نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل النتائج، نوصي باستخدام إصدار أحدث من متصفحكم (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، نعرض الموقع بدون تنسيق أو جافا سكريبت.
يُستخدم حمض البروبيونيك (PPA) لدراسة دور خلل الميتوكوندريا في اضطرابات النمو العصبي، مثل اضطراب طيف التوحد. من المعروف أن حمض البروبيونيك يُعطّل تكوين الميتوكوندريا، واستقلابها، وتجديدها. مع ذلك، لا تزال تأثيرات حمض البروبيونيك على ديناميكيات الميتوكوندريا، وانشطارها، واندماجها غير واضحة نظرًا لطبيعة هذه الآليات الزمنية المعقدة. في هذه الدراسة، استخدمنا تقنيات تصوير كمية تكميلية للتحقق من كيفية تأثير حمض البروبيونيك على البنية الدقيقة للميتوكوندريا، وشكلها، وديناميكيتها في خلايا SH-SY5Y الشبيهة بالخلايا العصبية. تسبب حمض البروبيونيك (بتركيز 5 ملي مولار) في انخفاض ملحوظ في مساحة الميتوكوندريا (p < 0.01)، وقطر فيريت ومحيطها (p < 0.05)، والمساحة 2 (p < 0.01). أظهر تحليل مواقع أحداث الميتوكوندريا زيادةً ملحوظة (p < 0.05) في عمليات الانشطار والاندماج، مما يحافظ على سلامة شبكة الميتوكوندريا في ظل ظروف الإجهاد. بالإضافة إلى ذلك، انخفض التعبير الجيني لـ cMYC (p < 0.0001)، وNRF1 (p < 0.01)، وTFAM (p < 0.05)، وSTOML2 (p < 0.0001)، وOPA1 (p < 0.05) انخفاضًا ملحوظًا. يوضح هذا إعادة تشكيل مورفولوجيا الميتوكوندريا، وتكوينها الحيوي، وديناميكيتها للحفاظ على وظيفتها في ظل ظروف الإجهاد. توفر بياناتنا رؤى جديدة حول تأثيرات PPA على ديناميكيات الميتوكوندريا، وتُبرز أهمية تقنيات التصوير في دراسة آليات التنظيم المعقدة المشاركة في استجابات الميتوكوندريا للإجهاد.
تُعدّ الميتوكوندريا عناصر أساسية في العديد من الوظائف الخلوية، تتجاوز أدوارها التقليدية في إنتاج الطاقة والتخليق الحيوي. ويُعتبر استقلاب الميتوكوندريا مُنظِّمًا رئيسيًا لإشارات الكالسيوم، والتوازن الأيضي والاختزالي، والإشارات الالتهابية، والتعديلات فوق الجينية، وتكاثر الخلايا، وتمايزها، وموتها المبرمج.¹ وعلى وجه الخصوص، يُعدّ استقلاب الميتوكوندريا بالغ الأهمية لنمو الخلايا العصبية وبقائها ووظائفها، وله دورٌ بارز في مختلف مظاهر الأمراض العصبية.^2،3،4
على مدى العقد الماضي، برزت الحالة الأيضية كمنظم رئيسي لتكوين الخلايا العصبية وتمايزها ونضجها ومرونتها^5،6. ومؤخرًا، أصبحت مورفولوجيا الميتوكوندريا وديناميكيتها من المكونات بالغة الأهمية في الانقسام الخلوي، وهي عملية ديناميكية تحافظ على مخزون من الميتوكوندريا السليمة داخل الخلايا. تُنظَّم ديناميكيات الميتوكوندريا بواسطة مسارات معقدة مترابطة، تتراوح من تكوين الميتوكوندريا وإنتاج الطاقة الحيوية إلى انشطارها واندماجها ونقلها وإزالتها^7،8. يؤدي تعطيل أي من هذه الآليات التكاملية إلى إضعاف الحفاظ على شبكات الميتوكوندريا السليمة، وله عواقب وظيفية وخيمة على النمو العصبي^9،10. في الواقع، يُلاحظ خلل في تنظيم ديناميكيات الميتوكوندريا في العديد من الاضطرابات النفسية والتنكسية العصبية والنمائية العصبية، بما في ذلك اضطرابات طيف التوحد^11،12.
يُعد اضطراب طيف التوحد اضطرابًا عصبيًا نمائيًا غير متجانس ذو بنية جينية وفوق جينية معقدة. لا جدال في وراثة اضطراب طيف التوحد، إلا أن المسببات الجزيئية الكامنة وراءه لا تزال غير مفهومة بشكل كافٍ. توفر البيانات المتراكمة من النماذج ما قبل السريرية والدراسات السريرية ومجموعات البيانات الجزيئية متعددة الأوميات أدلة متزايدة على وجود خلل في وظائف الميتوكوندريا لدى مرضى اضطراب طيف التوحد^13،14. أجرينا سابقًا فحصًا شاملًا لمثيلة الحمض النووي في مجموعة من مرضى اضطراب طيف التوحد، وحددنا جينات مختلفة المثيلة متجمعة على طول مسارات الأيض الميتوكوندري¹⁵. ثم أبلغنا عن مثيلة مختلفة لمنظمات مركزية لتكوين الميتوكوندريا وديناميكيتها، والتي ارتبطت بزيادة عدد نسخ الحمض النووي الميتوكوندري وتغير في الملامح الأيضية البولية لدى مرضى اضطراب طيف التوحد¹⁶. توفر بياناتنا أدلة متزايدة على أن ديناميكيات الميتوكوندريا واستتبابها يلعبان دورًا محوريًا في الفيزيولوجيا المرضية لاضطراب طيف التوحد. لذلك، فإن تحسين الفهم الآلي للعلاقة بين ديناميكيات الميتوكوندريا وشكلها ووظيفتها هو هدف رئيسي للبحوث الجارية في الأمراض العصبية التي تتميز بخلل وظيفي ثانوي في الميتوكوندريا.
تُستخدم التقنيات الجزيئية غالبًا لدراسة دور جينات محددة في استجابات الميتوكوندريا للإجهاد. مع ذلك، قد يكون هذا النهج محدودًا بسبب الطبيعة المتعددة الأوجه والزمنية لآليات التحكم في الانقسام الخلوي. علاوة على ذلك، يُعد التعبير التفاضلي لجينات الميتوكوندريا مؤشرًا غير مباشر للتغيرات الوظيفية، خاصةً مع اقتصار التحليل عادةً على عدد محدود من الجينات. لذا، اقتُرحت طرق أكثر مباشرة لدراسة وظيفة الميتوكوندريا والطاقة الحيوية¹⁷. يرتبط شكل الميتوكوندريا ارتباطًا وثيقًا بديناميكيتها. يُعد شكل الميتوكوندريا، وترابطها، وبنيتها عوامل حاسمة لإنتاج الطاقة وبقاء الميتوكوندريا والخلايا^5،18. إضافةً إلى ذلك، تركز المكونات المختلفة للانقسام الخلوي على التغيرات في شكل الميتوكوندريا، والتي قد تُستخدم كمؤشرات مفيدة لاختلال وظائف الميتوكوندريا، وتُوفر أساسًا لدراسات آلية لاحقة.
يمكن رصد مورفولوجيا الميتوكوندريا مباشرةً باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)، مما يسمح بدراسة تفصيلية للبنية الخلوية الدقيقة. يُتيح المجهر الإلكتروني النافذ تصوير مورفولوجيا وشكل وبنية أعراف الميتوكوندريا بدقة تصل إلى مستوى الميتوكوندريا الفردية، بدلاً من الاعتماد فقط على نسخ الجينات أو التعبير البروتيني أو معايير وظائف الميتوكوندريا في مجموعات الخلايا^17،19،20. إضافةً إلى ذلك، يُسهّل المجهر الإلكتروني النافذ دراسة التفاعلات بين الميتوكوندريا والعضيات الأخرى، مثل الشبكة الإندوبلازمية والجسيمات الذاتية، التي تلعب أدوارًا رئيسية في وظيفة الميتوكوندريا واستتبابها^21،22. لذا، يُعدّ المجهر الإلكتروني النافذ نقطة انطلاق جيدة لدراسة خلل وظائف الميتوكوندريا قبل التركيز على مسارات أو جينات محددة. مع تزايد أهمية وظيفة الميتوكوندريا في علم الأمراض العصبية، هناك حاجة واضحة إلى القدرة على دراسة مورفولوجيا الميتوكوندريا وديناميكياتها بشكل مباشر وكمي في النماذج العصبية المختبرية.
في هذه المقالة، ندرس ديناميكيات الميتوكوندريا في نموذج عصبي لاختلال وظائف الميتوكوندريا في اضطراب طيف التوحد. وقد سبق أن أبلغنا عن مثيلة تفاضلية لإنزيم بروبيونيل-CoA كاربوكسيلاز بيتا (PCCB) في ASD15، وهي وحدة فرعية من إنزيم بروبيونيل-CoA كاربوكسيلاز الميتوكوندري PCC. ومن المعروف أن خلل تنظيم PCC يؤدي إلى تراكم سام لمشتقات البروبيونيل، بما في ذلك حمض البروبيونيك (PPA) 23، 24، 25. وقد ثبت أن PPA يعطل استقلاب الخلايا العصبية ويغير السلوك في الجسم الحي، وهو نموذج حيواني معتمد لدراسة آليات النمو العصبي المتضمنة في اضطراب طيف التوحد 26، 27، 28. بالإضافة إلى ذلك، فقد أُبلغ عن أن PPA يعطل جهد غشاء الميتوكوندريا، وتكوينها، وتنفسها في المختبر، وقد استُخدم على نطاق واسع لنمذجة اختلال وظائف الميتوكوندريا في الخلايا العصبية 29، 30. ومع ذلك، فإن تأثير خلل الميتوكوندريا الناجم عن PPA على شكل الميتوكوندريا وديناميكيتها لا يزال غير مفهوم بشكل جيد.
تستخدم هذه الدراسة تقنيات تصوير تكميلية لتحديد تأثيرات PPA على مورفولوجيا الميتوكوندريا وديناميكيتها ووظيفتها في خلايا SH-SY5Y. في البداية، طورنا طريقة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لتصوير التغيرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا وبنيتها الدقيقة^17،31،32. ونظرًا لطبيعة الميتوكوندريا الديناميكية³³، استخدمنا أيضًا تحليل تحديد موقع أحداث الميتوكوندريا (MEL) لتحديد التغيرات في التوازن بين عمليات الانشطار والاندماج، وعدد الميتوكوندريا وحجمها تحت تأثير إجهاد PPA. أخيرًا، فحصنا ما إذا كانت مورفولوجيا الميتوكوندريا وديناميكيتها مرتبطة بتغيرات في التعبير الجيني للجينات المشاركة في التكوين الحيوي والانشطار والاندماج. وبشكل عام، توضح بياناتنا صعوبة فهم تعقيد الآليات التي تنظم ديناميكيات الميتوكوندريا. نسلط الضوء على أهمية المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) في دراسة مورفولوجيا الميتوكوندريا كنقطة نهاية تقارب قابلة للقياس للانقسام الخلوي في خلايا SH-SY5Y. كما نؤكد أن بيانات المجهر الإلكتروني النافذ توفر معلومات أكثر ثراءً عند دمجها مع تقنيات التصوير التي ترصد أيضًا الأحداث الديناميكية استجابةً للإجهاد الأيضي. وقد يُسهم المزيد من توصيف الآليات التنظيمية الجزيئية التي تدعم انقسام الخلايا العصبية في تقديم رؤى مهمة حول مكون الميتوكوندريا في الجهاز العصبي والأمراض التنكسية العصبية.
لتحفيز الإجهاد الميتوكوندري، عُولجت خلايا SH-SY5Y بـ PPA باستخدام بروبيونات الصوديوم (NaP) بتركيز 3 ملي مولار و5 ملي مولار. قبل الفحص المجهري الإلكتروني النافذ (TEM)، خضعت العينات لتحضير بالتجميد العميق باستخدام التجميد عالي الضغط والتجميد العادي (الشكل 1أ). طورنا نظامًا آليًا لتحليل صور الميتوكوندريا لقياس ثمانية معايير مورفولوجية لمجموعات الميتوكوندريا عبر ثلاث عينات بيولوجية متكررة. وجدنا أن المعالجة بـ PPA أدت إلى تغيير ملحوظ في أربعة معايير: المساحة 2، والمساحة، والمحيط، وقطر فيريت (الشكل 1ب-هـ). انخفضت المساحة 2 بشكل ملحوظ مع كلتا المعالجتين بـ PPA بتركيز 3 ملي مولار و5 ملي مولار (قيمة p = 0.0183 وp = 0.002 على التوالي) (الشكل 1ب)، بينما انخفضت المساحة (p = 0.003) والمحيط (p = 0.0106) وقطر فيريت بشكل ملحوظ أيضًا. لوحظ انخفاض ملحوظ (p = 0.0172) في مجموعة المعالجة بتركيز 5 ملي مولار مقارنةً بمجموعة التحكم (الشكل 1ج-هـ). وأظهرت الانخفاضات الملحوظة في المساحة والمحيط أن الخلايا المعالجة بـ 5 ملي مولار من حمض الفوسفوريك (PPA) تحتوي على ميتوكوندريا أصغر حجمًا وأكثر استدارة، وأن هذه الميتوكوندريا أقل استطالة من تلك الموجودة في خلايا التحكم. ويتوافق هذا أيضًا مع انخفاض ملحوظ في قطر فيريت، وهو مؤشر مستقل يدل على انخفاض المسافة القصوى بين حواف الجسيمات. كما لوحظت تغيرات في البنية الدقيقة للأعراف الميتوكوندرية: حيث أصبحت أقل وضوحًا تحت تأثير إجهاد حمض الفوسفوريك (الشكل 1أ، اللوحة ب). ومع ذلك، لم تعكس جميع الصور بوضوح البنية الدقيقة للأعراف، لذلك لم يتم إجراء تحليل كمي لهذه التغيرات. قد تعكس بيانات المجهر الإلكتروني النافذ هذه ثلاثة سيناريوهات محتملة: (1) يعزز حمض الفوسفوريك الانشطار أو يثبط الاندماج، مما يؤدي إلى انكماش الميتوكوندريا الموجودة؛ (2) يؤدي تعزيز التكوين الحيوي إلى إنشاء ميتوكوندريا جديدة أصغر حجمًا، أو (3) يحفز كلا الآليتين معًا. على الرغم من عدم إمكانية التمييز بين هذه الحالات باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ، فإن التغيرات المورفولوجية الملحوظة تشير إلى تغيرات في استتباب الميتوكوندريا وديناميكيتها تحت تأثير إجهاد PPA. وقد استكشفنا لاحقًا معايير إضافية لتوصيف هذه الديناميكيات والآليات المحتملة الكامنة وراءها بشكل أدق.
يُعيد حمض البروبيونيك (PPA) تشكيل مورفولوجيا الميتوكوندريا. (أ) صور مجهرية إلكترونية نافذة (TEM) نموذجية تُظهر انخفاض حجم الميتوكوندريا وصغر حجمها وازدياد استدارتها مع زيادة تركيز حمض البروبيونيك المُستخدم في المعالجة؛ 0 ملي مولار (غير مُعالجة)، 3 ملي مولار، و5 ملي مولار على التوالي. تشير الأسهم الحمراء إلى الميتوكوندريا. (ب-هـ) تم تحضير خلايا SH-SY5Y المُعالجة بحمض البروبيونيك لمدة 24 ساعة للفحص المجهري الإلكتروني النافذ، وتم تحليل النتائج باستخدام برنامج Fiji/ImageJ. أظهرت أربعة من المعايير الثمانية اختلافاتٍ معنوية بين الخلايا الضابطة (غير المُعالجة، 0 ملي مولار من حمض البروبيونيك) والخلايا المُعالجة (3 ملي مولار و5 ملي مولار من حمض البروبيونيك). (ب) المنطقة 2، (ج) المساحة، (د) المحيط، (هـ) قطر فيريت. استُخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه (الضابط مقابل المُعالج) واختبار دنِت للمقارنات المتعددة لتحديد الاختلافات المعنوية (p < 0.05). تمثل نقاط البيانات متوسط ​​قيمة الميتوكوندريا لكل خلية على حدة، وتمثل أشرطة الخطأ المتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط. البيانات المعروضة تمثل n = 3، أي ما لا يقل عن 24 خلية لكل تكرار؛ تم تحليل ما مجموعه 266 صورة؛ * تشير إلى p < 0.05، ** تشير إلى p < 0.01.
لزيادة فهم كيفية استجابة ديناميكيات الميتوكوندريا لـ PPA، قمنا بتلوين الميتوكوندريا باستخدام إستر إيثيل رباعي ميثيل رودامين (TMRE)، واستخدمنا التصوير المجهري المتعاقب وتحليل MEL لتحديد موقع الميتوكوندريا وقياس كميتها بعد 24 ساعة عند تركيزي 3 و5 ملي مولار من PPA. تمت معالجة أحداث الانشطار والاندماج (الشكل 2أ). بعد تحليل MEL، تم تحليل الميتوكوندريا بشكل إضافي لتحديد عدد تراكيبها ومتوسط ​​حجمها. لوحظت زيادة طفيفة ولكنها ذات دلالة إحصائية في عدد عمليات الانشطار التي تحدث عند تركيز 3 ملي مولار [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] مقارنةً بعمليات الانشطار [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] والاندماج [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)]، كما لوحظت زيادة ذات دلالة إحصائية في عمليات الاندماج [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] عند تركيز 5 ملي مولار مقارنةً بالمجموعة الضابطة (الشكل 3ب). وازداد عدد الميتوكوندريا بشكل ملحوظ عند كلا التركيزين 3 ملي مولار [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] و5 ملي مولار [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (الشكل 3ج)، بينما بقي متوسط ​​حجم كل بنية ميتوكوندرية دون تغيير (الشكل 3ج). 3د). تشير هذه النتائج مجتمعةً إلى أن إعادة تشكيل ديناميكيات الميتوكوندريا بمثابة استجابة تعويضية تحافظ بنجاح على سلامة شبكة الميتوكوندريا. ويُشير ازدياد عدد أحداث الانشطار عند تركيز 3 ملي مولار من حمض الفوسفوبرويك (PPA) إلى أن ازدياد عدد الميتوكوندريا يعود جزئيًا إلى انشطارها، ولكن نظرًا لأن متوسط ​​حجم الميتوكوندريا يبقى ثابتًا تقريبًا، فلا يمكن استبعاد التكوين الحيوي كاستجابة تعويضية إضافية. ومع ذلك، تتوافق هذه البيانات مع هياكل الميتوكوندريا الأصغر حجمًا والأكثر استدارةً التي لوحظت بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)، كما تُظهر تغيراتٍ ملحوظة في ديناميكيات الميتوكوندريا الناتجة عن حمض الفوسفوبرويك (PPA).
يحفز حمض البروبيونيك (PPA) إعادة تشكيل ديناميكية للميتوكوندريا للحفاظ على سلامة الشبكة. زُرعت خلايا SH-SY5Y، وعُولجت بتركيزي 3 و5 ملي مولار من حمض البروبيونيك لمدة 24 ساعة، ثم صُبغت بصبغة TMRE وصبغة Hoechst 33342، تلاها تحليل MEL. (أ) صور مجهرية متتابعة تمثل إسقاطات الكثافة القصوى الملونة والثنائية عند الزمن 2 (t2) لكل حالة. تم تحسين المناطق المحددة في كل صورة ثنائية وعرضها ثلاثية الأبعاد في ثلاثة أطر زمنية مختلفة (t1-t3) لتوضيح الديناميكيات مع مرور الوقت؛ تم تمييز أحداث الاندماج باللون الأخضر؛ وتم تمييز أحداث الانشطار باللون الأحمر. (ب) متوسط ​​عدد الأحداث الديناميكية لكل حالة. (ج) متوسط ​​عدد تراكيب الميتوكوندريا لكل خلية. (د) متوسط ​​حجم (ميكرومتر مكعب) كل تركيب من تراكيب الميتوكوندريا لكل خلية. البيانات المعروضة تمثل 15 خلية لكل مجموعة معالجة. تمثل أشرطة الخطأ المعروضة المتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط، مقياس الرسم = 10 ميكرومتر، * p < 0.05.
يُسبب حمض البروبيونيك (PPA) تثبيطًا نسخياً للجينات المرتبطة بديناميكيات الميتوكوندريا. عُولجت خلايا SH-SY5Y بتركيزي 3 و5 ملي مولار من حمض البروبيونيك لمدة 24 ساعة. أُجريَ التحديد الكمي النسبي للجينات باستخدام تقنية RT-qPCR، وتمت معايرتها باستخدام B2M. جينات تكوين الميتوكوندريا: (أ) cMYC، (ب) TFAM، (ج) NRF1، و(د) NFE2L2. جينات اندماج وانشطار الميتوكوندريا: (هـ) STOML2، (و) OPA1، (ز) MFN1، (ح) MFN2، و(ط) DRP1. تم اختبار الفروق ذات الدلالة الإحصائية (p < 0.05) باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (مجموعة التحكم مقابل مجموعة المعالجة) واختبار دنِت للمقارنات المتعددة: * تشير إلى p < 0.05، ** تشير إلى p < 0.01، و**** تشير إلى p < 0.0001. تمثل الأعمدة متوسط ​​التعبير ± الخطأ المعياري للمتوسط. البيانات المعروضة تمثل n = 3 (STOML2، OPA1، TFAM)، n = 4 (cMYC، NRF1، NFE2L2)، و n = 5 (MFN1، MFN2، DRP1) تكرارات بيولوجية.
تشير البيانات المستقاة من تحليلات المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) وتحليلات المجهر الإلكتروني الماسح (MEL) إلى أن حمض الفوسفوريك (PPA) يُغير شكل الميتوكوندريا وديناميكيتها. مع ذلك، لا تُقدم تقنيات التصوير هذه فهمًا للآليات الكامنة وراء هذه العمليات. لذلك، قمنا بدراسة التعبير الجيني لتسعة منظمات رئيسية لديناميكية الميتوكوندريا، وتكوينها، وانقسامها استجابةً للمعالجة بحمض الفوسفوريك. قمنا بقياس التعبير الجيني لكل من جين الورم النخاعي الخلوي (cMYC)، وعامل التنفس النووي (NRF1)، وعامل النسخ الميتوكوندري 1 (TFAM)، وعامل النسخ الشبيه بـ NFE2 (NFE2L2)، والبروتين الشبيه بالجاسترين 2 (STOML2)، وضمور العصب البصري 1 (OPA1)، والميتوفوسين 1 (MFN1)، والميتوفوسين 2 (MFN2)، والبروتين المرتبط بالدينامين 1 (DRP1) بعد 24 ساعة من المعالجة بتركيزي 3 ملي مولار و5 ملي مولار من حمض الفوسفوريك. لوحظت تأثيرات المعالجة بـ PPA عند تركيزي 3 ملي مولار (p = 0.0053، p = 0.0415، و p < 0.0001 على التوالي) و5 ملي مولار (p = 0.0031، p = 0.0233، و p < 0.0001 على التوالي) (الشكل 3أ-ج). وكان انخفاض التعبير الجيني لـ mRNA مرتبطًا بالجرعة: حيث انخفض التعبير عن cMYC وNRF1 وTFAM بمقدار 5.7 و2.6 و1.9 مرة على التوالي عند تركيز 3 ملي مولار، وبمقدار 11.2 و3 و2.2 مرة على التوالي عند تركيز 5 ملي مولار. في المقابل، لم يتغير جين NFE2L2، المسؤول عن عملية الأكسدة والاختزال المركزية، عند أي تركيز من PPA، على الرغم من ملاحظة اتجاه مماثل لانخفاض التعبير مرتبط بالجرعة (الشكل 3د).
فحصنا أيضًا تعبير الجينات الكلاسيكية المشاركة في تنظيم الانشطار والاندماج. يُعتقد أن جين STOML2 يشارك في الاندماج، والالتهام الذاتي للميتوكوندريا، والتكوين الحيوي، وقد انخفض تعبيره بشكل ملحوظ (p < 0.0001) عند تركيزي 3 ملي مولار (تغير بمقدار 2.4 ضعف) و5 ملي مولار (تغير بمقدار 2.8 ضعف) من PPA (الشكل 1، 3د). وبالمثل، انخفض تعبير جين الاندماج OPA1 عند تركيزي 3 ملي مولار (تغير بمقدار 1.6 ضعف) و5 ملي مولار (تغير بمقدار 1.9 ضعف) من PPA (p = 0.006 وp = 0.0024 على التوالي) (الشكل 3و). مع ذلك، لم نجد اختلافات ذات دلالة إحصائية في تعبير جينات الاندماج MFN1 وMFN2 أو جين الانشطار DRP1 تحت تأثير إجهاد PPA لمدة 24 ساعة (الشكل 3ز-ط). بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن مستويات أربعة بروتينات اندماج وانشطار (OPA1، MFN1، MFN2، وDRP1) لم تتغير في ظل الظروف نفسها (الشكل 4أ-د). من المهم ملاحظة أن هذه البيانات تعكس حالةً واحدةً في الزمن، وقد لا تعكس التغيرات في التعبير البروتيني أو مستويات النشاط خلال المراحل المبكرة من إجهاد PPA. مع ذلك، تشير الانخفاضات الملحوظة في التعبير عن cMYC، وNRF1، وTFAM، وSTOML2، وOPA1 إلى خلل تنظيمي كبير في نسخ استقلاب الميتوكوندريا، وتكوينها، وديناميكيتها. علاوة على ذلك، تُبرز هذه البيانات فائدة تقنيات التصوير في دراسة التغيرات النهائية في وظيفة الميتوكوندريا بشكل مباشر.
لم تتغير مستويات بروتينات عوامل الاندماج والانشطار بعد المعالجة بحمض البروبيونيك (PPA). عولجت خلايا SH-SY5Y بتركيزي 3 و5 ملي مولار من حمض البروبيونيك لمدة 24 ساعة. تم قياس مستويات البروتين باستخدام تحليل لطخة ويسترن، وتمت معايرة مستويات التعبير بالنسبة إلى البروتين الكلي. يوضح الشكل متوسط ​​التعبير البروتيني وصورًا تمثيلية للطخات ويسترن للبروتين المستهدف والبروتين الكلي. أ - OPA1، ب - MFN1، ج - MFN2، د - DRP1. تمثل الأعمدة المتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط، والبيانات المعروضة تمثل 3 تكرارات بيولوجية (n = 3). أُجريت مقارنات متعددة (p < 0.05) باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه واختبار دونيت. يظهر الجل الأصلي واللطخة في الشكل S1.
يرتبط خلل الميتوكوندريا بأمراض متعددة الأجهزة، تتراوح بين الأمراض الأيضية والقلبية الوعائية والعضلية، وصولًا إلى الأمراض العصبية^1،10. وترتبط العديد من الأمراض التنكسية العصبية بخلل الميتوكوندريا، مما يُبرز أهمية هذه العضيات طوال حياة الدماغ. تشمل هذه الأمراض مرض باركنسون، ومرض الزهايمر، واضطراب طيف التوحد^3،4،18. مع ذلك، يُعدّ الوصول إلى أنسجة المخ لدراسة هذه الأمراض أمرًا صعبًا، لا سيما على المستوى الآلي، مما يجعل النماذج الخلوية بديلًا ضروريًا. في هذه الدراسة، نستخدم نموذجًا خلويًا يعتمد على خلايا SH-SY5Y المعالجة بـ PPA لمحاكاة خلل الميتوكوندريا المُلاحظ في الأمراض العصبية، وخاصة اضطرابات طيف التوحد. قد يُسهم استخدام نموذج PPA هذا لدراسة ديناميكيات الميتوكوندريا في الخلايا العصبية في فهم أسباب اضطراب طيف التوحد.
استكشفنا إمكانية استخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لمراقبة التغيرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا. من المهم الإشارة إلى ضرورة استخدام المجهر الإلكتروني النافذ بشكل صحيح لتعظيم فعاليته. يسمح تحضير العينات المجمدة بحفظ أفضل للبنى العصبية من خلال تثبيت المكونات الخلوية وتقليل تكوّن التشوهات في آنٍ واحد.³⁴ وتماشياً مع ذلك، لاحظنا أن خلايا SH-SY5Y الشبيهة بالخلايا العصبية تحتوي على عضيات دون خلوية سليمة وميتوكوندريا مستطيلة (الشكل 1أ). يُبرز هذا فائدة تقنيات التحضير بالتجميد لدراسة مورفولوجيا الميتوكوندريا في نماذج الخلايا العصبية. على الرغم من أن القياسات الكمية ضرورية للتحليل الموضوعي لبيانات المجهر الإلكتروني النافذ، إلا أنه لا يوجد إجماع حتى الآن على المعايير المحددة التي ينبغي قياسها لتأكيد التغيرات المورفولوجية في الميتوكوندريا. استنادًا إلى عدد كبير من الدراسات التي فحصت مورفولوجيا الميتوكوندريا كميًا 17،31،32، قمنا بتطوير مسار آلي لتحليل صور الميتوكوندريا يقيس ثمانية معايير مورفولوجية، وهي: المساحة، المساحة2، نسبة العرض إلى الارتفاع، المحيط، الدائرية، الدرجة، قطر فيريت، والاستدارة.
من بينها، قلّل PPA بشكل ملحوظ من المساحة 2، والمساحة، والمحيط، وقطر فيريت (الشكل 1ب-هـ). يُشير هذا إلى أن الميتوكوندريا أصبحت أصغر حجمًا وأكثر استدارة، وهو ما يتوافق مع الدراسات السابقة التي أظهرت انخفاضًا في مساحة الميتوكوندريا بعد 72 ساعة من الإجهاد الميتوكوندري الناجم عن PPA30. قد تُشير هذه السمات المورفولوجية إلى انشطار الميتوكوندريا، وهي عملية ضرورية لعزل المكونات التالفة من شبكة الميتوكوندريا لتعزيز تحللها من خلال الالتهام الذاتي للميتوكوندريا35،36،37. من ناحية أخرى، قد يرتبط انخفاض متوسط ​​حجم الميتوكوندريا بزيادة التكوين الحيوي، مما يؤدي إلى تكوين ميتوكوندريا صغيرة حديثة التكوين. تُمثل زيادة الانشطار أو التكوين الحيوي استجابة تعويضية للحفاظ على الانقسام الخلوي في مواجهة الإجهاد الميتوكوندري. ومع ذلك، لا يُمكن استبعاد انخفاض نمو الميتوكوندريا، أو ضعف الاندماج، أو غيرها من الحالات.
على الرغم من أن الصور عالية الدقة التي يُنتجها المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) تسمح بتحديد الخصائص المورفولوجية على مستوى الميتوكوندريا الفردية، إلا أن هذه الطريقة تُنتج لقطات ثنائية الأبعاد عند نقطة زمنية واحدة. لدراسة الاستجابات الديناميكية للإجهاد الأيضي، قمنا بتلوين الميتوكوندريا باستخدام TMRE واستخدمنا التصوير المجهري المتعاقب مع تحليل MEL، مما يسمح بالتصوير ثلاثي الأبعاد عالي الإنتاجية للتغيرات في شبكة الميتوكوندريا بمرور الوقت^33،38. لاحظنا تغيرات طفيفة ولكنها ذات دلالة إحصائية في ديناميكيات الميتوكوندريا تحت تأثير إجهاد PPA (الشكل 2). عند تركيز 3 ملي مولار، ازداد عدد أحداث الانشطار بشكل ملحوظ، بينما بقيت أحداث الاندماج كما هي في المجموعة الضابطة. لوحظ ازدياد في عدد كل من أحداث الانشطار والاندماج عند تركيز 5 ملي مولار من PPA، ولكن هذه التغيرات كانت متناسبة تقريبًا، مما يشير إلى أن حركية الانشطار والاندماج تصل إلى حالة التوازن عند التركيزات الأعلى (الشكل 2ب). لم يتغير متوسط ​​حجم الميتوكوندريا عند تركيزي 3 و5 ملي مولار من حمض الفوسفوريك، مما يشير إلى الحفاظ على سلامة شبكة الميتوكوندريا (الشكل 2د). ويعكس هذا قدرة شبكات الميتوكوندريا الديناميكية على الاستجابة للإجهاد الأيضي الخفيف للحفاظ على التوازن الداخلي بفعالية دون التسبب في تفتت الشبكة. عند تركيز 3 ملي مولار من حمض الفوسفوريك، تكون الزيادة في الانشطار كافية لتعزيز الانتقال إلى حالة توازن جديدة، ولكن يلزم إعادة تشكيل حركي أعمق استجابةً للإجهاد الناجم عن التركيزات الأعلى من حمض الفوسفوريك.
ازداد عدد الميتوكوندريا عند كلا تركيزي الإجهاد الناتج عن PPA، لكن متوسط ​​حجم الميتوكوندريا لم يتغير بشكل ملحوظ (الشكل 2ج). قد يُعزى ذلك إلى زيادة التكوين الحيوي أو زيادة الانقسام؛ ومع ذلك، في غياب انخفاض ملحوظ في متوسط ​​حجم الميتوكوندريا، فمن المرجح أن يزداد التخليق الحيوي. ومع ذلك، تدعم البيانات الواردة في الشكل 2 وجود آليتين تعويضيتين: زيادة في عدد أحداث الانشطار، بما يتوافق مع زيادة نشاط انشطار الميتوكوندريا، وزيادة في عدد الأحداث، بما يتوافق مع التكوين الحيوي للميتوكوندريا. في نهاية المطاف، قد يتكون التعويض الديناميكي للإجهاد الخفيف من عمليات متزامنة تشمل الانشطار والاندماج والتكوين الحيوي والالتهام الذاتي للميتوكوندريا. على الرغم من أن باحثين سابقين أظهروا أن PPA يعزز الانقسام الخلوي^30،39 والالتهام الذاتي للميتوكوندريا²⁹، فإننا نقدم دليلاً على إعادة تشكيل ديناميكيات انشطار واندماج الميتوكوندريا استجابةً لـ PPA. تؤكد هذه البيانات التغيرات المورفولوجية التي لوحظت بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ وتوفر مزيدًا من التبصر في الآليات المرتبطة بخلل الميتوكوندريا الناجم عن PPA.
نظرًا لعدم تقديم تحليل المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) أو تحليل MEL دليلًا مباشرًا على آليات تنظيم الجينات الكامنة وراء التغيرات المورفولوجية الملحوظة، فقد فحصنا التعبير الجيني للجينات المشاركة في استقلاب الميتوكوندريا وتكوينها وديناميكيتها. يُعدّ الجين الأولي المسرطن cMYC عامل نسخ يشارك في تنظيم الميتوكوندريا، وتحلل الجلوكوز، واستقلاب الأحماض الأمينية والأحماض الدهنية⁴⁰. بالإضافة إلى ذلك، من المعروف أن cMYC ينظم التعبير عن ما يقرب من 600 جين ميتوكوندريا مشارك في نسخ الميتوكوندريا وترجمتها وتجميع معقداتها، بما في ذلك NRF1 وTFAM⁴¹. يُعدّ كل من NRF1 وTFAM منظمين مركزيين للانقسام الخلوي، حيث يعملان في مسار PGC-1α لتنشيط تضاعف الحمض النووي للميتوكوندريا. يتم تنشيط هذا المسار بواسطة إشارات cAMP وAMPK، وهو حساس لاستهلاك الطاقة والإجهاد الأيضي. قمنا أيضًا بفحص NFE2L2، وهو منظم للأكسدة والاختزال لتكوين الميتوكوندريا، لتحديد ما إذا كانت تأثيرات PPA قد تتوسطها الإجهاد التأكسدي.
على الرغم من ثبات مستوى التعبير عن NFE2L2، فقد لاحظنا انخفاضًا ثابتًا يعتمد على الجرعة في التعبير عن cMYC وNRF1 وTFAM بعد 24 ساعة من المعالجة بـ 3 مليمولار و5 مليمولار من PPA (الشكل 3أ-ج). وقد سُجّل سابقًا انخفاض مستوى التعبير عن cMYC كاستجابة للإجهاد الميتوكوندري،⁴² وعلى العكس، يمكن أن يؤدي انخفاض مستوى التعبير عن cMYC إلى خلل في وظائف الميتوكوندريا من خلال إعادة تشكيل استقلابها، وترابط شبكتها، واستقطاب غشائها.⁴³ ومن المثير للاهتمام أن cMYC يشارك أيضًا في تنظيم انشطار الميتوكوندريا واندماجها،^42،43 ومن المعروف أنه يزيد من فسفرة DRP1 وتمركزها في الميتوكوندريا أثناء انقسام الخلايا،⁴⁴ بالإضافة إلى دوره في إعادة تشكيل مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا الجذعية العصبية.⁴⁵ في الواقع، تُظهر الخلايا الليفية التي تفتقر إلى جين cMYC انخفاضًا في حجم الميتوكوندريا، وهو ما يتوافق مع التغيرات الناجمة عن إجهاد PPA43. تُوضح هذه البيانات علاقةً مثيرةً للاهتمام، ولكنها غير واضحة حتى الآن، بين جين cMYC وديناميكيات الميتوكوندريا، مما يُوفر هدفًا واعدًا للدراسات المستقبلية حول إعادة تشكيل الميتوكوندريا الناجمة عن إجهاد PPA.
يتوافق انخفاض مستويات NRF1 وTFAM مع دور cMYC كمنشط نسخ مهم. وتتفق هذه البيانات أيضًا مع دراسات سابقة أُجريت على خلايا سرطان القولون البشري، والتي أظهرت أن PPA يُقلل من التعبير الجيني لـ NRF1 mRNA بعد 22 ساعة، وهو ما ارتبط بنضوب ATP وزيادة ROS46. كما أفاد هؤلاء الباحثون أن التعبير الجيني لـ TFAM ازداد بعد 8.5 ساعة، ولكنه عاد إلى مستوياته الأساسية بعد 22 ساعة. في المقابل، أظهرت دراسة كيم وآخرون (2019) انخفاضًا ملحوظًا في التعبير الجيني لـ TFAM mRNA بعد 4 ساعات من التعرض لإجهاد PPA في خلايا SH-SY5Y؛ ومع ذلك، بعد 72 ساعة، ازداد التعبير البروتيني لـ TFAM بشكل ملحوظ، كما ازداد عدد نسخ mtDNA بشكل ملحوظ. وبالتالي، فإن انخفاض عدد جينات تكوين الميتوكوندريا الذي لاحظناه بعد 24 ساعة لا يستبعد احتمال أن تكون الزيادة في عدد الميتوكوندريا مرتبطة بتنشيط عملية التكوين في مراحل زمنية أبكر. أظهرت دراسات سابقة أن حمض البروبيونيك (PPA) يزيد بشكل ملحوظ من مستوى mRNA وبروتين PGC-1α في خلايا SH-SY5Y بعد 4 ساعات و30 دقيقة، بينما يعزز حمض البروبيونيك تكوين الميتوكوندريا في خلايا كبد العجول عبر PGC-1α بعد 12 ساعة و39 دقيقة. ومن المثير للاهتمام أن PGC-1α ليس فقط منظمًا مباشرًا لنسخ NRF1 وTFAM، بل ثبت أيضًا أنه ينظم نشاط MFN2 وDRP1 من خلال تنظيم الانشطار والاندماج.⁴⁷ وبالنظر إلى هذه النتائج مجتمعة، يتضح الترابط الوثيق بين آليات تنظيم الاستجابات التعويضية للميتوكوندريا الناتجة عن PPA. علاوة على ذلك، تعكس بياناتنا خللًا كبيرًا في تنظيم النسخ لعمليات التكوين والتمثيل الغذائي تحت تأثير PPA.
تُعدّ جينات STOML2 وOPA1 وMFN1 وMFN2 وDRP1 من بين المنظمات المركزية لانشطار الميتوكوندريا واندماجها وديناميكيتها^37،48،49. مع وجود العديد من الجينات الأخرى المشاركة في ديناميكيات الميتوكوندريا، فقد وُجد سابقًا أن جينات STOML2 وOPA1 وMFN2 تُظهر مثيلة مختلفة في مجموعات مرضى اضطراب طيف التوحد¹⁶، كما أفادت العديد من الدراسات المستقلة بحدوث تغيرات في عوامل النسخ هذه استجابةً للإجهاد الميتوكوندري^50،51،52. وقد انخفض تعبير كل من OPA1 وSTOML2 بشكل ملحوظ عند المعالجة بـ 3 ملي مولار و5 ملي مولار من PPA (الشكل 3هـ، و). يُعدّ OPA1 أحد المنظمات الكلاسيكية لاندماج الميتوكوندريا من خلال التفاعل المباشر مع MFN1 وMFN2، ويلعب دورًا في إعادة تشكيل الأعراف الميتوكوندرية وشكلها⁵³. لا يزال الدور الدقيق لـ STOML2 في ديناميكيات الميتوكوندريا غير واضح، لكن الأدلة تشير إلى أنه يلعب دورًا في اندماج الميتوكوندريا، والتكوين الحيوي، والالتهام الذاتي للميتوكوندريا.
يُشارك بروتين STOML2 في الحفاظ على اقتران التنفس الميتوكوندري وتكوين مُركبات سلسلة التنفس^54،55، وقد ثبت أنه يُغير بشكلٍ كبير الخصائص الأيضية للخلايا السرطانية⁵⁶. أظهرت الدراسات أن STOML2 يُعزز جهد غشاء الميتوكوندريا وتكوينها الحيوي من خلال التفاعل مع BAN والكارديوليبين^55،57،58. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت دراسات مستقلة أن التفاعل بين STOML2 وPINK1 يُنظم عملية الالتهام الذاتي للميتوكوندريا^59،60. والجدير بالذكر أن STOML2 يتفاعل مباشرةً مع MFN2 ويُثبته، كما أنه يلعب دورًا هامًا في تثبيت نظائر OPA1 الطويلة عن طريق تثبيط البروتياز المسؤول عن تحلل OPA1^53،61،62. قد يجعل انخفاض تعبير STOML2 المُلاحظ في تفاعلات PPA هذه البروتينات الاندماجية أكثر عُرضةً للتحلل عبر مسارات تعتمد على اليوبيكويتين والبروتيازوم⁴⁸. على الرغم من أن الدور الدقيق لـ STOML2 و OPA1 في الاستجابة الديناميكية لـ PPA غير واضح، إلا أن انخفاض التعبير عن هذه الجينات المندمجة (الشكل 3) قد يخل بالتوازن بين الانشطار والاندماج ويؤدي إلى انخفاض حجم الميتوكوندريا (الشكل 3). 1).
من جهة أخرى، لم يتغير مستوى بروتين OPA1 بعد 24 ساعة، بينما لم تتغير مستويات mRNA والبروتين لكل من MFN1 وMFN2 وDRP1 بشكل ملحوظ بعد المعالجة بـ PPA (الشكل 3g-i، الشكل 4). قد يشير هذا إلى عدم وجود تغييرات في تنظيم هذه العوامل المشاركة في اندماج وانشطار الميتوكوندريا. مع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن كلًا من هذه الجينات الأربعة يخضع أيضًا لتنظيم تعديلات ما بعد النسخ (PTMs) التي تتحكم في نشاط البروتين. يمتلك OPA1 ثمانية متغيرات تضفير بديلة تُقطع إنزيميًا في الميتوكوندريا لإنتاج شكلين متماثلين متميزين 63. ويحدد التوازن بين الشكلين الطويل والقصير في نهاية المطاف دور OPA1 في اندماج الميتوكوندريا والحفاظ على شبكة الميتوكوندريا 64. يتم تنظيم نشاط بروتين DRP1 عن طريق فسفرة بروتين كيناز II المعتمد على الكالسيوم/الكالمودولين (CaMKII)، بينما يتم تنظيم تحلله عن طريق اليوبيكويتين والسومويليشن⁶⁵. وأخيرًا، يُعد كل من DRP1 وMFN1/2 من بروتينات GTPases، لذا قد يتأثر نشاطهما بمعدل إنتاج GTP في الميتوكوندريا⁶⁶. لذلك، على الرغم من ثبات مستوى التعبير عن هذه البروتينات، إلا أن هذا قد لا يعكس ثبات نشاط البروتين أو موقعه^67،68. في الواقع، غالبًا ما تُشكل مجموعات بروتينات ما بعد التعديل (PTM) خط الدفاع الأول المسؤول عن التوسط في استجابات الإجهاد الحاد. في ظل وجود إجهاد أيضي معتدل في نموذجنا، من المرجح أن تُعزز تعديلات ما بعد التعديل (PTM) زيادة نشاط بروتينات الاندماج والانشطار لاستعادة سلامة الميتوكوندريا بشكل كافٍ دون الحاجة إلى تنشيط إضافي لهذه الجينات على مستوى mRNA أو البروتين.
تُبرز البيانات المذكورة أعلاه، مجتمعةً، التنظيم المعقد والمتغير زمنيًا لشكل الميتوكوندريا، والتحديات التي تواجه فهم هذه الآليات. لدراسة التعبير الجيني، من الضروري أولًا تحديد الجينات المستهدفة في المسار. مع ذلك، تُظهر بياناتنا أن الجينات في المسار نفسه لا تستجيب بالطريقة نفسها لنفس الإجهاد. في الواقع، أظهرت دراسات سابقة أن الجينات المختلفة في المسار نفسه قد تُظهر أنماط استجابة زمنية مختلفة^30،46. إضافةً إلى ذلك، توجد آليات معقدة ما بعد النسخ تُخلّ بالعلاقة بين النسخ ووظيفة الجين. يمكن لدراسات البروتينات أن تُقدّم رؤىً ثاقبة حول تأثير تعديلات ما بعد النسخ على وظيفة البروتين، لكنها تُطرح أيضًا تحديات، منها انخفاض الإنتاجية، وارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وضعف الدقة.
في هذا السياق، يمتلك دراسة مورفولوجيا الميتوكوندريا باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) والتصوير المجهري الإلكتروني (MEL) إمكانات هائلة للإجابة على تساؤلات جوهرية حول العلاقة بين ديناميكيات الميتوكوندريا ووظيفتها، وكيف يؤثر ذلك على الأمراض. والأهم من ذلك، يوفر المجهر الإلكتروني النافذ طريقة مباشرة لقياس مورفولوجيا الميتوكوندريا كمؤشر جامع لاختلال وظائفها وديناميكياتها⁵¹. كما يوفر التصوير المجهري الإلكتروني طريقة مباشرة لتصوير عمليات الانشطار والاندماج في بيئة خلوية ثلاثية الأبعاد، مما يسمح بتحديد كمية إعادة تشكيل الميتوكوندريا الديناميكية حتى في غياب تغيرات في التعبير الجيني³³. نسلط الضوء هنا على فائدة تقنيات تصوير الميتوكوندريا في أمراض الميتوكوندريا الثانوية. تتميز هذه الأمراض عادةً بإجهاد أيضي مزمن خفيف يتسم بإعادة تشكيل دقيقة لشبكات الميتوكوندريا بدلاً من تلف حاد في الميتوكوندريا. ومع ذلك، فإن تعويض الميتوكوندريا اللازم للحفاظ على الانقسام الخلوي في ظل الإجهاد المزمن له عواقب وظيفية عميقة. في سياق علم الأعصاب، قد يوفر فهم أفضل لهذه الآليات التعويضية معلومات مهمة حول علم الأمراض العصبية متعدد التأثيرات المرتبط بخلل الميتوكوندريا.
في نهاية المطاف، تُبرز بياناتنا أهمية تقنيات التصوير في فهم التداعيات الوظيفية للتفاعلات المعقدة بين التعبير الجيني، وتعديلات البروتين، ونشاط البروتين، والتي تتحكم في ديناميكيات الميتوكوندريا العصبية. استخدمنا PPA لمحاكاة خلل الميتوكوندريا في نموذج خلوي عصبي، بهدف فهم المكون الميتوكوندري في اضطراب طيف التوحد. أظهرت خلايا SH-SY5Y المعالجة بـ PPA تغيرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا: فقد أصبحت صغيرة ومستديرة، وكانت الأعراف الميتوكوندرية غير واضحة المعالم عند فحصها بالمجهر الإلكتروني النافذ. يُشير تحليل MEL إلى أن هذه التغيرات تحدث بالتزامن مع زيادة في عمليات الانشطار والاندماج للحفاظ على شبكة الميتوكوندريا استجابةً للإجهاد الأيضي الخفيف. علاوة على ذلك، يُعطّل PPA بشكلٍ ملحوظ التنظيم النسخي لعملية استقلاب الميتوكوندريا وتوازنها. حددنا cMYC وNRF1 وTFAM وSTOML2 وOPA1 كمنظمات رئيسية للميتوكوندريا تتأثر بإجهاد PPA، وقد تلعب دورًا في إحداث تغييرات في مورفولوجيا ووظيفة الميتوكوندريا بفعل PPA. هناك حاجة لدراسات مستقبلية لتوصيف التغيرات الزمنية التي يُحدثها PPA في التعبير الجيني ونشاط البروتين، وموقعه، وتعديلاته ما بعد الترجمة. تُبرز بياناتنا تعقيد وترابط الآليات التنظيمية التي تتوسط استجابة الميتوكوندريا للإجهاد، وتُظهر فائدة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) وتقنيات التصوير الأخرى لإجراء دراسات آلية أكثر دقة.
تم شراء سلالة خلايا SH-SY5Y (ECACC، 94030304-1VL) من شركة سيجما-ألدريتش. تمت زراعة خلايا SH-SY5Y في وسط دولبيكو المعدل من وسط إيجل/مزيج المغذيات F-12 (DMEM/F-12) مع إل-جلوتامين (SC09411، ساينسيل) في قوارير سعة 25 سم² مُدعمة بـ 20% من مصل الأبقار الجنيني (FBS) (10493106، ثيرموفيشير ساينتيفيك) و1% من البنسلين-ستربتومايسين (P4333-20ML، سيجما-ألدريتش) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون. تمت زراعة الخلايا حتى وصلت إلى 80% من كثافتها باستخدام تريبسين-إيدتا بتركيز 0.05% (15400054، ThermoFisher Scientific)، ثم تم طردها مركزيًا عند 300 غرام، وزُرعت بكثافة تقارب 7 × 10⁵ خلية/مل. أُجريت جميع التجارب على خلايا SH-SY5Y غير المتمايزة بين الجيلين 19 و22. يُعطى PPA على شكل فوسفات الصوديوم (NaP). يُذاب مسحوق NaP (رقم CAS 137-40-6، الصيغة الكيميائية C3H5NaO2، P5436-100G، Sigma-Aldrich) في ماء MilliQ دافئ بتركيز 1 مولار، ويُحفظ عند 4 درجات مئوية. في يوم المعالجة، يُخفف هذا المحلول بـ 1 مولار من PPA إلى تركيز 3 ملي مولار و5 ملي مولار من PPA في وسط خالٍ من المصل (DMEM/F-12 مع L-جلوتامين). كانت تراكيز المعالجة في جميع التجارب كالتالي: بدون PPA (0 مليمولار، المجموعة الضابطة)، و3 مليمولار، و5 مليمولار من PPA. أُجريت التجارب بثلاثة تكرارات بيولوجية على الأقل.
زُرعت خلايا SH-SY5Y في قوارير سعة 25 سم³ بمعدل 5.5 × 10⁵ خلية/مل، ونُمّيت لمدة 24 ساعة. أُضيف مُعالج PPA إلى القارورة قبل مرور 24 ساعة من الحضانة. جُمعت كريات الخلايا باتباع بروتوكولات الاستزراع الفرعي المعتادة لأنسجة الثدييات (الموصوفة أعلاه). أُعيد تعليق كريات الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول غلوتارالدهيد 2.5%، ومحلول PBS بتركيز 1×، وحُفظت عند 4 درجات مئوية لحين المعالجة. خُضعت خلايا SH-SY5Y للطرد المركزي لفترة وجيزة لترسيب الخلايا وإزالة محلول غلوتارالدهيد 2.5%، ومحلول PBS بتركيز 1×. أُعيد تعليق الراسب في هلام أجاروز 4% مُحضر في ماء مقطر (نسبة حجم الأجاروز إلى حجم الراسب 1:1). وُضعت قطع الأجاروز على شبكات في أطباق مسطحة، وغُطيت بـ 1-هيكساديسين قبل التجميد تحت ضغط عالٍ. جُمِّدت العينات في أسيتون جاف بنسبة 100% عند درجة حرارة -90 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ثم رُفعت درجة الحرارة إلى -80 درجة مئوية، وأُضيف إليها محلول من 1% من رباعي أكسيد الأوزميوم و0.1% من الغلوتارالدهيد. حُفظت العينات عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، رُفعت درجة الحرارة تدريجيًا إلى درجة حرارة الغرفة على مدى عدة أيام: من -80 درجة مئوية إلى -50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ثم إلى -30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ثم إلى -10 درجات مئوية لمدة 24 ساعة، وأخيرًا إلى درجة حرارة الغرفة.
بعد التحضير بالتبريد، تم تشريب العينات بالراتنج، ثم تم تحضير مقاطع رقيقة للغاية (حوالي 100 نانومتر) باستخدام جهاز الميكروتوم فائق الدقة Leica Reichert UltracutS (شركة Leica Microsystems). تم تلوين المقاطع بمحلول أسيتات اليورانيل بنسبة 2% وسترات الرصاص. تمت معاينة العينات باستخدام مجهر إلكتروني نافذ FEI Tecnai 20 (شركة ThermoFisher (المعروفة سابقًا باسم FEI)، أيندهوفن، هولندا) يعمل بجهد 200 كيلوفولت (جهاز إرسال Lab6)، وكاميرا CCD من شركة Gatan (شركة Gatan، المملكة المتحدة) مزودة بمرشح طاقة Tridiem.
في كل تكرار تقني، تم الحصول على 24 صورة على الأقل لخلايا مفردة، ليصبح المجموع 266 صورة. تم تحليل جميع الصور باستخدام ماكرو منطقة الاهتمام (ROI) وماكرو الميتوكوندريا. يعتمد ماكرو الميتوكوندريا على طرق منشورة^17،31،32، ويتيح معالجة دفعية شبه آلية لصور المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) في برنامج Fiji/ImageJ⁶⁹. باختصار: يتم عكس الصورة، ثم عكسها باستخدام طرح الخلفية بتقنية الكرة المتدحرجة (نصف قطر 60 بكسل) ومرشح تمرير النطاق بتقنية تحويل فورييه السريع (باستخدام حدين علوي وسفلي 60 و8 بكسل على التوالي)، وقمع الخطوط الرأسية بتفاوت اتجاه 5%. يتم تحديد عتبة الصورة المعالجة تلقائيًا باستخدام خوارزمية أقصى إنتروبيا، ويتم إنشاء قناع ثنائي. تم استخراج مناطق الصورة المرتبطة بمناطق الاهتمام المختارة يدويًا في صور المجهر الإلكتروني النافذ الخام، مما يُميز الميتوكوندريا ويستبعد غشاء البلازما والمناطق الأخرى عالية التباين. لكل منطقة اهتمام مُستخرجة، تم تحليل الجسيمات الثنائية التي يزيد حجمها عن 600 بكسل، وقُيست مساحة الجسيم ومحيطه ومحوريه الرئيسي والثانوي وقطر فيريت واستدارته ودائريته باستخدام وظائف القياس المُدمجة في برنامجي Fiji/ImageJ. وباتباع منهجية ميريل وفليبو وستراك (2017)، حُسبت المساحة 2 ونسبة أبعاد الجسيم (نسبة المحور الرئيسي إلى المحور الثانوي) ومعامل الشكل (FF) من هذه البيانات، حيث FF = المحيط 2/4π × المساحة. يمكن الاطلاع على تعريف الصيغة البارامترية في دراسة ميريل وفليبو وستراك (2017). تتوفر وحدات الماكرو المذكورة على منصة GitHub (انظر بيان توفر البيانات). في المتوسط، تم تحليل حوالي 5600 جسيم لكل معالجة PPA، بإجمالي حوالي 17000 جسيم (البيانات غير معروضة).
وُضعت خلايا SH-SH5Y في أطباق زراعة ذات 8 حجرات (ThermoFisher، #155411) للسماح بالالتصاق طوال الليل، ثم حُضنت مع صبغة TMRE بنسبة 1:1000 (ThermoFisher، #T669) وصبغة Hoechst 33342 بنسبة 1:200 (Sigma-Aldrich، H6024). تم الحصول على الصور باستخدام ليزرين بطول موجي 405 نانومتر و561 نانومتر على مدار 10 دقائق، وتم الحصول على الصور الخام على شكل سلسلة صور ثلاثية الأبعاد (z-stacks) تحتوي على 10 صور مجهرية بخطوة 0.2 ميكرومتر بين إطارات الصور عند 12 نقطة زمنية متتالية. تم جمع الصور باستخدام منصة Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 فائقة الدقة (Carl Zeiss، أوبركوشين، ألمانيا) باستخدام عدسة LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. تم تحليل الصور في برنامج ImageJ باستخدام مسار معالجة موصوف سابقًا ومكون ImageJ الإضافي لقياس أحداث الاندماج والانشطار، ومتوسط ​​عدد هياكل الميتوكوندريا، ومتوسط ​​حجم الميتوكوندريا لكل خلية33. وحدات الماكرو MEL متاحة على GitHub (انظر بيان توفر البيانات).
زُرعت خلايا SH-SY5Y في أطباق بستة آبار بكثافة 0.3 × 10⁶ خلية/مل لمدة 24 ساعة قبل المعالجة. استُخلص الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام بروتوكول Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055، Zymo Research) مع تعديلات طفيفة: أُضيف 300 ميكرولتر من محلول تحلل الحمض النووي الريبوزي إلى كل بئر قبل إزالته، ثم حُللت كل عينة كخطوة أخيرة باستخدام 30 ميكرولتر من محلول استخلاص DNase/RNase. تم فحص جميع العينات من حيث الكمية والنوعية باستخدام مطياف NanoDrop ND-1000 للأشعة فوق البنفسجية والمرئية. حُصل على البروتين الكلي من مستخلصات الخلايا باستخدام 200 ميكرولتر من محلول تحلل RIPA، وقُدِّر تركيز البروتين باستخدام اختبار برادفورد للبروتين.
تم تصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043، Meridian Bioscience) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة مع بعض التعديلات. تم تصنيع الحمض النووي التكميلي في تفاعلات حجمها 20 ميكرولتر باستخدام 0.7 إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي الكلي (RNA). تم اختيار البادئات من أوراق بحثية منشورة سابقًا (42، 71، 72، 73، 74، 75، 76، 77، 78) (الجدول S1)، وصُممت المجسات المصاحبة باستخدام أداة PrimerQuest من Integrated DNA Technologies. تم توحيد جميع الجينات محل الاهتمام بالنسبة لجين B2M النووي. تم قياس التعبير الجيني لـ STOML2 وNRF1 وNFE2L2 وTFAM وcMYC وOPA1 باستخدام تقنية RT-qPCR. احتوى المزيج الرئيسي على بوليميراز LUNA Taq (M3003L، شركة نيو إنجلاند بيولابس)، و10 ميكرومول من البادئات الأمامية والخلفية، وcDNA، وماء مُعَقَّم لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ليصل الحجم النهائي لكل تفاعل إلى 10 ميكرولتر. تم قياس التعبير الجيني لجينات الانقسام والانشطار (DRP1، MFN1/2) باستخدام فحوصات TaqMan المتعددة. استُخدم مزيج Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S، شركة نيو إنجلاند بيولابس) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة. يحتوي المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي المتعدد (RT-qPCR) على بوليميراز LUNA Taq بتركيز 1X، و10 ميكرومول من البادئات الأمامية والخلفية، و10 ميكرومول من المجس، وcDNA، وماء مُعَقَّم لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ليصل الحجم النهائي لكل تفاعل إلى 20 ميكرولتر. أُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) باستخدام جهاز Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - الرقم التسلسلي: R0618110). تُبيّن ظروف التفاعل في الجدول S1. تم تضخيم جميع عينات الحمض النووي التكميلي (cDNA) ثلاث مرات، وتم إنشاء منحنى معياري باستخدام سلسلة من التخفيفات العشرية. تم استبعاد القيم الشاذة في العينات الثلاثية ذات الانحراف المعياري لعتبة الدورة (Ct) > 0.5 من التحليل لضمان قابلية تكرار البيانات.^30,72 تم حساب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2-ΔΔCt⁷⁹.
خُلطت عينات البروتين (60 ميكروغرام) مع محلول تحميل Laemmli بنسبة 2:1، ثم فُصلت باستخدام هلام بروتين عديم اللون بنسبة 12% (Bio-Rad #1610184). نُقلت البروتينات إلى غشاء PVDF (فلوريد البولي فينيليدين) (#170-84156، Bio-Rad) باستخدام نظام Trans-Blot Turbo (#170-4155، Bio-Rad). حُجب الغشاء وحُضن مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة (OPA1، MFN1، MFN2، وDRP1) (مخففة بنسبة 1:1000) لمدة 48 ساعة، ثم حُضن مع الأجسام المضادة الثانوية (1:10000) لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، صُوّرت الأغشية باستخدام ركيزة Clarity Western ECL (#170-5061، Bio-Rad) وسُجلت النتائج باستخدام نظام Bio-Rad ChemiDoc MP. استُخدم برنامج ImageLab الإصدار 6.1 لتحليل لطخة ويسترن. يظهر الجل الأصلي واللطخة في الشكل S1. معلومات الأجسام المضادة مُدرجة في الجدول S2.
تُعرض مجموعات البيانات كمتوسط ​​وانحراف معياري للمتوسط ​​(SEM) لثلاث عينات مستقلة على الأقل. تم اختبار مجموعات البيانات للتأكد من توزيعها الطبيعي باستخدام اختبار شابيرو-ويلك (ما لم يُذكر خلاف ذلك) قبل افتراض التوزيع الطبيعي وتساوي الانحرافات المعيارية، ثم إجراء التحليلات. بالإضافة إلى تحليل مجموعة البيانات باستخدام اختبار فيشر MEL LSD (p < 0.05)، وتحليل التباين أحادي الاتجاه (مقارنة متوسط ​​المعالجة بمتوسط ​​المجموعة الضابطة)، واختبار دنِت للمقارنات المتعددة لتحديد الدلالة الإحصائية (p < 0.05). تظهر قيم p الدالة إحصائيًا في الرسم البياني على النحو التالي: *p < 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001، ****p < 0.0001. أُجريت جميع التحليلات الإحصائية ورُسمت جميع الرسوم البيانية باستخدام برنامج GraphPad Prism 9.4.0.
تتوفر وحدات ماكرو Fiji/ImageJ لتحليل صور المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) للعموم على منصة GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. كما تتوفر وحدة ماكرو Mitochondrial Event Locator (MEL) للعموم على منصة GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
ميليانا أ.، ديفي ن.م.، وفيجايا أ. الميتوكوندريا: منظمات رئيسية لعمليات الأيض، والتوازن الداخلي، والإجهاد، والشيخوخة، وعلم التخلق. المجلة الإندونيسية للعلوم الطبية الحيوية. 13، 221-241 (2021).
بن شاشار، د. خلل الميتوكوندريا متعدد الأوجه في الفصام، المركب الأول كهدف مرضي محتمل. الفصام. مورد. 187، 3-10 (2017).
بوز، أ. وبيال، إم إف. خلل الميتوكوندريا في مرض باركنسون. مجلة الكيمياء العصبية. 139، 216-231 (2016).
شارما في كي، سينغ تي جي وميهتا في. الميتوكوندريا المجهدة: أهداف الغزو في مرض الزهايمر. الميتوكوندريا 59، 48-57 (2021).
بيلينغوير ب.، دوارتي جيه إم إن، شوك بي إف وفيريرا جي كيه. الميتوكوندريا والدماغ: الطاقة الحيوية وأكثر. السموم العصبية. مورد. 36، 219-238 (2019).
رانجاراجو، ف. وآخرون. الميتوكوندريا متعددة التأثيرات: تأثير الميتوكوندريا على نمو الخلايا العصبية والأمراض. مجلة علم الأعصاب. 39، 8200-8208 (2019).
كاردانيو-راموس، سي. ومورايس، في إيه. التكوين الحيوي للميتوكوندريا في الخلايا العصبية: كيف وأين. العالمية. مجلة مور. العلم. 22، 13059 (2021).
يو، ر.، ليندال، يو.، نيستر، م.، وتشاو، ج. تنظيم ديناميكيات الميتوكوندريا لدى الثدييات: الفرص والتحديات. فرونت. إندوكرين. (لوزان) 11، 374 (2020).
خاشو، م. وسلاك، ر.س. ديناميكيات الميتوكوندريا في تنظيم تكوين الخلايا العصبية: من الدماغ النامي إلى الدماغ البالغ. التطور. الديناميكية. 247، 47-53 (2018).