المُحللة من 7 إلى 20 خلية من ثلاثة فئران). (ج) تحليل qPCR لعدد نسخ mtDNA في الخلايا العصبية المُفرزة (تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ عدد الفئران من 3 إلى 7). (د) اليسار: مثال على شريحة من المخيخ مُوسَمة بأجسام مضادة للحمض النووي (مقياس الرسم: 20 ميكرومتر). المنطقة التي تشغلها أجسام خلايا بوركنجي مُغطاة باللون الأصفر. على اليمين: قياس كمية تلف الحمض النووي للميتوكوندريا (تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ ن = 5 إلى 9 خلايا من ثلاثة فئران). (هـ) مثال على مقطع حاد من المخيخ يُظهر خلايا بوركنجي mitoYFP+ ​​(السهم) في تسجيل التثبيت الموضعي للخلية الكاملة. (و) قياس منحنى التيار-الجهد. (ز) تسجيلات نموذجية لحقن تيار إزالة الاستقطاب في خلايا بوركنجي CTRL وMfn2cKO. المسار العلوي: النبضة الأولى التي أدت إلى جهد الفعل. المسار السفلي: أقصى تردد لجهد الفعل. (ح) قياس كمية المدخلات التلقائية بعد المشبكية (sPSPs). يظهر مسار التسجيل النموذجي ونسبة التكبير في (ط). تم تحليل تحليل التباين أحادي الاتجاه لـ ن = 5 إلى 20 خلية من ثلاثة فئران. تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط؛ *P<0.05؛ **P<0.01؛ ***P<0.001. (J) نماذج تمثيلية لتدفقات جهد الفعل التلقائية المسجلة باستخدام تقنية التثبيت الموضعي المثقب. الرسم العلوي: أقصى تردد لتدفق جهد الفعل. الرسم السفلي: تكبير لتدفق جهد فعل واحد. (K) تحديد متوسط ​​وأقصى تردد لتدفق جهد الفعل وفقًا لـ (J). اختبار مان-ويتني؛ تم تحليل 5 خلايا من أربعة فئران. تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط؛ غير مهم.
تم رصد تلف واضح في عملية الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) في الخلايا العصبية الهرمية (PN) من فئران Mfn2cKO بعمر 8 أسابيع، مما يشير إلى وجود خلل وظيفي حاد في هذه الخلايا. ولذلك، قمنا بتحليل الخصائص الكهربائية السلبية للخلايا العصبية التي تعاني من نقص في الفسفرة التأكسدية في عمر 4 إلى 5 أسابيع، و7 إلى 8 أسابيع، وذلك بإجراء تسجيلات التثبيت الموضعي للخلية الكاملة في شرائح المخيخ الحادة (الشكل 2E). والمثير للدهشة، أن متوسط ​​جهد غشاء الراحة ومقاومة الدخل للخلايا العصبية Mfn2cKO كانا مماثلين للمجموعة الضابطة، على الرغم من وجود اختلافات طفيفة بين الخلايا (الجدول 1). وبالمثل، في عمر 4 إلى 5 أسابيع، لم تُلاحظ أي تغييرات جوهرية في منحنى التيار-الجهد (IV) (الشكل 2F). ومع ذلك، لم تنجُ أي من الخلايا العصبية Mfn2cKO في عمر 7 إلى 8 أسابيع من نظام IV (خطوة فرط الاستقطاب)، مما يدل على وجود حساسية واضحة لجهد فرط الاستقطاب في هذه المرحلة المتأخرة. على النقيض من ذلك، في خلايا Mfn2cKO العصبية، يتم تحمل تيارات إزالة الاستقطاب التي تُسبب تفريغات جهد الفعل المتكررة بشكل جيد، مما يشير إلى أن أنماط تفريغها العامة لا تختلف اختلافًا كبيرًا عن تلك الموجودة في الخلايا العصبية الضابطة بعمر 8 أسابيع (الجدول 1 والشكل 2G). وبالمثل، كان تردد وسعة تيارات ما بعد المشبك التلقائية (sPSCs) مماثلين لتلك الموجودة في المجموعة الضابطة، وازداد تردد الأحداث من 4 أسابيع إلى 5 أسابيع إلى 7 أسابيع إلى 8 أسابيع بزيادة مماثلة (الشكل 2، H وI). فترة النضج المشبكي في الخلايا العصبية الهرمية (25). تم الحصول على نتائج مماثلة بعد رقع الخلايا العصبية الهرمية المثقبة. يمنع هذا التكوين التعويض المحتمل لنقص ATP الخلوي، كما قد يحدث في تسجيل التثبيت الموضعي للخلية الكاملة. على وجه الخصوص، لم يتأثر جهد غشاء الراحة وتردد الإطلاق التلقائي لخلايا Mfn2cKO العصبية (الشكل 2، J وK). باختصار، تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا العصبية الهرمية التي تعاني من خلل واضح في الفسفرة التأكسدية يمكنها التعامل مع أنماط التفريغ عالية التردد بشكل جيد، مما يشير إلى وجود آلية تعويض تسمح لها بالحفاظ على استجابات كهروفيزيولوجية شبه طبيعية.
تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(تحليل التباين أحادي الاتجاه، اختبار هولم-سيداك للمقارنات المتعددة؛ *P<0.05). ويُشار إلى رقم الوحدة بين قوسين.
شرعنا في دراسة ما إذا كانت أي فئة في مجموعة بيانات البروتينات (الشكل 1G) تتضمن مسارات قادرة على مواجهة النقص الحاد في الفسفرة التأكسدية، مما يفسر قدرة الخلايا العصبية المصابة على الحفاظ على وظائف كهربائية شبه طبيعية (الشكل 2، من E إلى K). أظهر تحليل البروتينات ارتفاعًا ملحوظًا في مستويات الإنزيمات المشاركة في هدم الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة (BCAA) (الشكل 3A والشكل S5A)، وأن الناتج النهائي، أسيتيل مرافق الإنزيم-أ (CoA) أو سكسينيل مرافق الإنزيم-أ، يُمكنه تعويض ثلاثي الكربوكسيلات في دورة حمض الستريك (TCA) في تصلب الشرايين. وجدنا أن محتوى كل من ناقل أمين الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة 1 (BCAT1) وناقل أمين الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة 2 (BCAT2) قد ازداد. يحفز هذان الإنزيمان الخطوة الأولى من هدم الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة عن طريق توليد الغلوتامات من ألفا-كيتوغلوتارات (26). تزداد مستويات جميع الوحدات الفرعية المكونة لمركب نازعة هيدروجين حمض الكيتو المتفرع السلسلة (BCKD) (حيث يحفز هذا المركب عملية إزالة الكربوكسيل اللاحقة وغير القابلة للانعكاس من الهيكل الكربوني للأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة الناتجة) (الشكل 3أ والشكل S5أ). مع ذلك، لم تُلاحظ أي تغييرات واضحة في الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة نفسها في الخلايا العصبية المُفرزة، وهو ما قد يُعزى إلى زيادة امتصاص الخلايا لهذه الأحماض الأمينية الأساسية أو استخدام مصادر أخرى (الجلوكوز أو حمض اللاكتيك) لتكملة دورة حمض الستريك (الشكل S5ب). كما أظهرت الخلايا العصبية التي تفتقر إلى الفسفرة التأكسدية زيادة في تحلل الجلوتامين ونشاط نقل الأمين عند عمر 8 أسابيع، وهو ما ينعكس في زيادة مستويات إنزيمات الميتوكوندريا، الجلوتاميناز (GLS) وناقلة أمين الجلوتامين بيروفات 2 (GPT2) (الشكل 3، أ و ج). تجدر الإشارة إلى أن زيادة تنظيم GLS تقتصر على النظير المنسوخ من غلوتاميناز C (GLS-GAC) (التغير في Mfn2cKO/CTRL يبلغ حوالي 4.5 أضعاف، P = 0.05)، ويمكن أن تدعم زيادة تنظيمه المحددة في الأنسجة السرطانية الطاقة الحيوية للميتوكوندريا. (27).
(أ) تُظهر الخريطة الحرارية التغير النسبي في مستوى البروتين للمسار المحدد بعد 8 أسابيع. (ب) مثال على شريحة مخيخية مُوسومة بأجسام مضادة لـ PCx (مقياس الرسم: 20 ميكرومتر). يشير السهم الأصفر إلى جسم خلية بوركنجي. (ج) تحليل التعبير البروتيني على مدار الزمن، والذي تم تحديده كمرشح مهم لتصلب الشرايين (اختبار t متعدد، *FDR < 5%؛ ن = 3-5 فئران). (د) أعلاه: رسم تخطيطي يوضح الطرق المختلفة لدخول الكربون الموسوم الموجود في متتبع البيروفات [1-13C] (أي، عبر PDH أو عبر الشريان). أسفل: يوضح الرسم البياني الكماني النسبة المئوية للكربون الموسوم أحاديًا (M1) الذي تحول إلى حمض الأسبارتيك وحمض الستريك وحمض الماليك بعد وسم شرائح المخيخ الحادة بالبيروفات [1-13C] (اختبار t المزدوج؛ ** P < 0.01). (هـ) تحليل تاريخي زمني شامل للمسار المحدد. يُؤخذ في الاعتبار فقط البروتينات التي تقل قيمة P لها عن 0.05 عند 8 أسابيع. الخط المتقطع: لا توجد قيمة تعديل (تحليل التباين ثنائي الاتجاه؛ * P < 0.05؛ *** P < 0.001). تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط.
في تحليلنا، أصبح هدم الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة (BCAA) أحد مسارات التنظيم التصاعدي الرئيسية. تشير هذه الحقيقة بقوة إلى احتمال تغير حجم التهوية الداخلة إلى دورة حمض الستريك (TCA) في الخلايا العصبية التي تفتقر إلى الفسفرة التأكسدية (OXPHOS). قد يمثل هذا شكلاً رئيسياً من أشكال إعادة برمجة التمثيل الغذائي العصبي، والذي قد يكون له تأثير مباشر على وظائف الخلايا العصبية وبقائها أثناء استمرار خلل وظيفي حاد في الفسفرة التأكسدية. وتماشياً مع هذه الفرضية، وجدنا أن إنزيم PCx، وهو الإنزيم الرئيسي المضاد لتصلب الشرايين، قد ارتفع مستواه (يتغير Mfn2cKO/CTRL بمقدار 1.5 مرة تقريباً؛ الشكل 3A)، والذي يحفز تحويل البيروفات إلى أوكسالوأسيتات (28)، والذي يُعتقد أنه موجود في أنسجة المخ. ويقتصر التعبير عنه على الخلايا النجمية (29، 30). تماشيًا مع نتائج البروتينات، أظهر الفحص المجهري متحد البؤر زيادةً ملحوظةً وخاصةً في التعبير عن بروتين PCx في الخلايا العصبية الهرمية المُفتقرة إلى الفسفرة التأكسدية، بينما اقتصر تفاعل PCx بشكل رئيسي على خلايا بيرغمان الدبقية المجاورة في المجموعة الضابطة (الشكل 3ب). ولاختبار الزيادة الملحوظة في التعبير عن PCx وظيفيًا، عالجنا شرائح المخيخ الحادة بمتتبع البيروفات [1-13C]. عند أكسدة البيروفات بواسطة نازعة هيدروجين البيروفات (PDH)، اختفى النظير المُشع، ولكنه يُدمج في وسائط دورة حمض الستريك عند استقلاب البيروفات بواسطة التفاعلات الوعائية (الشكل 3د). وتأكيدًا لبيانات البروتينات، لاحظنا عددًا كبيرًا من المؤشرات من هذا المتتبع في حمض الأسبارتيك في شرائح Mfn2cKO، بينما أظهر حمض الستريك وحمض الماليك اتجاهًا متوسطًا، وإن لم يكن ذا دلالة إحصائية (الشكل 3د).
في الخلايا العصبية الدوبامينية لفئران MitoPark المصابة بخلل في الميتوكوندريا ناتج عن تدمير الخلايا العصبية الدوبامينية على وجه التحديد لجين عامل النسخ الميتوكوندري A (Tfam) (الشكل S6B)، تم أيضًا تنظيم تعبير PCx بشكل كبير (31)، مما يشير إلى أن تصلب الشرايين الناتج عن حمض الأسيتون يتم تنظيم حدوث المرض أثناء خلل الفسفرة التأكسدية العصبية في الجسم. تجدر الإشارة إلى أنه وُجد أن إنزيمات فريدة (32-34) قد تُعبَّر عنها في الخلايا العصبية المرتبطة بتصلب الشرايين، تزداد مستوياتها بشكل ملحوظ في الخلايا العصبية الطرفية التي تفتقر إلى الفسفرة التأكسدية، مثل بروبيونيل-CoA كاربوكسيلاز (PCC-A)، ومالونيل-CoA الذي يحول بروبيونيل-CoA إلى سكسينيل-CoA، وإنزيم الماليك الميتوكوندري 3 (ME3)، الذي يتمثل دوره الرئيسي في استعادة البيروفات من الماليت (الشكل 3، أ و ج) (33، 35). بالإضافة إلى ذلك، وجدنا زيادة ملحوظة في إنزيم Pdk3، الذي يُفسفر ويُعطِّل PDH (36)، بينما لم تُلاحظ أي تغييرات في إنزيم Pdp1 الذي يُنشِّط PDH أو في مُركَّب إنزيم PDH نفسه (الشكل 3أ). في خلايا Mern2cKO PNs، لوحظ باستمرار ازدياد فسفرة الوحدة الفرعية α1 α (PDHE1α) من مكون نازعة هيدروجين البيروفات E1 في مركب PDH عند Ser293 (المعروف بتثبيط نشاط إنزيم PDH) (الشكل S6C). لا يصل البيروفات إلى الأوعية الدموية.
أخيرًا، وجدنا أن المسار الفائق لتخليق السيرين والجليسين، ودورة حمض الفوليك الميتوكوندرية (1C) المرتبطة به، وتخليق البرولين (الشكل 1G والشكل S5C) جميعها تزداد بشكل ملحوظ، وفقًا للتقارير، أثناء عملية التنشيط. وتُنشط الأنسجة المحيطة مع وجود خلل في وظائف الميتوكوندريا (5-7). وأظهر تحليل المجهر متحد البؤر، الذي يدعم بيانات البروتينات هذه، أنه في الخلايا العصبية المحيطية التي تفتقر إلى الفسفرة التأكسدية، خضعت شرائح المخيخ لفئران عمرها 8 أسابيع لإنزيم سيرين هيدروكسي ميثيل ترانسفيراز 2 (SHMT2)، وهو إنزيم رئيسي في دورة حمض الفوليك الميتوكوندرية. استجابة مناعية ملحوظة (الشكل S5D). في 13 شريحة مخيخية حادة مُحضّنة مع الجلوكوز، أكدت تجارب التتبع الأيضي زيادة تخليق السيرين والبرولين، مما يشير إلى زيادة تدفق نظائر الكربون إلى السيرين والبرولين (الشكل S5E). وبما أن التفاعلات التي يحفزها كل من GLS وGPT2 مسؤولة عن تخليق الجلوتامات من الجلوتامين ونقل الأمين بين الجلوتامات وα-كيتوجلوتارات، فإن زيادة نشاطها تشير إلى أن الخلايا العصبية التي تعاني من نقص في الفسفرة التأكسدية لديها طلب متزايد على الجلوتامات. وقد يكون هذا الهدف هو الحفاظ على زيادة تخليق البرولين (الشكل S5C). وعلى النقيض من هذه التغييرات، أظهر تحليل البروتينات للخلايا النجمية المخيخية من فئران Mfn2cKO الخاصة بـ PN أن هذه المسارات (بما في ذلك جميع مضادات البيروكسيداز) لم تتغير بشكل كبير في التعبير، مما يدل على أن إعادة التوجيه الأيضي هذا انتقائي لـ PN المتحلل (الشكل S6، من D إلى G).
باختصار، كشفت هذه التحليلات عن أنماط مختلفة بشكل ملحوظ للتنشيط الزمني لمسارات أيضية محددة في الخلايا العصبية الهرمية. على الرغم من أن الخلل في وظيفة الميتوكوندريا العصبية قد يؤدي إلى تصلب الشرايين المبكر وإعادة تشكيل دورة حمض الستريك (الشكل 3هـ والشكل S5ج)، وحتى إلى تغيرات متوقعة في التعبير عن المركبين الأول والرابع، إلا أن التغيرات في تخليق السيرين من الصفر لم تظهر إلا في المراحل المتأخرة. خلل الفسفرة التأكسدية (الشكل 3هـ والشكل S5ج). تحدد هذه النتائج عملية متسلسلة تتفاعل فيها استجابة الميتوكوندريا (دورة حمض الستريك) والسيتوبلازم (تخليق السيرين) الناتجة عن الإجهاد بشكل تآزري مع زيادة تصلب الشرايين في دورة حمض الستريك لإعادة تشكيل الأيض العصبي.
تستطيع الخلايا العصبية الهرمية (PNs) التي تعاني من نقص في الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) في عمر 8 أسابيع الحفاظ على نشاط استثارة عالي التردد، وتخضع لإعادة اتصال أيضي كبير للتعويض عن خلل الميتوكوندريا. يثير هذا الاكتشاف احتمالًا مثيرًا للاهتمام، وهو أنه حتى في هذه المرحلة، قد تتلقى هذه الخلايا أيضًا تدخلًا علاجيًا لتأخير أو منع التنكس العصبي. وقد حسمنا هذا الاحتمال من خلال تدخلين مستقلين. في الطريقة الأولى، صممنا ناقلًا فيروسيًا مرتبطًا بالغدانيات (AAV) يعتمد على إنزيم Cre، بحيث يمكن التعبير عن MFN2 بشكل انتقائي في الخلايا العصبية الهرمية التي تعاني من نقص في الفسفرة التأكسدية في الجسم الحي (الشكل S7A). تم التحقق من صحة ناقل AAV الذي يشفر MFN2 وجين mCherry المُبلغ الفلوري (Mfn2-AAV) في مزارع الخلايا العصبية الأولية في المختبر، مما أدى إلى التعبير عن MFN2 بطريقة تعتمد على إنزيم Cre، واستعادة مورفولوجيا الميتوكوندريا، وبالتالي منع الطفرات العصبية في الخلايا العصبية Mfn2cKO (الشكل S7، B، D، وE). بعد ذلك، أجرينا تجارب حيوية لحقن فيروس Mfn2-AAV بعمر 8 أسابيع في قشرة المخيخ لفئران Mfn2cKO وفئران التحكم، ثم حللنا فئرانًا بعمر 12 أسبوعًا (الشكل 4أ). نفقت فئران Mfn2cKO المعالجة (الشكل 1، أ و ب) (16). أدى النقل الفيروسي الحيوي إلى التعبير الانتقائي عن PN في بعض دوائر المخيخ (الشكل S7، ز و ح). لم يكن لحقن فيروس التحكم AAV الذي يعبر عن mCherry فقط (Ctrl-AAV) أي تأثير يُذكر على درجة التنكس العصبي في حيوانات Mfn2cKO. في المقابل، أظهر تحليل فئران Mfn2cKO المنقولة بفيروس Mfn2-AAV تأثيرًا وقائيًا ملحوظًا لطبقة خلايا PN (الشكل 4، ب و ج). على وجه الخصوص، بدت كثافة الخلايا العصبية متطابقة تقريبًا مع حيوانات التحكم (الشكل 4، ب و ج، والشكل S7، ح و ط). يُعدّ التعبير عن MFN1، وليس MFN2، فعالاً بنفس القدر في منع موت الخلايا العصبية (الشكل 4C والشكل S7، C وF)، مما يشير إلى أن التعبير عن MFN1 في غير موضعه الطبيعي يُمكنه تعويض نقص MFN2 بفعالية. وأظهر تحليل إضافي على مستوى الخلايا العصبية الهرمية المفردة أن Mfn2-AAV قد أنقذ إلى حد كبير البنية الدقيقة للميتوكوندريا، وعادل مستويات mtDNA، وعكس التعبير العالي عن مؤشر PCx المضاد لتكوين الأوعية الدموية (الشكل 4، من C إلى E). وأظهر الفحص البصري لفئران Mfn2cKO المُستعادة في حالة الراحة تحسناً في وضعيتها وأعراضها الحركية (الحركة من S1 إلى S3). وختاماً، تُظهر هذه التجارب أن إعادة إدخال MFN2 المتأخرة إلى الخلايا العصبية الهرمية التي تعاني من نقص حاد في الفسفرة التأكسدية كافية لعكس استهلاك mtDNA وتحفيز تصلب الشرايين، وبالتالي منع تنكس المحاور العصبية وموت الخلايا العصبية في الجسم الحي.
(أ) مخطط يوضح الجدول الزمني التجريبي لحقن الفيروس الغدي المرتبط (AAV) المشفر لبروتين MFN2 عند تنشيط المسار الأيضي المحدد. (ب) صور مجهرية بؤرية نموذجية لشرائح مخيخية عمرها 12 أسبوعًا، تم نقلها جينيًا في الأسبوع الثامن في فئران Mfn2cKO، وتم وسمها بأجسام مضادة للكالبيندين. اليمين: مقياس ألياف المحور العصبي. مقياس تكبير المحور العصبي هو 450 و75 ميكرومترًا. (ج) اليسار: قياس كثافة خلايا بوركنجي في حلقة نقل الفيروس الغدي المرتبط (AAV+) (تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ ن = 3 فئران). اليمين: تحليل بؤر الحمض النووي للميتوكوندريا في الخلايا العصبية بوركنجي المنقولة جينيًا في الأسبوع 12 (اختبار t غير المقترن؛ ن = 6 خلايا من ثلاثة فئران). * P < 0.05؛ ** P < 0.01. (د) صور مجهرية إلكترونية ناقلة نموذجية لخلايا عصبية هرمية من مقاطع مخيخية لفئران Mfn2cKO بعد نقل الجينات إليها باستخدام النواقل الفيروسية الموضحة. يوضح القناع الوردي المنطقة التي تشغلها التغصنات، ويوضح المربع الأصفر المنقط التكبير الموضح على اليمين؛ n يمثل النواة. مقياس الرسم: 1 ميكرومتر. (هـ) يوضح مثالاً على تلوين PCx في خلية عصبية هرمية بعد نقل الجينات إليها في الأسبوع 12. مقياس الرسم: 20 ميكرومتر. OE: فرط التعبير؛ FC: نسبة التغير.
أخيرًا، بحثنا في أهمية بقاء الخلايا المُحفَّز بواسطة البيروكسيداز في الخلايا العصبية الهرمية التي تعاني من خلل في الفسفرة التأكسدية. قمنا بتوليد فيروس AAV-shRNA (حمض نووي ريبوزي قصير حلقي) مُشفِّر لبروتين mCherry، يستهدف تحديدًا الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) لبروتين PCx في الفئران (AAV-shPCx)، وحقنّا الفيروس أو نسخة التحكم المُشوشة منه (AAV-scr) في مخيخ فئران Mfn2cKO. أُجري الحقن في الأسبوع الرابع من العمر (الشكل 5أ) لتحقيق تثبيط فعال لبروتين PCx خلال الفترة التي ازداد فيها تعبيره (الشكل 3ج) وكانت طبقة الخلايا العصبية الهرمية لا تزال سليمة (الشكل 1أ). تجدر الإشارة إلى أن تثبيط بروتين PCx (الشكل S8أ) يؤدي إلى تسارع ملحوظ في موت الخلايا العصبية الهرمية، والذي يقتصر على الحلقة المصابة (الشكل 5، ب وج). لفهم آلية التأثيرات الأيضية الناتجة عن زيادة تنظيم PCx، درسنا حالة الأكسدة والاختزال للخلايا العصبية الهرمية بعد تثبيط PCx والتعبير المتزامن عن المستشعر الحيوي البصري Grx1-roGFP2 بوساطة الفيروس الغدي المرتبط (الشكل S8، من B إلى D) لتقييم الجلوتاثيون. تم قياس التغير النسبي في جهد الأكسدة والاختزال للببتيد (38). بعد ذلك، أجرينا تصويرًا مجهريًا لعمر الفلورة ثنائي الفوتون (FLIM) على شرائح دماغية حادة لفئران Mfn2cKO بعمر 7 أسابيع أو فئران ضابطة من نفس الفئة العمرية للكشف عن التغيرات المحتملة في حالة الأكسدة والاختزال السيتوبلازمية بعد التحقق من شروط FLIM (الشكل S8، من E إلى G). أظهر التحليل زيادة ملحوظة في حالة الأكسدة لخلية عصبية هرمية واحدة من Mfn2cKO تفتقر إلى تعبير PCx، وهو ما يختلف عن الخلايا العصبية الضابطة أو الخلايا العصبية الهرمية من Mfn2cKO التي تعبر فقط عن shRNA عشوائي (الشكل 5، D وE). عندما تم تنظيم التعبير عن PCx بشكل سلبي، زادت نسبة Mfn2cKO PNs التي تظهر حالة مؤكسدة للغاية بأكثر من ثلاثة أضعاف (الشكل 5E)، مما يشير إلى أن تنظيم PCx بشكل تصاعدي حافظ على قدرة الأكسدة والاختزال للخلايا العصبية المتدهورة.
(أ) مخطط يوضح الجدول الزمني التجريبي لحقن الفيروس الغدي المرتبط (AAV) المشفر لـ shPCx عند تنشيط المسار الأيضي المحدد. (ب) صور مجهرية بؤرية نموذجية لمقاطع مخيخية من فئران Mfn2cKO عمرها 8 أسابيع، تم نقلها وراثيًا ووسمها بأجسام مضادة للكالسينيورين عند عمر 4 أسابيع. مقياس الرسم: 450 ميكرومتر. (ج) قياس كثافة خلايا بوركنجي في الحلقات المنقولة وراثيًا بواسطة الفيروس الغدي المرتبط (تحليل التباين أحادي الاتجاه؛ ن = 3 إلى 4 فئران). تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط؛ ***P<0.001. (د) صورة نموذجية بتقنية FLIM تُظهر متوسط ​​عمر خلايا بوركنجي (PN) عمرها 7 أسابيع، والتي تُعبر عن مستشعر الأكسدة والاختزال للجلوتاثيون Grx1-roGFP2، في ظل الظروف التجريبية المحددة. نسبة جدول البحث (LUT): فاصل زمني للبقاء (بالبيكوثانية). مقياس الرسم: 25 ميكرومتر. (هـ) يُظهر المدرج التكراري توزيع قيم عمر Grx1-roGFP2 من (د) (عدد الخلايا من 158 إلى 368 في فأرين تحت كل حالة). يُظهر الرسم البياني الدائري أعلى كل مدرج تكراري عدد الخلايا ذات قيم عمر أطول بشكل ملحوظ (أحمر، مؤكسد) أو أقصر (أزرق، مُختزل)، والتي تتجاوز انحرافًا معياريًا واحدًا عن متوسط ​​قيمة العمر في CTRL-AAV-scr. (و) يُظهر النموذج المقترح التأثير الوقائي لزيادة تنظيم PCx العصبي.
بشكل عام، تُظهر البيانات التي نقدمها هنا أن إعادة التعبير عن MFN2 قادرة على إنقاذ الخلايا العصبية الهرمية المتقدمة تمامًا، والتي تعاني من نقص حاد في الفسفرة التأكسدية، ونقص حاد في الحمض النووي للميتوكوندريا، وشكل غير طبيعي للغاية يشبه شكل الخلايا الجذعية، مما يوفر تقدمًا مستمرًا حتى في المراحل المتقدمة من المرض. يوفر التنكس العصبي دليلًا قابلًا للعكس على المرحلة التي تسبق موت الخلايا. ويتأكد هذا المستوى من المرونة الأيضية من خلال قدرة الخلايا العصبية على إحداث تصلب الشرايين (إعادة برمجة دورة حمض الستريك)، مما يثبط التعبير عن PCx في الخلايا العصبية الهرمية التي تفتقر إلى الفسفرة التأكسدية ويعزز موت الخلايا، وبالتالي يلعب دورًا وقائيًا (الشكل 5F).
في هذه الدراسة، قدمنا ​​أدلة على أن استجابة الخلايا العصبية الهرمية لاختلال وظيفة الفسفرة التأكسدية تتمثل في التقارب التدريجي نحو تصلب الشرايين الناتج عن دورة حمض الستريك عبر مسار التنشيط التفاضلي الذي تُفعّله البرامج الأيضية. وقد أكدنا التحليل البروتيني باستخدام العديد من الطرق التكميلية، وكشفنا أنه عند مواجهة خلل وظيفي حاد في الميتوكوندريا، تُظهر الخلايا العصبية شكلاً غير معروف سابقًا من المرونة الأيضية. والمثير للدهشة أن عملية إعادة التوصيل بأكملها لا تُشير بالضرورة إلى الحالة الأيضية النهائية التي تُصاحب التنكس العصبي التدريجي وغير القابل للعكس، بل تُشير بياناتنا إلى أنها قد تُشكل آلية تعويض وظيفي للخلايا العصبية حتى في المرحلة التي تسبق موت الخلية. تُشير هذه النتيجة إلى أن الخلايا العصبية تتمتع بدرجة كبيرة من اللدونة الأيضية في الجسم. وتُثبت هذه الحقيقة أن إعادة إدخال MFN2 لاحقًا يُمكن أن يعكس التعبير عن المؤشرات الأيضية الرئيسية ويمنع تنكس الخلايا العصبية الهرمية. بل على العكس، فإنه يُثبط تصلب الشرايين ويُسرّع من تدهور الأعصاب.
من أبرز نتائج بحثنا أن الخلايا العصبية الطرفية التي تفتقر إلى الفسفرة التأكسدية قادرة على تعديل استقلاب دورة حمض الستريك عن طريق زيادة تنظيم الإنزيمات التي تحفز تصلب الشرايين تحديدًا. يُعدّ إعادة تنظيم الاستقلاب سمة شائعة في الخلايا السرطانية، حيث يعتمد بعضها على الجلوتامين لتوفير وسائط دورة حمض الستريك لإنتاج المكافئات المختزلة، التي بدورها تُحفّز سلسلة التنفس الخلوي وتحافظ على إنتاج سلائف تخليق الدهون والنيوكليوتيدات (39، 40). أظهرت دراسة حديثة أن إعادة ربط استقلاب الجلوتامين/الجلوتامات يُعدّ سمة بارزة أيضًا في الأنسجة الطرفية التي تعاني من خلل في الفسفرة التأكسدية (5، 41)، حيث يعتمد اتجاه دخول الجلوتامين إلى دورة حمض الستريك على شدة إصابة الفسفرة التأكسدية (41). مع ذلك، لا يوجد دليل واضح على أي تشابه في اللدونة الاستقلابية العصبية في الجسم وأهميتها المحتملة في سياق المرض. أظهرت دراسة مخبرية حديثة أن الخلايا العصبية القشرية الأولية تُفعّل مخزون الغلوتامات لنقل الإشارات العصبية، مما يُعزز عملية الأيض التأكسدي وتصلب الشرايين في ظل ظروف الإجهاد الأيضي (42). ومن الجدير بالذكر أنه في ظل التثبيط الدوائي لإنزيم نازعة هيدروجين السكسينات في دورة حمض الستريك، يُعتقد أن كربوكسلة البيروفات تحافظ على تخليق الأوكسالوأسيتات في الخلايا الحبيبية المخيخية المستزرعة (34). ومع ذلك، لا تزال الأهمية الفسيولوجية لهذه الآليات في أنسجة المخ (حيث يُعتقد أن تصلب الشرايين يقتصر بشكل رئيسي على الخلايا النجمية) ذات دلالة فسيولوجية هامة (43). في هذه الحالة، تُظهر بياناتنا أن الخلايا العصبية الهرمية المتضررة بفعل الفسفرة التأكسدية في الجسم يُمكن تحويلها إلى تحلل الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة وكربوكسيلة البيروفات، وهما المصدران الرئيسيان لتغذية وسائط دورة حمض الستريك. على الرغم من اقتراح مساهمة هدم الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة (BCAA) في استقلاب الطاقة العصبية، بالإضافة إلى دور الغلوتامات وحمض غاما-أمينوبيوتيريك (GABA) في النقل العصبي (44)، إلا أنه لا يوجد دليل حتى الآن على هذه الآليات في الجسم الحي. لذلك، من السهل التكهن بأن الخلايا العصبية الهرمية المختلة وظيفيًا يمكنها التعويض تلقائيًا عن استهلاك وسائط دورة حمض الستريك (TCA) الناتج عن عملية الاستيعاب عن طريق زيادة تصلب الشرايين. على وجه الخصوص، قد يكون تنظيم PCx ضروريًا للحفاظ على الطلب المتزايد على حمض الأسبارتيك، وهو ما يُشير إليه في الخلايا المتكاثرة التي تعاني من خلل في الميتوكوندريا (45). ومع ذلك، لم يكشف تحليلنا الأيضي عن أي تغييرات كبيرة في مستوى حمض الأسبارتيك في حالة الاستقرار في الخلايا العصبية الهرمية Mfn2cKO (الشكل S6A)، وهو ما يعكس على الأرجح اختلاف الاستخدام الأيضي لحمض الأسبارتيك بين الخلايا المتكاثرة والخلايا العصبية بعد الانقسام. على الرغم من أن الآلية الدقيقة لزيادة تنظيم PCx في الخلايا العصبية المختلة وظيفيًا في الجسم الحي لا تزال غير معروفة، فقد أثبتنا أن هذه الاستجابة المبكرة تلعب دورًا هامًا في الحفاظ على حالة الأكسدة والاختزال للخلايا العصبية، وهو ما تم إثباته في تجارب FLIM على شرائح المخيخ. على وجه الخصوص، يمكن أن يؤدي منع الخلايا العصبية الهرمية من زيادة تنظيم PCx إلى حالة أكسدة أكبر وتسريع موت الخلايا. لا يُعد تنشيط تحلل الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة وكربوكسيل البيروفات من الطرق التي تُميز الأنسجة الطرفية المختلة وظيفيًا في الميتوكوندريا (7). لذلك، يبدو أنهما سمة أساسية للخلايا العصبية التي تعاني من نقص في الفسفرة التأكسدية، حتى وإن لم تكونا السمة الوحيدة، وهو أمر مهم للتنكس العصبي.
يُعدّ مرض المخيخ نوعًا غير متجانس من الأمراض التنكسية العصبية، ويتجلى عادةً في صورة ترنح، وغالبًا ما يُلحق الضرر بالخلايا العصبية الهرمية (46). وتُعتبر هذه الخلايا العصبية عرضةً بشكل خاص لاختلال وظائف الميتوكوندريا، إذ يكفي تنكسها الانتقائي في الفئران لمحاكاة العديد من الأعراض الحركية التي تميز ترنح المخيخ الشوكي لدى الإنسان (16، 47، 48). ووفقًا للتقارير، يرتبط نموذج فأر معدل وراثيًا يحمل جينًا طافرًا بترنح المخيخ الشوكي لدى الإنسان، ويعاني من خلل في وظائف الميتوكوندريا (49، 50)، مما يُؤكد أهمية دراسة عواقب نقص الفسفرة التأكسدية في ارتفاع ضغط الدم الرئوي. ولذلك، يُعدّ عزل هذه المجموعة الفريدة من الخلايا العصبية ودراستها أمرًا مناسبًا للغاية. مع ذلك، ونظرًا لحساسية الخلايا العصبية الهرمية الشديدة للضغط، ولأنها تُمثل نسبة ضئيلة من إجمالي خلايا المخيخ، فإن فصلها الانتقائي كخلايا كاملة لا يزال يُمثل تحديًا في العديد من الدراسات القائمة على علم الجينوم الوظيفي. على الرغم من صعوبة تحقيق انعدام التلوث التام بأنواع الخلايا الأخرى (خاصةً أنسجة البالغين)، فقد جمعنا بين خطوة فصل فعالة وتقنية فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) للحصول على عدد كافٍ من الخلايا العصبية الحية لتحليل البروتينات اللاحق، وحققنا تغطية بروتينية عالية (حوالي 3000 بروتين) مقارنةً بمجموعة البيانات الموجودة للمخيخ بأكمله (51). وبفضل الحفاظ على حيوية الخلايا الكاملة، تتيح لنا الطريقة التي نقدمها هنا ليس فقط فحص التغيرات في المسارات الأيضية في الميتوكوندريا، بل أيضًا فحص التغيرات في نظائرها السيتوبلازمية، مما يُكمل استخدام علامات غشاء الميتوكوندريا لإثراء نوع الخلية. الطريقة الجديدة لحساب عدد الميتوكوندريا في الأنسجة المعقدة (52، 53). لا تقتصر الطريقة التي نصفها على دراسة خلايا بوركنجي فحسب، بل يمكن تطبيقها بسهولة على أي نوع من الخلايا لدراسة التغيرات الأيضية في الأدمغة المصابة، بما في ذلك نماذج أخرى لاختلال وظائف الميتوكوندريا.
أخيرًا، حددنا نافذة علاجية خلال عملية إعادة تنظيم التمثيل الغذائي هذه، قادرة على عكس العلامات الرئيسية للإجهاد الخلوي تمامًا ومنع التنكس العصبي. لذا، فإن فهم الآثار الوظيفية لإعادة التوصيل الموصوفة هنا قد يوفر رؤى أساسية حول العلاجات الممكنة للحفاظ على حيوية الخلايا العصبية أثناء خلل الميتوكوندريا. ويلزم إجراء المزيد من الأبحاث المستقبلية التي تهدف إلى تحليل التغيرات في استقلاب الطاقة في أنواع أخرى من خلايا الدماغ للكشف الكامل عن إمكانية تطبيق هذا المبدأ على أمراض عصبية أخرى.
وُصفت فئران MitoPark سابقًا (31). كما وُصفت فئران C57BL/6N التي تحمل جينات Mfn2 محاطة بتسلسل loxP سابقًا (18)، وتم تهجينها مع فئران L7-Cre (23). ثم تم تهجين النسل الناتج مزدوج التغاير مع فئران متماثلة الزيجوت Mfn2loxP/Mfn2loxP لإنتاج فئران معدلة وراثيًا بحذف جين Mfn2 في خلايا بوركنجي (Mfn2loxP/Mfn2loxP؛ L7-cre). وفي مجموعة فرعية من التزاوج، تم إدخال أليل Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) من خلال عمليات تهجين إضافية (20). أُجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقًا للمبادئ التوجيهية الأوروبية والوطنية والمؤسسية، وحصلت على موافقة مكتب حماية البيئة والمستهلكين في ولاية شمال الراين وستفاليا، ألمانيا. كما تتبع التجارب على الحيوانات إرشادات الاتحاد الأوروبي لجمعيات علوم حيوانات المختبرات.
بعد تخدير المرأة الحامل أثناء خلع عنق الرحم، تم عزل جنين الفأر (في اليوم الثالث عشر من الحمل). تم تشريح القشرة في محلول هانكس الملحي المتوازن (HBSS) المُضاف إليه 10 ملي مول من هيبس، ثم نُقلت إلى وسط دولبيكو المعدل للنسر (DMEM) المُحتوي على باباين (20 وحدة/مل) وسيستين (1 ميكروغرام/مل). حُضنت الأنسجة في وسط DMEM وفُصلت بالهضم الأنزيمي. ثم طُحنت ميكانيكيًا في وسط DMEM مُضاف إليه 10% من مصل الأبقار الجنيني. زُرعت الخلايا على شرائح زجاجية مغطاة بالبولي ليسين بكثافة 2×10⁶ خلية لكل طبق زراعة 6 سم، أو بكثافة 0.5×10⁵ خلية/سم² لتحليل التصوير. بعد أربع ساعات، تم استبدال الوسط بوسط نيوروبازال الخالي من المصل والمحتوي على 1% من مكمل B27 و0.5 ملي مول من غلوتاماكس. ثم حُفظت الخلايا العصبية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون طوال فترة التجربة، وغُذيت مرة واحدة أسبوعيًا. ولتحفيز إعادة التركيب في المختبر، استُخدم 3 ميكرولتر (في طبق زراعة ذي 24 بئرًا) أو 0.5 ميكرولتر (في صفيحة ذات 24 بئرًا) من ناقل الفيروس AAV9 التالي لمعالجة الخلايا العصبية في اليوم الثاني من التجربة في المختبر: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene، رقم الكتالوج 105530-AAV9) وAAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene، رقم الكتالوج 105545-AAV9).
تم وسم الحمض النووي التكميلي لبروتيني Mfn1 وMfn2 للفأر (المُستخلصين من بلازميد Addgene رقم 23212 ورقم 23213 على التوالي) بتسلسل V5 (GKPIPNPLLGLDST) في الطرف الكربوكسيلي، وتم دمجهما مع بروتين mCherry في نفس الإطار عبر تسلسل T2A. أما بروتين Grx1-roGFP2 فهو هدية من هايدلبرغ تي بي ديك، مركز أبحاث السرطان الألماني (DFKZ). باستبدال شريط tdTomato باستخدام طرق الاستنساخ التقليدية، تم استنساخ الشريط فرعيًا في هيكل pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (رقم مرجع Addgene 28306) لإنتاج متجهات pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 وpAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 وpAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. واستُخدمت استراتيجية مماثلة لإنتاج متجه التحكم pAAV-CAG-FLEX-mCherry. لإنتاج بنية AAV-shPCx، يلزم ناقل بلازميدي AAV (VectorBuilder، pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1])، والذي يحتوي على تسلسل الحمض النووي الذي يشفر shRNA المستهدف لجين PCx في الفئران (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). يُستخدم mCherry تحت سيطرة محفز U6، بينما يُستخدم mCherry تحت سيطرة محفز CMV. تم إنتاج نواقل AAV المساعدة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Cell Biolabs). باختصار، استخدم بلازميد نقل يحمل جين mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5)، أو mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) بشكل مؤقت في خلايا 293AAV. يتم نقل جين mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) أو Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) بشكل مؤقت إلى خلايا 293AAV، بالإضافة إلى جين ترميز بروتين غلاف AAV1 والبروتين المساعد. يتم تغليف بلازميد النقل باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم. تم الحصول على الراشح الفيروسي الخام عن طريق دورات التجميد والذوبان في حمام من الثلج الجاف/الإيثانول، ثم تم تحليل الخلايا في محلول ملحي فوسفاتي (PBS). تم تنقية ناقل الفيروس المرتبط بالغدانيات (AAV) باستخدام الطرد المركزي الفائق المتدرج غير المتصل لليوديكسانول (لمدة 24 ساعة عند 32000 دورة في الدقيقة و4 درجات مئوية) وتركيزه باستخدام مرشح طرد مركزي Amicon ultra-15. تم قياس عيار الجينوم لكل من AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×10¹³ نسخة جينوم/مل]، وAAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×10¹² نسخة جينوم/مل)، وAAV1-CAG-FLEX-MFN1-V5 (1.9×10¹³ نسخة جينوم/مل)، وAAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×10¹² نسخة جينوم/مل) كما هو موضح سابقًا (54)، باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR).
تم كشط الخلايا العصبية الأولية في محلول فوسفات ملحي بارد (PBS) بتركيز 1x، ثم ترسيبها، ثم تجانسها في محلول تحلل مكون من 0.5% تريتون X-100 / 0.5% ديوكسيكولات الصوديوم / محلول فوسفات ملحي (PBS) يحتوي على مثبطات الفوسفاتاز والبروتياز (روش). تم تقدير كمية البروتين باستخدام اختبار حمض البيسينكونينيك (ثيرمو فيشر ساينتيفيك). بعد ذلك، تم فصل البروتينات بواسطة الرحلان الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد SDS، ثم نقلها إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين (جي إي هيلث كير). تم حجب المواقع غير النوعية، ثم حضنت مع الجسم المضاد الأولي (انظر الجدول S1 للتفاصيل) في حليب بنسبة 5% في محلول TBST (محلول ملحي منظم بالتروميثامين مع توين)، مع خطوات الغسل والجسم المضاد الثانوي في محلول TBST. حضنت مع الجسم المضاد الأولي طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. بعد الغسل، وضعت الجسم المضاد الثانوي لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تم التأكد من نفس كمية البروتين المحملة عن طريق حضانة نفس اللطخة مع جسم مضاد لبروتين بيتا-أكتين. تم الكشف عن البروتين عن طريق تحويله إلى تألق كيميائي وتعزيز التألق الكيميائي (شركة جنرال إلكتريك للرعاية الصحية).
تم تثبيت الخلايا العصبية المزروعة مسبقًا على شرائح زجاجية باستخدام محلول بارافورمالدهيد 4% في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) عند النقطة الزمنية المحددة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم تم تشريب الشرائح بمحلول تريتون X-100 0.1% في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم بمحلول حاجب [ألبومين مصل البقر 3% في محلول ملحي فوسفاتي (PBS)]. في اليوم الثاني، تم غسل الشرائح بالمحلول الحاجب وحضنها مع الجسم المضاد الثانوي المناسب المرتبط بالفلوروفور لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. أخيرًا، تم غسل العينات جيدًا في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) مع صبغة 4'،6-ثنائي أميدينو-2-فينيل إندول (DAPI)، ثم تم تلوينها بشكل معاكس وتثبيتها على شريحة المجهر باستخدام Aqua-Poly/Mount.
تم تخدير الفئران (ذكورًا وإناثًا) عن طريق الحقن داخل الصفاق بالكيتامين (130 ملغم/كغم) والزيلازين (10 ملغم/كغم)، ثم تم إعطاؤها مسكن الألم كاربروفين (5 ملغم/كغم) تحت الجلد. وُضعت الفئران في جهاز التوجيه التجسيمي (Kopf) المزود بوسادة تدفئة. تم كشف الجمجمة واستخدام مثقاب أسنان لترقيق جزء من قشرة المخيخ المقابل للعظم الأوسط (من لامدا: الذيل 1.8، الجانبي 1، المقابل للفصيصين الرابع والخامس). تم استخدام إبرة حقنة منحنية لعمل ثقب صغير في الجمجمة بعناية لتجنب إتلاف الأوعية الدموية الموجودة أسفلها. ثم يُدخل الأنبوب الشعري الزجاجي الرقيق ببطء في الثقب الدقيق (من -1.3 إلى -1 على الجانب البطني للأم الجافية)، ويُحقن من 200 إلى 300 نانولتر من الفيروس الغدي المرتبط (AAV) في جهاز الحقن الدقيق (ناريشيغي) باستخدام محاقن يدوية (ناريشيغي) عدة مرات بضغط منخفض على مدى فترة زمنية تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة. بعد الحقن، يُترك الأنبوب الشعري لمدة 10 دقائق أخرى للسماح للفيروس بالانتشار بالكامل. بعد سحب الأنابيب الشعرية، تُخاط الجروح بعناية لتقليل التهاب الجرح والسماح للحيوان بالتعافي. عُولجت الحيوانات بمسكنات الألم (كاسبوفين) لعدة أيام بعد العملية، وخلال هذه الفترة رُصدت حالتها الصحية بعناية، ثم أُجري لها القتل الرحيم في الوقت المحدد. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقًا للمبادئ التوجيهية الأوروبية والوطنية والمؤسسية وتمت الموافقة عليها من قبل LandesamtfürNatur التابعة لـ Umwelt and Verbraucherschutz، شمال الراين وستفاليا، ألمانيا.
تم تخدير الحيوانات باستخدام الكيتامين (100 ملغم/كغم) والزيلازين (10 ملغم/كغم)، ثم تم تروية القلب بمحلول فوسفات ملحي (PBS) بتركيز 0.1 مولار، ثم بمحلول بارافورمالدهيد (PFA) بتركيز 4% في محلول فوسفات ملحي. تم تشريح النسيج وتثبيته في محلول بارافورمالدهيد بتركيز 4% في محلول فوسفات ملحي طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. استُخدم سكين اهتزازي (شركة لايكا مايكروسيستمز، فيينا، النمسا) لتحضير مقاطع سهمية (بسماكة 50 ميكرومتر) من الدماغ المثبت في محلول فوسفات ملحي. ما لم يُذكر خلاف ذلك، تم تلوين المقاطع الطافية الحرة كما هو موضح أعلاه (13) في درجة حرارة الغرفة مع التحريك. باختصار، في البداية، تم نفاذ الشرائح المُحصل عليها باستخدام محلول تريتون X-100 بتركيز 0.5% في محلول فوسفات ملحي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة؛ بالنسبة لبعض المستضدات (Pcx وShmt2)، تم تسخين الشرائح في محلول منظم من تريس-إي دي تي إيه عند درجة حرارة 80 درجة مئوية (الأس الهيدروجيني 9) لمدة 25 دقيقة بدلاً من هذه الخطوة. بعد ذلك، حُضنت المقاطع مع الجسم المضاد الأولي (انظر الجدول S1) في محلول حاجب (3% BSA/PBS) عند درجة حرارة 4 مئوية طوال الليل مع التحريك. في اليوم التالي، غُسلت المقاطع بالمحلول الحاجب وحُضنت مع الجسم المضاد الثانوي المناسب المرتبط بالفلوروفور لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة؛ وأخيرًا، غُسلت المقاطع جيدًا في محلول PBS، وصُبغت بصبغة DAPI، ثم ثُبتت باستخدام AquaPolymount على شريحة مجهرية.
استُخدم مجهر ليزري ماسح متحد البؤر (TCS SP8-X أو TCS Digital Light Sheet، من شركة Leica Microsystems) مزود بليزر ضوء أبيض وليزر ثنائي فوق بنفسجي 405 نانومتر لتصوير العينة. وبإثارة الفلوروفور وجمع الإشارة باستخدام كاشف هجين (HyDs)، استُخدم برنامج LAS-X لجمع صور مكدسة وفقًا لنمط أخذ عينات نايكويست في الوضع التسلسلي: بالنسبة للوحات غير الكمية، تكون الإشارات ديناميكية للغاية (على سبيل المثال، في الخلايا الجسدية والتغصنات) mtYFP. استُخدم كاشف هجين (HyD) للكشف عن عدد الخلايا العصبية الأولية في وضع BrightR. طُبقت بوابات زمنية من 0.3 إلى 6 نانوثانية لتقليل التشويش.
التصوير الفوري للخلايا المفروزة. بعد فرز الخلايا في وسط نيوروبازال-أ المحتوي على 1% من مكمل B27 و0.5 ملي مول من غلوتاماكس، زُرعت الخلايا مباشرةً على شرائح زجاجية مطلية بالبولي-ل-لايسين (μ-Slide8 Well، إيبيدي، رقم الكتالوج 80826). ثم حُفظت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة للسماح للخلايا بالاستقرار. أُجري التصوير الفوري باستخدام مجهر ليزري ماسح ضوئي متحد البؤر من نوع لايكا SP8، مزود بليزر أبيض، وعدسة زيتية 63× [فتحة عددية 1.4]، ومنصة تسخين.
تم تخدير الفأر بسرعة بثاني أكسيد الكربون وفصل رأسه، وتم إزالة الدماغ بسرعة من الجمجمة، وتقطيعه إلى مقطع سهمي بسمك 200 ميكرومتر (لتجربة الوسم بالكربون 13) أو 275 ميكرومتر (لتجارب الفوتونين) مملوء بالمواد التالية: الآيس كريم (HM-650 V، Thermo Fisher Scientific، Walldorf، ألمانيا) مملوء بالمواد التالية: 125 ملي مول من سائل دماغي شوكي اصطناعي منخفض الكالسيوم مشبع بالكربون (95% أكسجين و5% ثاني أكسيد الكربون) منخفض الكالسيوم + كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي مول من كلوريد البوتاسيوم، 1.25 ملي مول من محلول فوسفات الصوديوم، 25 ملي مول من بيكربونات الصوديوم، 25 ملي مول من الجلوكوز، 0.5 ملي مول من كلوريد الكالسيوم و3.5 ملي مول من كلوريد المغنيسيوم (ضغط أسموزي من 310 إلى 330 ملي مول). انقل شرائح الدماغ التي تم الحصول عليها إلى حجرة ما قبل الحضانة التي تحتوي على Ca2+ ACSF عالي التركيز (125.0 مليمول/لتر NaCl، 2.5 مليمول/لتر KCl، 1.25 مليمول/لتر محلول فوسفات الصوديوم، 25.0 مليمول/لتر NaHCO3، 25.0 مليمول/لتر د-جلوكوز، 1.0 مليمول/لتر CaCl2 و2.0 مليمول/لتر MgCl2) درجة الحموضة 7.4 و310 إلى 320 مليمول/لتر).
أثناء عملية التصوير، نُقلت الشرائح إلى غرفة تصوير مخصصة، وأُجريت التجربة تحت تروية مستمرة بمحلول ACSF عند درجة حرارة ثابتة تتراوح بين 32 و33 درجة مئوية. استُخدم مجهر مسح ليزري متعدد الفوتونات (TCS SP8 MP-OPO، من شركة Leica Microsystems) مزود بعدسة موضوعية من Leica 25x (NA 0.95، ماء)، وليزر تيتانيوم: ياقوت (Chameleon Vision II، من شركة Coherent) لتصوير الشرائح. وحدة FLIM (PicoHarp300، من شركة PicoQuant).
تم قياس التغيرات في حالة الأكسدة والاختزال السيتوبلازمية للخلايا العصبية الهرمية (PNs) باستخدام تقنية التصوير الفلوري ثنائي الفوتون (FLIM) في شرائح دماغية سهمية، حيث استهدف المستشعر الحيوي Grx1-roGFP2 هذه الخلايا. في طبقة الخلايا العصبية الهرمية، تم اختيار مجال التصوير على عمق يتراوح بين 50 و80 ميكرومترًا أسفل سطح الشريحة لضمان وجود خلية عصبية هرمية حية (أي عدم وجود بنية خرزية أو تغيرات مورفولوجية عصبية على طول التغصنات) ووجود مستشعر roGFP2 مزدوج الإيجابية وفيروس AAV يحمل shRNA PCx أو تسلسل التحكم الخاص به (يعبر كل منهما عن mCherry). تم جمع صور أحادية التكديس بتكبير رقمي 2x [طول موجة الإثارة: 890 نانومتر؛ 512 نانومتر، 512 بكسل]. يُستخدم الكشف الداخلي باستخدام مجموعة مرشحات HyD الداخلية، ومرشح إيزوثيوسيانات الفلورسين (FITC)، ومتوسط ​​الصور خلال دقيقتين إلى ثلاث دقائق لضمان جمع عدد كافٍ من الفوتونات (1000 فوتون إجمالاً) لمطابقة المنحنى. تم اختبار حساسية مسبار Grx1-roGFP2 والتحقق من ظروف FLIM من خلال مراقبة قيمة عمر roGFP2 عند إضافة 10 ملي مول من H2O2 خارجي إلى محلول ACSF المستخدم في التروية (لتحقيق أقصى قدر من الأكسدة، مما يؤدي إلى زيادة العمر)، ثم إضافة 2 ملي مول من ثنائي ثيوتريتول (لتقليل درجة الاختزال، مما يؤدي إلى انخفاض العمر) (الشكل S8، من D إلى G). استخدم برنامج FLIMfit 5.1.1 لتحليل النتائج المكتسبة، وقم بمطابقة منحنى الاضمحلال الأسي الأحادي للصورة بأكملها مع دالة استجابة الجهاز المقاسة، و χ2 تساوي تقريبًا 1. لحساب عمر عصبون واحد، تم رسم القناع حول جسم العصب يدويًا، وتم استخدام متوسط ​​العمر في كل قناع للقياس الكمي.
تحليل جهد الميتوكوندريا. بعد حضانة المقطع الحاد مع 100 نانومتر من TMRM المضاف مباشرةً إلى محلول ACSF المروي لمدة 30 دقيقة، تم قياس تغيرات جهد الميتوكوندريا في الخلايا العصبية الهرمية باستخدام مجهر ثنائي الفوتون. تم تصوير TMRM عن طريق إثارة المجس عند 920 نانومتر واستخدام HyD داخلي (إيزوثيوسيانات رباعي ميثيل رودامين: 585/40 نانومتر) لجمع الإشارات؛ وباستخدام نفس طول موجة الإثارة ولكن باستخدام HyD داخلي مختلف (FITC: 525/50) لتصوير mtYFP. استخدم إضافة Image Calculator في برنامج ImageJ لتقييم جهد الميتوكوندريا على مستوى الخلية الواحدة. باختصار، تُستخدم معادلة الإضافة: signal = min (mtYFP, TMRM) لتحديد منطقة الميتوكوندريا التي تُظهر إشارة TMRM في خلايا بوركينجي الصومالية في صورة المجهر متحد البؤر أحادية التكديس للقناة المقابلة. ثم يتم تحديد مساحة البكسل في القناع الناتج، ثم يتم تطبيعها على صورة المكدس الفردي المقابلة للعتبة لقناة mtYFP للحصول على الجزء الميتوكوندري الذي يوضح إمكانات الميتوكوندريا.
تمت معالجة الصورة باستخدام برنامج Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). بالنسبة للصور الممسوحة ضوئيًا للبلاطات، تم تجميع صورة البلاطة الواحدة باستخدام خوارزمية التجميع التلقائي التي يوفرها برنامج LAS-X. بعد معايرة الصورة، استخدم برنامجي ImageJ وAdobe Photoshop لمزيد من المعالجة وضبط السطوع والتباين بشكل موحد. استخدم برنامج Adobe Illustrator لإعداد الرسومات.
تحليل بؤر الحمض النووي للميتوكوندريا. تم تحديد عدد آفات الحمض النووي للميتوكوندريا كميًا على مقاطع المخيخ الموسومة بأجسام مضادة للحمض النووي باستخدام المجهر متحد البؤر. تم إنشاء منطقة مستهدفة لكل من جسم الخلية ونواة كل خلية، وحُسبت المساحة المقابلة باستخدام إضافة Multi Measure (برنامج ImageJ). طُرحت مساحة النواة من مساحة جسم الخلية للحصول على مساحة السيتوبلازم. أخيرًا، استُخدمت إضافة Analyze Particles (برنامج ImageJ) لتحديد عدد نقاط الحمض النووي السيتوبلازمي التي تشير إلى الحمض النووي للميتوكوندريا تلقائيًا على صورة العتبة، وتمت معايرة النتائج المُحصلة وفقًا لمتوسط ​​PN لفئران CTRL. تُعرض النتائج كمتوسط ​​عدد النيوكليوسيدات لكل خلية.
تحليل التعبير البروتيني. استخدم إضافة Image Calculator في برنامج ImageJ لتقييم التعبير البروتيني في الخلايا العصبية الأولية على مستوى الخلية الواحدة. باختصار، في صورة المجهر متحد البؤر أحادية الطبقة للقناة المقابلة، ومن خلال المعادلة: signal = min (mtYFP, antibody)، يتم تحديد منطقة الميتوكوندريا التي تُظهر تفاعلاً مناعياً مع جسم مضاد معين في بوركينا. ثم يتم قياس مساحة البكسل في القناع الناتج، ثم يتم توحيدها على صورة العتبة المقابلة أحادية التكديس لقناة mtYFP للحصول على نسبة الميتوكوندريا من البروتين المعروض.
تحليل كثافة خلايا بوركنجي. تم استخدام إضافة Cell Counter لبرنامج ImageJ لتقييم كثافة خلايا بوركنجي عن طريق قسمة عدد خلايا بوركنجي التي تم عدها على طول الحلقة المخيخية التي تشغلها الخلايا المعدودة.
تحضير العينات وجمعها. تم تثبيت أدمغة فئران المجموعة الضابطة وفئران Mfn2cKO في محلول بارافورمالدهيد 2%/غلوتارالدهيد 2.5% في محلول فوسفات بتركيز 0.1 مولار، ثم تم تحضير مقاطع تاجية باستخدام الهدبيات (شركة لايكا ميكروسيستم، فيينا، النمسا) (بسماكة 50 إلى 60 ميكرومتر). بعد ذلك، تم تثبيت المقاطع في محلول فوسفات يحتوي على 1% من رباعي أكسيد الأوكتان و1.5% من فيروسيانيد البوتاسيوم عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تم غسل المقاطع ثلاث مرات بالماء المقطر، ثم تم تلوينها بالإيثانول 70% المحتوي على 1% من أسيتات اليورانيل لمدة 20 دقيقة. تم تجفيف المقاطع باستخدام تراكيز متدرجة من الكحول، ثم غُمرت في راتنج إيبوكسي Durcupan ACM (راتنج صب Araldite M) (شركة Electron Microscopy Sciences، رقم الكتالوج 14040) بين شريحتين زجاجيتين مغلفتين بالسيليكون، وأخيرًا تم بلمرتها في الفرن عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. تم اختيار منطقة قشرة المخيخ، وقُطعت مقاطع رقيقة جدًا بسمك 50 نانومتر باستخدام جهاز Leica Ultracut (شركة Leica Mikrosysteme GmbH، فيينا، النمسا)، ثم وُضعت على شبكة نحاسية ذات شقوق 2×1 مم مغلفة بغشاء من البوليسترين. صُبغت المقاطع بمحلول من أسيتات اليورانيل بنسبة 4% في الماء لمدة 10 دقائق، ثم غُسلت بالماء عدة مرات، ثم بمحلول سترات الرصاص من رينولدز في الماء لمدة 10 دقائق، ثم غُسلت بالماء عدة مرات. تم التقاط الصور المجهرية باستخدام مجهر إلكتروني نافذ من نوع Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام كاميرا رقمية من نوع TVIPS (نظام معالجة الفيديو والصور من Tietz) TemCam-F416 (TVIPS GmbH، Gauting، الولايات المتحدة الأمريكية). ألمانيا.
في الفئران المصابة بفيروس AAV، تم فصل الدماغ وتقطيعه إلى مقطع سهمي بسمك 1 مم، وفُحص المخيخ باستخدام مجهر فلوري لتحديد الحلقة المصابة بفيروس AAV (أي التي تُعبر عن بروتين mCherry). استُخدمت فقط التجارب التي أدى فيها حقن فيروس AAV إلى كفاءة نقل عالية جدًا في طبقة خلايا بوركنجي (أي الطبقة بأكملها تقريبًا) في حلقتين مخيخيتين متتاليتين على الأقل. تم تشريح الحلقة المنقولة بفيروس AAV تشريحًا دقيقًا لتثبيتها لاحقًا طوال الليل (4% بارافورمالدهيد و2.5% غلوتارالدهيد في محلول كوكوات 0.1 مولار) ثم خضعت لمزيد من المعالجة. للتضمين في EPON، غُسلت الأنسجة المثبتة بمحلول كوكوات الصوديوم 0.1 مولار (Applichem)، وحُضنت مع 2% OsO4 (os، Science Services؛ Caco) في محلول كوكوات الصوديوم 0.1 مولار (Applichem) لمدة 4 ساعات، ثم غُسلت لمدة ساعتين. كرر العملية ثلاث مرات باستخدام محلول كوكاميد بتركيز 0.1 مولار. بعد ذلك، استُخدمت سلسلة متصاعدة من الإيثانول لحضانة كل محلول إيثانول عند درجة حرارة 4 مئوية لمدة 15 دقيقة لتجفيف النسيج. نُقل النسيج إلى أكسيد البروبيلين وحُضن طوال الليل في راتنج إيبون (سيجما-ألدريتش) عند درجة حرارة 4 مئوية. ضع النسيج في راتنج إيبون جديد عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، ثم غمره في وسط بلاستيكي عند درجة حرارة 62 مئوية لمدة 72 ساعة. استخدم مجهرًا دقيقًا للغاية (لايكا مايكروسيستمز، UC6) وشفرة ماسية (دياتوم، بيل، سويسرا) لتقطيع شرائح رقيقة جدًا بسمك 70 نانومتر، ثم صبغها بمحلول أسيتات اليورانيل بتركيز 1.5% لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 37 مئوية، ثم بمحلول سترات الرصاص لمدة 4 دقائق. تم التقاط الصور المجهرية الإلكترونية باستخدام مجهر إلكتروني نافذ من طراز JEM-2100 Plus (JEOL) مزود بكاميرا OneView 4K 16-bit (Gatan) وبرنامج DigitalMicrograph (Gatan). ولأغراض التحليل، تم الحصول على الصور المجهرية الإلكترونية بتكبير رقمي 5000× أو 10000×.
تحليل مورفولوجي للميتوكوندريا. في جميع التحليلات، تم تحديد حدود كل ميتوكوندريا يدويًا في الصور الرقمية باستخدام برنامج ImageJ. تم تحليل معايير مورفولوجية مختلفة. تُعبّر كثافة الميتوكوندريا كنسبة مئوية تُحسب بقسمة المساحة الكلية للميتوكوندريا في كل خلية على مساحة السيتوبلازم (مساحة السيتوبلازم = مساحة الخلية - مساحة نواة الخلية) × 100. تُحسب استدارة الميتوكوندريا باستخدام الصيغة [4π × (المساحة / المحيط²)]. تم تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا وتقسيمها إلى فئتين ("أنبوبية" و"فقاعية") وفقًا لأشكالها الرئيسية.
تحليل عدد وكثافة الجسيمات الذاتية/الجسيمات الحالة. استخدم برنامج ImageJ لتحديد حدود كل جسيم ذاتي/جسيم حالة يدويًا في الصورة الرقمية. تُعبّر مساحة الجسيمات الذاتية/الجسيمات الحالة كنسبة مئوية تُحسب بقسمة المساحة الكلية لبنية الجسيمات الذاتية/الجسيمات الحالة في كل خلية على مساحة السيتوبلازم (مساحة السيتوبلازم = مساحة الخلية - مساحة النواة) × 100. تُحسب كثافة الجسيمات الذاتية/الجسيمات الحالة بقسمة العدد الإجمالي على عدد بنى الجسيمات الذاتية/الجسيمات الحالة في كل خلية (كنسبة من مساحة السيتوبلازم) (مساحة السيتوبلازم = مساحة الخلية - مساحة النواة).
وضع العلامات للتقطيع الحاد وإعداد العينات. بالنسبة للتجارب التي تتطلب وضع علامات الجلوكوز، انقل شرائح الدماغ الحادة إلى حجرة ما قبل التحضين، والتي تحتوي على كربون مشبع (95% أكسجين و5% ثاني أكسيد الكربون)، وCa2 عالي + ACSF (125.0 مليمول/لتر كلوريد الصوديوم، 2.5 مليمول/لتر كلوريد البوتاسيوم، 1.25 مليمول/لتر محلول فوسفات الصوديوم، 25.0 مليمول/لتر بيكربونات الصوديوم، 25.0 مليمول/لتر د-جلوكوز، 1.0 مليمول/لتر كلوريد الكالسيوم و2.0 مليمول/لتر كلوريد المغنيسيوم، مضبوط على درجة حموضة 7.4 و310 إلى 320 ملي أوزمول)، حيث يكون الجلوكوز عبارة عن استبدال 13C 6-جلوكوز (Eurisotop، رقم الكتالوج CLM-1396). في التجارب التي تتطلب وسم البيروفات، انقل شرائح الدماغ الحادة إلى محلول ACSF عالي الكالسيوم (125.0 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1.25 ملي مولار محلول فوسفات الصوديوم، 25.0 ملي مولار بيكربونات الصوديوم، 25.0 ملي مولار د-جلوكوز، 1.0 ملي مولار كلوريد الكالسيوم، وأضف 2.0 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم، واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 والضغط الأسموزي إلى 310-320 ملي أوزمول)، ثم أضف 1 ملي مولار من 1-[1-13C]بيروفات (يوريزوتوب، رقم المنتج CLM-1082). حضّن الشرائح لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في نهاية التجربة، غُسلت المقاطع سريعًا بمحلول مائي (الأس الهيدروجيني 7.4) يحتوي على 75 ملي مول من كربونات الأمونيوم، ثم جُنِّست في خليط من الأسيتونيتريل والميثانول والماء بنسبة 40:40:20 (حجم/حجم/حجم). بعد حضانة المقاطع على الجليد لمدة 30 دقيقة، خُضعت العينات للطرد المركزي بسرعة 21000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، وجُفِّف الراسب الصافي في جهاز تركيز SpeedVac. حُفظت رواسب المستقلبات المجففة الناتجة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لحين تحليلها.
تحليل الأحماض الأمينية الموسومة بالكربون-13 باستخدام كروماتوغرافيا السائل-مطياف الكتلة. في تحليل كروماتوغرافيا السائل-مطياف الكتلة (LC-MS)، أُعيد تعليق راسب المستقلب في 75 ميكرولتر من الماء النقي المستخدم في LC-MS (هانيويل). بعد الطرد المركزي عند 21000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، استُخدم 20 ميكرولتر من الراشح الصافي لتحليل تدفق الأحماض الأمينية، بينما استُخدم باقي المستخلص مباشرةً لتحليل الأنيونات (انظر أدناه). أُجري تحليل الأحماض الأمينية باستخدام بروتوكول اشتقاق كلوريد البنزويل الموصوف سابقًا (55، 56). في الخطوة الأولى، أُضيف 10 ميكرولتر من كربونات الصوديوم بتركيز 100 ملي مولار (من شركة سيجما-ألدريتش) إلى 20 ميكرولتر من مستخلص المستقلبات، ثم أُضيف 10 ميكرولتر من كلوريد البنزويل بتركيز 2% (من شركة سيجما-ألدريتش) إلى أسيتونيتريل عالي النقاء (ACN) المستخدم في كروماتوغرافيا السائل. خُلطت العينة جيدًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم خُضعت للطرد المركزي بسرعة 21000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 20 درجة مئوية. نُقل السائل الطافي الصافي إلى قارورة أخذ عينات آلية سعتها 2 مل مزودة بغطاء زجاجي مخروطي (بحجم 200 ميكرولتر). حُللت العينات باستخدام نظام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء Acquity iClass (من شركة ووترز) المتصل بجهاز مطياف الكتلة عالي الدقة Q-Exactive (QE)-HF (من شركة ثيرمو فيشر ساينتيفيك). لتحليل العينة، تم حقن 2 ميكرولتر من العينة المُشتقة في عمود سيليكا T3 عالي القوة (Waters) بأبعاد 100×1.0 مم، يحتوي على جزيئات بحجم 1.8 ميكرومتر. معدل التدفق 100 ميكرولتر/دقيقة، ويتكون نظام المحلول المنظم من المحلول المنظم A (10 ملي مولار من فورمات الأمونيوم و0.15% حمض الفورميك في الماء) والمحلول المنظم B (أسيتونيتريل). التدرج كالتالي: 0% B عند 0 دقيقة؛ من 0% B إلى 15% B من 0 إلى 0.1 دقيقة؛ من 15% B إلى 17% B من 0.1 إلى 0.5 دقيقة؛ من 17% B إلى 55% B من 0.5 إلى 14 دقيقة؛ من 55% B إلى 70% B من 14 إلى 14.5 دقيقة؛ من 14.5 إلى 70% B إلى 100% B عند 18 دقيقة. ١٠٠٪ من المكون B عند الدقيقة ١٨ إلى ١٩؛ من ١٠٠ إلى ٠٪ من المكون B عند الدقيقة ١٩ إلى ١٩.١؛ ٠٪ من المكون B عند الدقيقة ١٩.١ إلى ٢٨ (٥٥، ٥٦). يعمل مطياف الكتلة QE-HF في وضع التأين الموجب بنطاق كتلة m/z (نسبة الكتلة إلى الشحنة) من ٥٠ إلى ٧٥٠. تبلغ الدقة المطبقة ٦٠٠٠٠، وهدف أيون التحكم في الكسب (AGC) المُحَصَّل عليه هو ٣×١٠⁶، والحد الأقصى لزمن الأيون هو ١٠٠ مللي ثانية. يعمل مصدر التأين بالرذاذ الكهربائي المُسخَّن (ESI) بجهد رش ٣.٥ كيلو فولت، ودرجة حرارة شعيرية ٢٥٠ درجة مئوية، وتدفق هواء الغلاف ٦٠ وحدة اعتباطية (AU)، وتدفق هواء مساعد ٢٠ وحدة اعتباطية. تم ضبط عدسة S على ٦٠ وحدة اعتباطية.
تحليل كروماتوغرافيا الأنيونات المقترنة بقياس الطيف الكتلي للأحماض العضوية الموسومة بالكربون-13. تم تحليل الراسب المتبقي من المستقلب (55 ميكرولتر) باستخدام نظام كروماتوغرافيا أيونية من شركة ديونكس (ICS 5000+، شركة ثيرمو فيشر ساينتيفيك) موصول بجهاز قياس الطيف الكتلي QE-HF (شركة ثيرمو فيشر ساينتيفيك). باختصار، تم حقن 5 ميكرولتر من مستخلص المستقلب في عمود ديونكس أيون باك AS11-HC المجهز بجهاز كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (2 مم × 250 مم، حجم الجسيمات 4 ميكرومتر، شركة ثيرمو فيشر ساينتيفيك) في وضع الحلقة الجزئية مع نسبة تعبئة 1. تم ضبط درجة حرارة العمود على 30 درجة مئوية، وجهاز أخذ العينات التلقائي على 6 درجات مئوية. استخدم خرطوشة هيدروكسيد البوتاسيوم المزودة بماء منزوع الأيونات لتوليد تدرج تركيز هيدروكسيد البوتاسيوم عبر مولد المذيب. افصل المستقلبات بمعدل تدفق 380 ميكرولتر/دقيقة، بتطبيق التدرج التالي: من 0 إلى 3 دقائق، 10 ملي مولار من هيدروكسيد البوتاسيوم؛ من 3 إلى 12 دقيقة، من 10 إلى 50 ملي مولار من هيدروكسيد البوتاسيوم؛ من 12 إلى 19 دقيقة، من 50 إلى 100 ملي مولار من هيدروكسيد البوتاسيوم؛ من 19 إلى 21 دقيقة، 100 ملي مولار من هيدروكسيد البوتاسيوم؛ من 21 إلى 21.5 دقيقة، من 100 إلى 10 ملي مولار من هيدروكسيد البوتاسيوم. أُعيدت معايرة العمود تحت تركيز 10 ملي مولار من هيدروكسيد البوتاسيوم لمدة 8.5 دقائق.
تُدمج المستقلبات المُستخلصة مع تيار إضافي من الإيزوبروبانول بمعدل 150 ميكرولتر/دقيقة بعد العمود، ثم تُوجّه إلى مطياف كتلة عالي الدقة يعمل في وضع التأين السالب. يراقب مطياف الكتلة نطاق الكتلة من m/z 50 إلى 750 بدقة 60,000. تم ضبط التحكم التلقائي في الكسب (AGC) على 1×10⁶، وحُفظ الحد الأقصى لزمن التأين عند 100 مللي ثانية. تم تشغيل مصدر التأين بالرش الإلكتروني (ESI) المُسخّن بجهد رش 3.5 كيلو فولت. أما إعدادات مصدر التأين الأخرى فهي كالتالي: درجة حرارة الشعيرة 275 درجة مئوية؛ تدفق غاز الغلاف 60 وحدة تعسفية؛ تدفق الغاز المساعد 20 وحدة تعسفية عند 300 درجة مئوية، وضبط عدسة S على 60 وحدة تعسفية.
تحليل بيانات المستقلبات الموسومة بالكربون-13. استُخدم برنامج TraceFinder (الإصدار 4.2، Thermo Fisher Scientific) لتحليل بيانات نسبة النظائر. تم التحقق من هوية كل مركب باستخدام مركب مرجعي موثوق وتحليله بشكل مستقل. ولإجراء تحليل إثراء النظائر، تم استخلاص مساحة كروماتوغرام الأيونات المستخلصة (XIC) لكل نظير من نظائر الكربون-13 (Mn) من [M + H]+، حيث n هو عدد ذرات الكربون في المركب المستهدف، ويُستخدم لتحليل الأحماض الأمينية، أو [MH]+ لتحليل الأنيونات. دقة الكتلة في XIC أقل من خمسة أجزاء في المليون، ودقة زمن الاحتفاظ (RT) هي 0.05 دقيقة. يُجرى تحليل الإثراء بحساب نسبة كل نظير مُكتشف إلى مجموع جميع نظائر المركب المقابل. تُعطى هذه النسب كنسب مئوية لكل نظير، وتُعبّر النتائج عن نسبة الإثراء المولية (MPE)، كما وُصف سابقًا (42).
تم تجانس كريات الخلايا العصبية المجمدة في محلول ميثانول بارد بنسبة 80% (حجم/حجم)، ثم خُضّت باستخدام جهاز الخلط الدوامي، وحُضنت عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خُضّت العينة مرة أخرى باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم حُرّكت عند درجة حرارة +4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. خُضعت العينة للطرد المركزي عند قوة 21000 غ لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، ثم جُمع الراسب الناتج وجُفف باستخدام جهاز تركيز SpeedVac عند درجة حرارة 25 درجة مئوية لتحليله لاحقًا. كما هو موضح أعلاه، أُجري تحليل LC-MS على الأحماض الأمينية للخلايا المفروزة. باستخدام برنامج TraceFinder (الإصدار 4.2، Thermo Fisher Scientific)، أُجري تحليل البيانات باستخدام الكتلة أحادية النظائر لكل مركب. أُجريت عملية توحيد البيانات الأيضية باستخدام حزمة برامج preprocessCore (57).
تحضير الشرائح. تم تخدير الفأر بسرعة بثاني أكسيد الكربون وفصل رأسه، ثم تم إزالة الدماغ بسرعة من الجمجمة، واستُخدمت سكين اهتزازية مملوءة بالثلج (HM-650 V، Thermo Fisher Scientific، والدورف، ألمانيا) لتقطيعه إلى مقاطع سهمية بسمك 300 إلى 375 ميكرومتر. تم استخدام غاز الكربون البارد (95% أكسجين و5% ثاني أكسيد الكربون) وCa2 منخفض + ACSF (125.0 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1.25 ملي مولار محلول فوسفات الصوديوم، 25.0 ملي مولار بيكربونات الصوديوم، 25.0 ملي مولار د-جلوكوز، 1.0 ملي مولار كلوريد الكالسيوم و6.0 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم). تم ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 والضغط الأسمولي من 310 إلى 330 ملي أوزمول. انقل شرائح الدماغ المُستخلصة إلى حجرة تحتوي على محلول ACSF عالي الكالسيوم (125.0 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1.25 ملي مولار محلول فوسفات الصوديوم، 25.0 ملي مولار بيكربونات الصوديوم، 25.0 ملي مولار د-جلوكوز، 4.0 ملي مولار كلوريد الكالسيوم، و3.5 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم) عند درجة حموضة 7.4 وضغط أسمولي يتراوح بين 310 و320 ملي أوزمول. خزّن الشرائح لمدة تتراوح بين 20 و30 دقيقة حتى تستعيد عافيتها قبل التسجيل.
التسجيل: استُخدمت منصة مجهرية مزودة بحجرة تسجيل ثابتة وعدسة موضوعية غاطسة في الماء بقوة تكبير 20x (Scientifica) لجميع التسجيلات. تم تحديد خلايا بوركنجي المفترضة من خلال: (1) حجم الجسم، (2) الموقع التشريحي للمخيخ، و(3) التعبير عن جين mtYFP الفلوري المُخبِر. تم سحب ماصة الترقيع ذات مقاومة طرفية تتراوح من 5 إلى 11 ميغا أوم بواسطة أنبوب شعري زجاجي من البوروسيليكات (GB150-10، 0.86 مم × 1.5 مم × 100 مم، Science Products، هوفهايم، ألمانيا) وماصة أفقية (P-1000، Sutter، نوفاتو، كاليفورنيا). أُجريت جميع التسجيلات بواسطة مُضخِّم تثبيت الرقعة ELC-03XS npi (npi electronic GmbH، تام، ألمانيا)، والذي تم التحكم فيه بواسطة برنامج Signal (الإصدار 6.0، Cambridge Electronic، كامبريدج، المملكة المتحدة). سُجِّلَت التجربة بمعدل أخذ عينات قدره 12.5 كيلوهرتز. رُشِّحَت الإشارة باستخدام مرشحين قصيرَي التمرير من نوع بيسل بترددات قطع تبلغ 1.3 و10 كيلوهرتز على التوالي. عُوِّضَت سعة الغشاء والماصة بواسطة دائرة تعويض باستخدام المُضخِّم. أُجريت جميع التجارب تحت تحكم كاميرا Orca-Flash 4.0 (هاماماتسو، جيردن، ألمانيا)، والتي تم التحكم بها بواسطة برنامج Hokawo (الإصدار 2.8، هاماماتسو، جيردن، ألمانيا).
إعداد وتحليل الخلية الكاملة بشكل روتيني. قبل التسجيل مباشرةً، املأ الماصة بالمحلول الداخلي الذي يحتوي على المواد التالية: 4.0 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 2.0 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 0.2 ملي مولار إي جي تي إيه، 135.0 ملي مولار غلوكونات البوتاسيوم، 10.0 ملي مولار هيبس، 4.0 ملي مولار أدينوسين ثلاثي الفوسفات (مغنيسيوم)، 0.5 ملي مولار غوانوزين ثلاثي الفوسفات (صوديوم)، و10.0 ملي مولار فوسفات الكرياتين. تم ضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول على 7.25، وكان الضغط الأسموزي 290 ملي أسمول (سكروز). مباشرةً بعد تطبيق قوة مقدارها 0 بيكو أمبير لتمزيق الغشاء، تم قياس جهد غشاء الراحة. تم قياس مقاومة الدخل بتطبيق تيارات استقطاب زائد مقدارها -40، -30، -20، و-10 بيكو أمبير. قم بقياس مقدار استجابة الجهد واستخدم قانون أوم لحساب مقاومة الدخل. تم تسجيل النشاط التلقائي في اختبار تثبيت الجهد لمدة 5 دقائق، وتم تحديد وقياس تيار ما بعد المشبك التلقائي (sPSC) باستخدام برنامج Igor Pro (الإصدار 32 7.01، WaveMetrics، ليك أوسويغو، أوريغون، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام برنامج نصي للتعرف شبه التلقائي. تم قياس منحنى التيار-الجهد وتيار الحالة المستقرة عن طريق تثبيت جهد البطارية عند جهود مختلفة (بدءًا من -110 ملي فولت) وزيادة الجهد بخطوات قدرها 5 ملي فولت. تم اختبار إنتاج جهد الفعل (AP) عن طريق تطبيق تيار مزيل للاستقطاب. تم تثبيت جهد الخلية عند -70 ملي فولت أثناء تطبيق نبضة تيار مزيل للاستقطاب. تم ضبط حجم خطوة كل وحدة تسجيل على حدة (من 10 إلى 60 بيكو أمبير). تم حساب الحد الأقصى لتردد جهد الفعل عن طريق العد اليدوي لنبضات التيار التي تسبب أعلى تردد لجهد الفعل. تم تحليل عتبة جهد الفعل باستخدام المشتق الثاني لنبضة إزالة الاستقطاب التي تحفز أولًا جهد فعل واحد أو أكثر.
إعداد وتحليل تسجيل الرقعة المثقبة. قم بتسجيل الرقعة المثقبة باستخدام البروتوكولات القياسية. استخدم ماصة خالية من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) والجوانوسين ثلاثي الفوسفات (GTP) لا تحتوي على المكونات التالية: 128 ملي مول من غلوكونات البوتاسيوم، 10 ملي مول من كلوريد البوتاسيوم، 10 ملي مول من هيبس، 0.1 ملي مول من إي جي تي إيه، و2 ملي مول من كلوريد المغنيسيوم، واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 (باستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم). تم حذف الأدينوسين ثلاثي الفوسفات والجوانوسين ثلاثي الفوسفات من المحلول داخل الخلوي لمنع نفاذية غشاء الخلية غير المنضبطة. تُملأ ماصة الرقعة بمحلول داخلي يحتوي على الأمفوتريسين (حوالي 200 إلى 250 ميكروغرام/مل؛ G4888، سيغما-ألدريتش) للحصول على تسجيل الرقعة المثقبة. تم إذابة الأمفوتريسين في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (التركيز النهائي: 0.1 إلى 0.3%؛ DMSO؛ D8418، سيغما-ألدريتش). لم يكن لتركيز ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) المستخدم أي تأثير يُذكر على الخلايا العصبية المدروسة. خلال عملية الثقب، رُصدت مقاومة القناة (Ra) باستمرار، وبدأت التجربة بعد استقرار سعة كل من Ra وجهد الفعل (20-40 دقيقة). قُيس النشاط التلقائي في تثبيت الجهد و/أو التيار لمدة تتراوح بين دقيقتين و5 دقائق. أُجري تحليل البيانات باستخدام برامج Igor Pro (الإصدار 7.05.2، WaveMetrics، الولايات المتحدة الأمريكية)، وExcel (الإصدار 2010، Microsoft Corporation، ريدموند، الولايات المتحدة الأمريكية)، وGraphPad Prism (الإصدار 8.1.2، GraphPad Software Inc.، لا جولا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). لتحديد جهود الفعل التلقائية، استُخدمت إضافة NeuroMatic v3.0c لبرنامج IgorPro. تُحدد هذه الإضافة جهود الفعل تلقائيًا باستخدام عتبة مُحددة، تُضبط بشكل فردي لكل تسجيل. وباستخدام فاصل النبضات، يُحدد تردد النبضات مع أعلى تردد لحظي ومتوسط ​​تردد النبضات.
عزل الخلايا العصبية الهرمية. بتعديل البروتوكول المنشور سابقًا، تم تنقية الخلايا العصبية الهرمية من مخيخ الفأر في مرحلة محددة (58). باختصار، تم تشريح المخيخ وتقطيعه في وسط تفكيك بارد جدًا [بدون محلول ملحي متوازن (HBSS) يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم، ومُضاف إليه 20 ملي مول من الجلوكوز، والبنسلين (50 وحدة/مل)، والستربتومايسين (0.05 ملجم/مل)]، ثم تم هضم الوسط باستخدام البابايين [محلول ملحي متوازن (HBSS) مُضاف إليه 1-سيستين هيدروكلوريد (1 ملجم/مل)، والبابايين (16 وحدة/مل)، وديوكسي ريبونوكلياز I (DNase I؛ 0.1 ملجم/مل)]. تمت المعالجة لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. أولاً، اغسل الأنسجة في وسط HBSS يحتوي على مخاط البيض (10 ملغم/مل)، وBSA (10 ملغم/مل)، وDNase (0.1 ملغم/مل) في درجة حرارة الغرفة لمنع الهضم الأنزيمي، ثم في وسط HBSS يحتوي على 20 ملي مول من الجلوكوز. يؤدي الطحن اللطيف في وسط HBSS، والبنسلين (50 وحدة/مل)، والستربتومايسين (0.05 ملغم/مل)، وDNase (0.1 ملغم/مل) إلى تحرير الخلايا المفردة. تم ترشيح معلق الخلايا الناتج من خلال مصفاة خلايا بمسام 70 ميكرومتر، ثم تم ترسيب الخلايا بالطرد المركزي (1110 دورة في الدقيقة، 5 دقائق، 4 درجات مئوية) وإعادة تعليقها في وسط الفرز [HBSS، مدعم بـ 20 ملي مول من الجلوكوز، و20% من مصل الأبقار الجنيني، والبنسلين (50 وحدة/مل)، والستربتومايسين (0.05 ملغم/مل)]. يُقيّم حيوية الخلايا باستخدام بروبيديوم يوديد، ويُضبط تركيز الخلايا إلى ما بين 1×10⁶ و2×10⁶ خلية/مل. قبل إجراء قياس التدفق الخلوي، يُرشّح المعلق عبر مصفاة خلايا بمسام 50 ميكرومتر.
جهاز قياس التدفق الخلوي. تم فرز الخلايا عند درجة حرارة 4 درجات مئوية باستخدام جهاز FACSAria III (شركة BD Biosciences) وبرنامج FACSDiva (شركة BD Biosciences، الإصدار 8.0.1). تم فرز معلق الخلايا باستخدام فوهة قطرها 100 ميكرومتر تحت ضغط 20 رطل لكل بوصة مربعة بمعدل 2800 خلية/ثانية تقريبًا. نظرًا لأن معايير الفرز التقليدية (حجم الخلية، والتمييز ثنائي النمط، وخصائص التشتت) لا تضمن العزل الصحيح للخلايا السلفية العصبية عن أنواع الخلايا الأخرى، فقد تم تحديد استراتيجية الفرز بناءً على المقارنة المباشرة لشدة بروتين YFP والتألق الذاتي في فئران mitoYFP+ ​​وفئران التحكم mitoYFP-. يتم تحفيز بروتين YFP عن طريق تسليط خط ليزر بطول موجي 488 نانومتر على العينة، ويتم الكشف عن الإشارة باستخدام مرشح تمرير نطاقي 530/30 نانومتر. في فئران mitoYFP+، تُستخدم القوة النسبية لجين Rosa26-mitoYFP المُخبِر للتمييز بين أجزاء جسم الخلية العصبية ومحورها. يُثار 7-AAD باستخدام ليزر أصفر بطول موجي 561 نانومتر، ويُكشف عنه باستخدام مرشح نطاق تمرير 675/20 نانومتر لاستبعاد الخلايا الميتة. وللفصل بين الخلايا النجمية في الوقت نفسه، صُبغت معلقات الخلايا بـ ACSA-2-APC، ثم عُرِّضت العينة لخط ليزر بطول موجي 640 نانومتر، واستُخدم مرشح نطاق تمرير 660/20 نانومتر للكشف عن الإشارة.
تم ترسيب الخلايا المجمعة بالطرد المركزي (1110 دورة في الدقيقة، 5 دقائق، 4 درجات مئوية) وحفظها عند -80 درجة مئوية لحين استخدامها. تم تصنيف فئران Mfn2cKO وصغارها في نفس اليوم لتقليل التباين الإجرائي. تم عرض بيانات FACS وتحليلها باستخدام برنامج FlowJo (شركة FlowJo LLC، آشلاند، أوريغون، الولايات المتحدة الأمريكية).
كما ذُكر سابقًا (59)، يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) لعزل الحمض النووي من الخلايا العصبية المفروزة لتحديد كمية الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) لاحقًا. تم اختبار الخطية وحساسية العتبة مبدئيًا بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي على أعداد مختلفة من الخلايا. باختصار، يتم جمع 300 خلية عصبية قشرية في محلول تحلل مكون من 50 ملي مولار من Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 8.5)، و1 ملي مولار من EDTA، و0.5% من Tween 20، وبروتينيز K (200 نانوغرام/مل)، ثم تُحضن عند 55 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة. بعد ذلك، تُحضن الخلايا عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لضمان تعطيل بروتينيز K تمامًا. باستخدام مسبار TaqMan (Thermo Fisher) الخاص بـ mt-Nd1، تم قياس mtDNA بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي في نظام 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Science، رقم الكتالوج Mm04225274_s1)، mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific، رقم الكتالوج AIVI3E8) و 18S (Thermo Fisher Scientific، رقم الكتالوج Hs99999901_s1) الجينات.
تحضير عينة البروتينات: يتم تسخين المحلول عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم معالجته بالموجات فوق الصوتية، في محلول التحلل [6 مولار كلوريد الغوانيدين، 10 ملي مولار هيدروكلوريد ثلاثي (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين، 10 ملي مولار كلوروأسيتاميد، و100 ملي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك]. يتم تحلل كريات الخلايا العصبية المجمدة في محلول حمض الهيدروكلوريك باستخدام جهاز Bioruptor (Diagenode) لمدة 10 دقائق (نبضة 30 ثانية / فترة توقف 30 ثانية). تم تخفيف العينة بنسبة 1:10 في محلول تريس-حمض الهيدروكلوريك 20 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 8.0)، ومزجها مع 300 نانوغرام من تريبسين الذهب (Promega)، وحُضنت طوال الليل عند 37 درجة مئوية لإتمام عملية الهضم. في اليوم التالي، تم طرد العينة مركزياً عند 20000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة. خُفِّف الراشح بحمض الفورميك بتركيز 0.1%، ثم أُزيلت الأملاح من المحلول باستخدام أعمدة StageTips المُحضَّرة محليًا. جُفِّفت العينة في جهاز SpeedVac (جهاز تركيز Eppendorf Plus 5305) عند درجة حرارة 45 درجة مئوية، ثم عُلِّق الببتيد في حمض الفورميك بتركيز 0.1%. جُهِّزت جميع العينات في وقت واحد من قِبَل الشخص نفسه. ولتحليل عينات الخلايا النجمية، وُسِمت 4 ميكروغرامات من الببتيدات المُزالة الأملاح بعلامة كتلة ترادفية (TMT10plex، رقم الكتالوج 90110، شركة Thermo Fisher Scientific) بنسبة ببتيد إلى كاشف TMT مقدارها 1:20. لوسم الببتيدات باستخدام TMT، أُعيد تعليق 0.8 ملغ من كاشف TMT في 70 ميكرولتر من الأسيتونيتريل اللامائي، ثم أُعيد تكوين الببتيد المجفف في 9 ميكرولتر من محلول TEAB (بيكربونات ثلاثي إيثيل الأمونيوم) بتركيز 0.1 مولار، وأُضيف إليه 7 ميكرولتر من كاشف TMT في الأسيتونيتريل. بلغ التركيز 43.75%. بعد 60 دقيقة من التحضين، أُوقف التفاعل بإضافة 2 ميكرولتر من محلول هيدروكسيل أمين بتركيز 5%. جُمعت الببتيدات الموسومة، وجُففت، وأُعيد تعليقها في 200 ميكرولتر من حمض الفورميك بتركيز 0.1%، ثم قُسمت إلى قسمين، وأُزيلت الأملاح باستخدام أعمدة StageTips محلية الصنع. باستخدام جهاز كروماتوغرافيا سائلة فائق الأداء UltiMate 3000، تم فصل أحد النصفين على عمود كروماتوغرافي Acquity بأبعاد 1 مم × 150 مم مملوء بجزيئات C18 بحجم 130 أنغستروم/1.7 ميكرومتر (Waters، رقم المنتج: 186006935، Thermo Fisher Scientific). يتم فصل الببتيدات بمعدل تدفق 30 ميكرولتر/دقيقة، وذلك بفصلها من 1% إلى 50% من المحلول المنظم B لمدة 85 دقيقة بتدرج تدريجي لمدة 96 دقيقة، ثم من 50% إلى 95% من المحلول المنظم B لمدة 3 دقائق، ثم لمدة 8 دقائق عند 95% من المحلول المنظم B. يتكون المحلول المنظم A من 5% أسيتونيتريل و10 ملي مولار من بيكربونات الأمونيوم (ABC)، بينما يتكون المحلول المنظم B من 80% أسيتونيتريل و10 ملي مولار من بيكربونات الأمونيوم (ABC). اجمع الكسور كل 3 دقائق وقم بدمجها في مجموعتين (1 + 17، 2 + 18، إلخ) وجففها في جهاز طرد مركزي فراغي.
تحليل LC-MS/MS. في تحليل مطياف الكتلة، تم فصل الببتيدات (رقم r119.aq) على عمود تحليلي PicoFrit بطول 25 سم وقطر داخلي 75 ميكرومتر (عدسة موضوعية جديدة، رقم القطعة PF7508250) مزود بوسط ReproSil-Pur 120 C18-AQ بحجم حبيبات 1.9 ميكرومتر (Dr. Maisch, mat)، باستخدام جهاز EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific، ألمانيا). حُفظ العمود عند درجة حرارة 50 درجة مئوية. يتكون المحلول المنظم A من 0.1% حمض الفورميك في الماء، بينما يتكون المحلول المنظم B من 0.1% حمض الفورميك في 80% أسيتونيتريل. تم فصل الببتيدات من 6% إلى 31% من المحلول المنظم B لمدة 65 دقيقة، ومن 31% إلى 50% من المحلول المنظم B لمدة 5 دقائق، بتدرج معدل تدفق 200 نانولتر/دقيقة. تم تحليل الببتيدات المستخلصة باستخدام مطياف الكتلة Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). أُجري قياس نسبة الكتلة إلى الشحنة (m/z) لسلائف الببتيد بدقة 120,000 في نطاق 350 إلى 1500 m/z. باستخدام طاقة تصادم مُعَيَّرة بنسبة 27%، تم اختيار أقوى سلف ذي حالة شحنة من 2 إلى 6 لتفتيت HCD عالي الطاقة. تم ضبط زمن الدورة على ثانية واحدة. تم قياس قيمة m/z لشظية الببتيد في مصيدة الأيونات باستخدام أصغر هدف AGC وهو 5×10⁴ وأقصى زمن حقن وهو 86 مللي ثانية. بعد التفتيت، وُضِع السلف على قائمة الاستبعاد الديناميكية لمدة 45 ثانية. فُصلت الببتيدات الموسومة بـ TMT على عمود Acclaim PepMap بطول 50 سم وحجم حبيبات 75 ميكرومتر (Thermo Fisher Scientific، رقم الكتالوج 164942)، وحُللت أطياف الهجرة باستخدام مطياف الكتلة Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) المزود بتقنية أيونات الموجة غير المتماثلة عالية المجال (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific)، والذي يعمل بجهدَي تعويض -50 و-70 فولت. استُخدم MS3، المُختار بناءً على السلائف المتزامنة، لقياس إشارة أيون تقرير TMT. أُجري فصل الببتيدات على جهاز EASY-nLC 1200، باستخدام إيلاج متدرج خطي بنسبة 90%، بتركيز محلول منظم يتراوح من 6% إلى 31%؛ كان المحلول المنظم A عبارة عن 0.1% حمض الفورميك، والمحلول المنظم B عبارة عن 0.1% حمض الفورميك و80% أسيتونيتريل. يعمل العمود التحليلي عند درجة حرارة 50 درجة مئوية. استخدم برنامج FreeStyle (الإصدار 1.6، Thermo Fisher Scientific) لتقسيم الملف الأصلي وفقًا لجهد تعويض FAIMS.
تحديد البروتينات وقياس كميتها. باستخدام محرك البحث المتكامل أندروميدا، تم تحليل البيانات الأصلية باستخدام برنامج ماكس كوانت الإصدار 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). بالإضافة إلى تسلسلات إنزيم كري ريكومبيناز وبروتين YFP المستخلص من قنديل البحر Aequorea victoria، تم البحث في أطياف شظايا الببتيد عن التسلسل المتعارف عليه وتسلسل النظائر البروتينية للبروتيوم المرجعي للفأر (معرف البروتيوم UP000000589، تم تنزيله من UniProt في مايو 2017). تم تحديد أكسدة الميثيونين وأستلة الطرف الأميني للبروتين كتعديلات متغيرة، بينما تم تحديد مثيلة كاربامويل السيستين كتعديلات ثابتة. تم ضبط معلمات الهضم على "النوعية" و"التربسين/P". الحد الأدنى لعدد الببتيدات وببتيدات الشفرة المستخدمة لتحديد البروتينات هو 1. الحد الأدنى لعدد الببتيدات الفريدة هو صفر. في ظل شروط مطابقة خريطة الببتيدات، بلغ معدل تحديد البروتين 0.01. تم تفعيل خيار "الببتيد الثاني". استخدم خيار "المطابقة بين عمليات التشغيل" لنقل عمليات التحديد الناجحة بين الملفات الأصلية المختلفة. استخدم الحد الأدنى لنسبة عدد LFQ وهو 1 للقياس الكمي الخالي من العلامات (LFQ) (60). يتم ترشيح شدة LFQ للحصول على قيمتين صالحتين على الأقل في مجموعة نمط جيني واحدة على الأقل عند كل نقطة زمنية، ويتم استقراءها من توزيع طبيعي بعرض 0.3 وتحرك لأسفل بمقدار 1.8. استخدم منصة الحوسبة Perseus (https://maxquant.net/perseus/) وR (https://r-project.org/) لتحليل نتائج LFQ. تم استخدام اختبار t ثنائي الاتجاه متوسط ​​من حزمة برامج limma لتحليل التعبير التفاضلي (61). يتم إجراء تحليل البيانات الاستكشافي باستخدام ggplot وFactoMineR وfactoextra وGGally وpheatmap. تم تحليل بيانات البروتينات القائمة على تقنية TMT باستخدام برنامج MaxQuant الإصدار 1.6.10.43. تم البحث عن بيانات البروتينات الخام من قاعدة بيانات البروتينات البشرية التابعة لـ UniProt، والتي تم تنزيلها في سبتمبر 2018. يشمل التحليل عامل تصحيح نقاء النظائر المقدم من الشركة المصنعة. تم استخدام حزمة limma في لغة R لتحليل التعبير التفاضلي. جميع البيانات الأصلية، ونتائج البحث في قاعدة البيانات، وسير عمل تحليل البيانات ونتائجه، مخزنة في تحالف ProteomeXchange من خلال مستودع PRIDE الشريك، برقم تعريف مجموعة البيانات PXD019690.
تُثري الشروحات الوظيفية التحليل. استُخدمت أداة تحليل مسارات Ingenuity (QIAGEN) لتحديد مدى ثراء مصطلحات الشروحات الوظيفية لمجموعة البيانات عند 8 أسابيع (الشكل 1). باختصار، استُخدمت قائمة البروتينات الكمية المُستخلصة من تحليل بيانات LC-MS/MS (مطياف الكتلة الترادفي) وفقًا لمعايير التصفية التالية: تم اختيار فأر التجارب (Mus musculus) كنوع وخلفية، واعتُبرت الفئة التي تُظهر قيمة P المُعدلة وفقًا لطريقة بنجاميني للإثراء 0.05 أو أقل ذات دلالة إحصائية. يُظهر هذا الرسم البياني أعلى خمس فئات زائدة في كل مجموعة بناءً على قيمة P المُعدلة. باستخدام اختبار t المتعدد، وبرنامج التعزيز الخطي ثنائي المراحل لبنجاميني وكريجر ويكوتيلي (Q = 5%)، أُجري تحليل التعبير البروتيني على مدار الزمن للمرشحين المهمين المُحددين في كل فئة، وتم تحليل كل صف على حدة. لا حاجة لاعتماد انحراف معياري ثابت.
للمقارنة بين نتائج هذه الدراسة وقواعد البيانات المنشورة، ولإنشاء مخطط فين الموضح في الشكل 1، قمنا بدمج قائمة البروتينات الكمية مع بيانات MitoCarta 2.0 (24). استخدم أداة "رسم مخطط فين" الإلكترونية (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) لإنشاء المخطط.
للحصول على معلومات مفصلة حول الإجراءات الإحصائية المستخدمة في تحليل البروتينات، يُرجى الرجوع إلى القسم ذي الصلة في قسم المواد والأساليب. أما بالنسبة لجميع التجارب الأخرى، فيمكن الاطلاع على معلومات مفصلة في شرحها. ما لم يُذكر خلاف ذلك، تُعرض جميع البيانات كمتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط، وقد أُجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism 8.1.2.
للاطلاع على المواد التكميلية لهذه المقالة، يرجى زيارة الرابط التالي: http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
هذه مقالة متاحة للجميع بموجب شروط رخصة المشاع الإبداعي نَسب المُؤَلِّف - غير تجاري، والتي تسمح باستخدامها وتوزيعها وإعادة إنتاجها بأي وسيلة، شريطة ألا يكون الاستخدام النهائي لأغراض تجارية وأن يكون العمل الأصلي صحيحًا. مرجع.
ملاحظة: نطلب منك فقط تزويدنا بعنوان بريدك الإلكتروني لكي يعلم الشخص الذي توصي به للصفحة أنك ترغب في أن يرى الرسالة وأنها ليست رسالة مزعجة. لن نقوم بتسجيل أي عناوين بريد إلكتروني.
يُستخدم هذا السؤال لاختبار ما إذا كنت زائرًا ولمنع إرسال الرسائل غير المرغوب فيها تلقائيًا.
بواسطة E. Motori، I. Atanassov، SMV Kochan، K. Folz-Donahue، V. Sakthivelu، P. Giavalisco، N. Toni، J. Puyal، N.-G. لارسون
كشف تحليل البروتينات للخلايا العصبية المختلة وظيفياً عن تنشيط البرامج الأيضية لمواجهة التنكس العصبي.
بواسطة E. Motori، I. Atanassov، SMV Kochan، K. Folz-Donahue، V. Sakthivelu، P. Giavalisco، N. Toni، J. Puyal، N.-G. لارسون
كشف تحليل البروتينات للخلايا العصبية المختلة وظيفياً عن تنشيط البرامج الأيضية لمواجهة التنكس العصبي.
©2020 الجمعية الأمريكية لتقدم العلوم. جميع الحقوق محفوظة. AAAS هي شريك لـ HINARI، وAGORA، وOARE، وCHORUS، وCLOCKSS، وCrossRef، وCOUNTER. تقدم العلوم ISSN 2375-2548.