نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
وجدت جسيمات الأنسولين النانوية ذات المحتوى العالي من التحميل تطبيقاتٍ مختلفة في أشكال دوائية متنوعة. يهدف هذا العمل إلى تقييم تأثير عمليتي التجفيف بالتجميد والتجفيف بالرش على بنية جسيمات الكيتوزان النانوية المحملة بالأنسولين، مع أو بدون استخدام المانيتول كمادة واقية من التجميد. كما قمنا بتقييم جودة هذه الجسيمات النانوية عن طريق إعادة إذابتها. قبل التجفيف، تم تحسين حجم جسيمات الكيتوزان/ثلاثي فوسفات الصوديوم/الأنسولين المتشابكة ليكون 318 نانومتر، وكان مؤشر التشتت 0.18، وكفاءة التغليف 99.4%، ونسبة التحميل 25.01%. بعد إعادة التكوين، حافظت جميع الجسيمات النانوية، باستثناء تلك المنتجة بطريقة التجفيف بالتجميد دون استخدام المانيتول، على بنيتها الكروية. بالمقارنة مع الجسيمات النانوية المحتوية على المانيتول والمجففة بالرش، فإن الجسيمات الخالية من المانيتول أظهرت الجسيمات النانوية المجففة بالرش أصغر متوسط ​​لحجم الجسيمات (376 نانومتر) وأعلى نسبة تحميل (25.02%) مع معدل تغليف مماثل (98.7%) ومؤشر تشتت مماثل (0.20) مقارنةً بتقنيات التجفيف العادي أو التجفيف بالتجميد. كما أدى تجفيف الجسيمات النانوية بالرش دون استخدام المانيتول إلى أسرع إطلاق للأنسولين وأعلى كفاءة امتصاص خلوي. تُظهر هذه الدراسة أن التجفيف بالرش يُمكن من تجفيف جسيمات الأنسولين النانوية دون الحاجة إلى مواد حافظة للتجميد مقارنةً بطرق التجفيف بالتجميد التقليدية، مما يُوفر سعة تحميل أكبر، ومتطلبات أقل للمواد المضافة، وتكاليف تشغيل أقل، وهي ميزة كبيرة.
منذ اكتشافه عام 1922، أنقذ الأنسولين ومستحضراته الدوائية حياة مرضى السكري من النوع الأول والنوع الثاني. مع ذلك، ونظرًا لخصائصه كبروتين ذي وزن جزيئي عالٍ، يتجمع الأنسولين بسهولة، ويتحلل بواسطة الإنزيمات المحللة للبروتين، ويُطرح من الجسم عبر آلية المرور الأول. يحتاج المصابون بالسكري من النوع الأول إلى حقن الأنسولين مدى الحياة. كما يحتاج العديد من المرضى الذين شُخصوا في البداية بالسكري من النوع الثاني إلى حقن الأنسولين طويلة الأمد. تُشكل حقن الأنسولين اليومية مصدرًا رئيسيًا للألم وعدم الراحة لهؤلاء الأفراد، مع ما يترتب على ذلك من آثار سلبية على صحتهم النفسية. ونتيجة لذلك، تُجرى دراسات مكثفة على أشكال أخرى لإعطاء الأنسولين تُسبب إزعاجًا أقل، مثل الأنسولين الفموي، لما لها من إمكانية لتحسين جودة حياة ما يقرب من 5 مليارات شخص مصاب بالسكري حول العالم.
لقد حققت تقنية الجسيمات النانوية تقدماً ملحوظاً في محاولات تناول الأنسولين عن طريق الفم^4،6،7، حيث تعمل على تغليف الأنسولين وحمايته من التحلل، مما يتيح توصيله بدقة إلى مواقع محددة في الجسم. ومع ذلك، فإن استخدام تركيبات الجسيمات النانوية له عدة قيود، ويرجع ذلك أساساً إلى مشاكل استقرار معلقات الجسيمات. فقد يحدث بعض التكتل أثناء التخزين، مما يقلل من التوافر الحيوي للجسيمات النانوية المحملة بالأنسولين⁸. بالإضافة إلى ذلك، يجب مراعاة الاستقرار الكيميائي للمصفوفة البوليمرية للجسيمات النانوية والأنسولين لضمان استقرار جسيمات الأنسولين النانوية. حالياً، تُعد تقنية التجفيف بالتجميد المعيار الذهبي لإنتاج جسيمات نانوية مستقرة مع منع حدوث أي تغييرات غير مرغوب فيها أثناء التخزين⁹.
مع ذلك، تتطلب عملية التجفيف بالتجميد إضافة مواد حافظة للبرودة لمنع تأثر البنية الكروية للجسيمات النانوية بالإجهاد الميكانيكي لبلورات الجليد. وهذا يقلل بشكل ملحوظ من كمية جسيمات الأنسولين النانوية المحملة بعد التجفيف بالتجميد، حيث تشغل المادة الحافظة للبرودة معظم الوزن. لذلك، غالبًا ما تكون جسيمات الأنسولين النانوية المنتجة غير مناسبة لتصنيع تركيبات المساحيق الجافة، مثل الأقراص والأغشية الفموية، نظرًا للحاجة إلى كميات كبيرة من الجسيمات النانوية الجافة لتحقيق النطاق العلاجي للأنسولين.
يُعدّ التجفيف بالرش عمليةً صناعيةً معروفةً وغير مكلفة لإنتاج مساحيق جافة من مواد سائلة في صناعة الأدوية^10،11. يُتيح التحكم في عملية تكوين الجسيمات تغليفًا مثاليًا للعديد من المركبات النشطة بيولوجيًا^12،13. علاوةً على ذلك، فقد أصبح تقنيةً فعّالةً لتحضير البروتينات المُغلّفة للإعطاء عن طريق الفم. أثناء التجفيف بالرش، يتبخر الماء بسرعة كبيرة، مما يُساعد على إبقاء درجة حرارة لبّ الجسيم منخفضة^11،14، مما يُتيح استخدامه لتغليف المكونات الحساسة للحرارة. قبل التجفيف بالرش، يجب تجانس مادة التغليف جيدًا مع المحلول الذي يحتوي على المكونات المُغلّفة^11،14. على عكس التجفيف بالتجميد، يُحسّن التجانس قبل التغليف في التجفيف بالرش كفاءة التغليف أثناء التجفيف. بما أن عملية التغليف بالتجفيف بالرش لا تتطلب مواد واقية من التجمد، يُمكن استخدام التجفيف بالرش لإنتاج جسيمات نانوية مجففة ذات محتوى تحميل عالٍ.
تُقدم هذه الدراسة تقريرًا عن إنتاج جسيمات نانوية مُحمّلة بالأنسولين عن طريق الربط المتشابك بين الكيتوزان وثلاثي فوسفات الصوديوم باستخدام طريقة الهلام الأيوني. يُعدّ التجلط الأيوني طريقة تحضير تسمح بإنتاج الجسيمات النانوية من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية بين نوعين أو أكثر من الأيونات في ظل ظروف معينة. استُخدمت تقنيتا التجفيف بالتجميد والتجفيف بالرش لتجفيف الجسيمات النانوية المُحسّنة المُرتبطة تشابكيًا من الكيتوزان/ثلاثي فوسفات الصوديوم/الأنسولين. بعد التجفيف، تم تحليل مورفولوجيتها باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح. قُيِّمت قدرتها على إعادة التركيب من خلال قياس توزيع حجمها، وشحنتها السطحية، ومؤشر التشتت، وكفاءة التغليف، ومحتوى التحميل. كما قُيِّمت جودة الجسيمات النانوية المُذابة المُنتجة بطرق التجفيف المختلفة من خلال مقارنة قدرتها على حماية الأنسولين، وسلوك إطلاقه، وكفاءة امتصاصه الخلوي.
يُعدّ كلٌّ من الرقم الهيدروجيني للمحلول المختلط ونسبة الكيتوزان إلى الأنسولين عاملين أساسيين يؤثران على حجم الجسيمات وكفاءة التغليف (EE) للجسيمات النانوية النهائية، حيث يؤثران بشكل مباشر على عملية التجلط الأيوني. وقد أظهرت النتائج وجود ارتباط وثيق بين الرقم الهيدروجيني للمحلول المختلط وحجم الجسيمات وكفاءة التغليف (الشكل 1أ). وكما هو موضح في الشكل 1أ، مع ارتفاع الرقم الهيدروجيني من 4.0 إلى 6.0، انخفض متوسط ​​حجم الجسيمات (نانومتر) وزادت كفاءة التغليف بشكل ملحوظ، بينما عند ارتفاع الرقم الهيدروجيني إلى 6.5، بدأ متوسط ​​حجم الجسيمات بالازدياد بينما بقيت كفاءة التغليف ثابتة. ومع ازدياد نسبة الكيتوزان إلى الأنسولين، يزداد متوسط ​​حجم الجسيمات أيضًا. علاوة على ذلك، لم يُلاحظ أي تغيير في كفاءة التغليف عند تحضير الجسيمات النانوية بنسبة كتلة من الكيتوزان إلى الأنسولين أعلى من 2.5:1 (وزن/وزن) (الشكل 1ب). لذلك، تُعتبر ظروف التحضير المثلى في هذه الدراسة (الرقم الهيدروجيني) استُخدمت نسبة كتلة الكيتوزان إلى الأنسولين (2.5:1) (6.0) لتحضير جسيمات نانوية محملة بالأنسولين لإجراء المزيد من الدراسات. في ظل ظروف التحضير هذه، تم تحسين متوسط ​​حجم جسيمات الأنسولين النانوية إلى 318 نانومتر (الشكل 1ج)، وكان مؤشر التشتت (PDI) 0.18، وكفاءة التضمين 99.4%، وجهد زيتا 9.8 ملي فولت، ونسبة تحميل الأنسولين 25.01% (وزن/وزن). بناءً على نتائج المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)، كانت الجسيمات النانوية المُحسَّنة كروية الشكل تقريبًا ومنفصلة ذات حجم متجانس نسبيًا (الشكل 1د).
تحسين معلمات جسيمات الأنسولين النانوية: (أ) تأثير الرقم الهيدروجيني على متوسط ​​القطر وكفاءة التغليف (EE) لجسيمات الأنسولين النانوية (المحضرة بنسبة كتلة 5:1 من الكيتوزان والأنسولين)؛ (ب) تأثير نسبة كتلة الأنسولين على متوسط ​​القطر وكفاءة التغليف (EE) لجسيمات الأنسولين النانوية (المحضرة عند الرقم الهيدروجيني 6)؛ (ج) توزيع حجم الجسيمات لجسيمات الأنسولين النانوية المحسّنة؛ (د) صورة مجهرية إلكترونية نافذة لجسيمات الأنسولين النانوية المحسّنة.
من المعروف أن الكيتوزان بوليمر إلكتروليتي ضعيف ذو قيمة pKa تبلغ 6.5. وهو موجب الشحنة في الأوساط الحمضية لأن مجموعته الأمينية الرئيسية تتأين بواسطة أيونات الهيدروجين. لذلك، يُستخدم غالبًا كناقل لتغليف الجزيئات الكبيرة سالبة الشحنة. في هذه الدراسة، استُخدم الكيتوزان لتغليف الأنسولين ذي نقطة التعادل الكهربائي 5.3. ولأن الكيتوزان يُستخدم كمادة تغليف، فمع زيادة نسبته، يزداد سُمك الطبقة الخارجية للجسيمات النانوية تبعًا لذلك، مما ينتج عنه حجم جسيمات متوسط ​​أكبر. إضافةً إلى ذلك، يمكن لمستويات أعلى من الكيتوزان تغليف كمية أكبر من الأنسولين. في حالتنا، كانت كفاءة التغليف (EE) في أعلى مستوياتها عندما بلغت نسبة الكيتوزان إلى الأنسولين 2.5:1، ولم يطرأ أي تغيير يُذكر على كفاءة التغليف مع استمرار زيادة النسبة.
إلى جانب نسبة الكيتوزان إلى الأنسولين، يلعب الرقم الهيدروجيني دورًا حاسمًا في تحضير الجسيمات النانوية. درس غان وآخرون (17) تأثير الرقم الهيدروجيني على حجم جسيمات الكيتوزان النانوية. ووجدوا انخفاضًا مستمرًا في حجم الجسيمات حتى وصل الرقم الهيدروجيني إلى 6.0، ثم لوحظت زيادة ملحوظة في حجم الجسيمات عند رقم هيدروجيني أعلى من 6.0، وهو ما يتوافق مع ملاحظاتنا. تُعزى هذه الظاهرة إلى أن جزيء الأنسولين يكتسب شحنة سطحية سالبة مع ارتفاع الرقم الهيدروجيني، مما يُعزز التفاعلات الكهروستاتيكية مع مُركب الكيتوزان/ثلاثي فوسفات الصوديوم (TPP)، مُؤديًا إلى صغر حجم الجسيمات وارتفاع كفاءة التغليف. مع ذلك، عند ضبط الرقم الهيدروجيني على 6.5، تُزال البروتونات من مجموعات الأمين على الكيتوزان، مما يُؤدي إلى طي الكيتوزان. وبالتالي، يُؤدي ارتفاع الرقم الهيدروجيني إلى تقليل تعرض أيونات الأمين لثلاثي فوسفات الصوديوم والأنسولين، مما يُؤدي إلى انخفاض التشابك، وزيادة متوسط ​​حجم الجسيمات النهائي، وانخفاض كفاءة التغليف.
يُمكن لتحليل الخصائص المورفولوجية للجسيمات النانوية المجففة بالتجميد والتجفيف بالرش أن يُساعد في اختيار تقنيات التجفيف وتكوين المسحوق الأنسب. يجب أن تُوفر الطريقة المُفضلة استقرارًا للدواء، وشكلًا مُوحدًا للجسيمات، وحمولة عالية من الدواء، وذوبانية جيدة في المحلول الأصلي. في هذه الدراسة، وللمقارنة بين التقنيتين بشكل أفضل، استُخدمت جسيمات نانوية من الأنسولين مع أو بدون 1% من المانيتول أثناء التجفيف. يُستخدم المانيتول كعامل مُكثِّف أو عامل حماية من التجميد في تركيبات المساحيق الجافة المختلفة للتجفيف بالتجميد والتجفيف بالرش. بالنسبة للجسيمات النانوية من الأنسولين المُجففة بالتجميد بدون مانيتول، كما هو موضح في الشكل 2أ، لوحظت بنية مسحوق عالية المسامية ذات أسطح كبيرة وغير منتظمة وخشنة تحت المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). تم الكشف عن عدد قليل من الجسيمات المنفصلة في المسحوق بعد التجفيف (الشكل 2هـ). تُشير هذه النتائج إلى أن معظم الجسيمات النانوية قد تحللت أثناء التجفيف بالتجميد بدون أي عامل حماية من التجميد. بالنسبة للجسيمات النانوية من الأنسولين المجففة بالتجميد والتجفيف بالرش والتي تحتوي على 1% من المانيتول، لوحظت جسيمات نانوية كروية ذات أسطح ملساء (الشكل 2ب، د، و، ح). حافظت جسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالرش بدون مانيتول على شكلها الكروي، ولكن سطحها كان مجعدًا (الشكل 2ج). سيتم مناقشة الأسطح الكروية والمتجعدة بمزيد من التفصيل في اختبارات سلوك الإطلاق والامتصاص الخلوي أدناه. بناءً على المظهر المرئي للجسيمات النانوية المجففة، أنتجت كل من الجسيمات النانوية المجففة بالرش بدون مانيتول والجسيمات النانوية المجففة بالتجميد والمجففة بالرش مع مانيتول مساحيق نانوية ناعمة (الشكل 2و، ز، ح). كلما زادت مساحة السطح بين أسطح الجسيمات، زادت الذوبانية، وبالتالي زاد معدل الإطلاق.
مورفولوجيا جسيمات الأنسولين النانوية المجففة المختلفة: (أ) صورة مجهرية إلكترونية ماسحة لجسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالتجميد بدون مانيتول؛ (ب) صورة مجهرية إلكترونية ماسحة لجسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالتجميد مع مانيتول؛ (ج) صورة مجهرية إلكترونية ماسحة لجسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالرش بدون مانيتول؛ (د) صورة مجهرية إلكترونية ماسحة لجسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالرش مع مانيتول؛ (هـ) صورة لمسحوق جسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالتجميد بدون مانيتول؛ (و) صورة لجسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالتجميد مع مانيتول؛ (ز) صورة لمسحوق جسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالرش بدون مانيتول؛ (ح) صورة لمسحوق جسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالرش مع مانيتول.
أثناء التجفيف بالتجميد، يعمل المانيتول كمادة واقية من التجمد، محافظًا على الجسيمات النانوية في شكل غير متبلور ومانعًا تلفها بفعل بلورات الثلج¹⁹. في المقابل، لا توجد خطوة تجميد أثناء التجفيف بالرش، لذا فإن المانيتول غير ضروري في هذه الطريقة. في الواقع، أنتجت الجسيمات النانوية المجففة بالرش بدون مانيتول جسيمات نانوية أدق كما وُصف سابقًا. مع ذلك، يمكن للمانيتول أن يعمل كحشو في عملية التجفيف بالرش ليمنح الجسيمات النانوية بنية كروية أكثر²⁰ (الشكل 2د)، مما يساعد على الحصول على سلوك إطلاق منتظم لهذه الجسيمات النانوية المغلفة. بالإضافة إلى ذلك، من الواضح أنه يمكن الكشف عن بعض الجسيمات الكبيرة في كل من جسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالتجميد والمجففة بالرش والتي تحتوي على المانيتول (الشكل 2ب، د)، وهو ما قد يعود إلى تراكم المانيتول في لب الجسيم مع الأنسولين المغلف. طبقة الكيتوزان. تجدر الإشارة إلى أنه في هذه الدراسة، ولضمان بقاء البنية الكروية سليمة بعد التجفيف، تم الحفاظ على نسبة المانيتول والكيتوزان عند 5:1، بحيث يمكن لكمية كبيرة من الحشو أن تزيد من حجم الجسيمات النانوية المجففة.
تم توصيف الخليط الفيزيائي للأنسولين الحر، والكيتوزان، وثلاثي فوسفات الصوديوم (TPP)، والأنسولين باستخدام مطيافية الأشعة تحت الحمراء بتحويل فورييه بتقنية الانعكاس الكلي الموهن (FTIR-ATR). وتم توصيف جميع الجسيمات النانوية المجففة باستخدام مطيافية FTIR-ATR. ولوحظت شدة حزم عند 1641 و1543 و1412 سم⁻¹ في الجسيمات النانوية المغلفة المجففة بالتجميد مع المانيتول، وفي الجسيمات النانوية المجففة بالرش مع المانيتول وبدونه (الشكل 3). وكما ذُكر سابقًا، ارتبطت هذه الزيادة في الشدة بالتشابك بين الكيتوزان وثلاثي فوسفات الصوديوم والأنسولين. وأظهرت دراسة التفاعل بين الكيتوزان والأنسولين أنه في أطياف FTIR للجسيمات النانوية المحملة بالأنسولين، تداخلت حزمة الكيتوزان مع حزمة الأنسولين، مما زاد من شدة حزمة الكربونيل (1641 سم⁻¹) وحزمة الأمين (1543 سم⁻¹). وترتبط مجموعات ثلاثي فوسفات الصوديوم في ثلاثي فوسفات الصوديوم بـ مجموعات الأمونيوم في الكيتوزان، تشكل حزمة عند 1412 سم-1.
أطياف FTIR-ATR للأنسولين الحر، والكيتوزان، والمخاليط الفيزيائية من الكيتوزان/TPP/الأنسولين والجسيمات النانوية المجففة بطرق مختلفة.
علاوة على ذلك، تتوافق هذه النتائج مع نتائج المجهر الإلكتروني الماسح، والتي أظهرت أن الجسيمات النانوية المغلفة ظلت سليمة عند رشها وتجفيفها بالتجميد مع المانيتول، ولكن في غياب المانيتول، لم ينتج عن التجفيف بالرش سوى جسيمات مغلفة. في المقابل، كانت نتائج طيف الأشعة تحت الحمراء بتحويل فورييه (FTIR-ATR) للجسيمات النانوية المجففة بالتجميد بدون مانيتول مشابهة جدًا للمزيج الفيزيائي من الكيتوزان، وثلاثي فوسفات الصوديوم، والأنسولين. تشير هذه النتيجة إلى أن الروابط المتشابكة بين الكيتوزان، وثلاثي فوسفات الصوديوم، والأنسولين لم تعد موجودة في الجسيمات النانوية المجففة بالتجميد بدون مانيتول. لقد تضررت بنية الجسيمات النانوية أثناء التجفيف بالتجميد بدون عامل حماية من التجمد، وهو ما يمكن ملاحظته في نتائج المجهر الإلكتروني الماسح (الشكل 2أ). بناءً على مورفولوجيا ونتائج طيف الأشعة تحت الحمراء بتحويل فورييه لجسيمات الأنسولين النانوية المجففة، تم استخدام الجسيمات النانوية المجففة بالتجميد، والمجففة بالرش، والخالية من المانيتول فقط لتجارب إعادة التركيب، ونظرًا لتحلل الجسيمات النانوية الخالية من المانيتول الجسيمات النانوية الخالية من المانيتول أثناء الجفاف. ناقش.
يُستخدم التجفيف للتخزين طويل الأمد وإعادة المعالجة في تركيبات أخرى. تُعدّ قدرة الجسيمات النانوية الجافة على إعادة التكوين بعد التخزين أمرًا بالغ الأهمية لاستخدامها في تركيبات مختلفة مثل الأقراص والأغشية. لاحظنا أن متوسط ​​حجم جسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالرش في غياب المانيتول لم يزد إلا قليلاً بعد إعادة التكوين. من ناحية أخرى، ازداد حجم جسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالرش والمجففة بالتجميد مع المانيتول بشكل ملحوظ (الجدول 1). لم يتغير مؤشر تشتت الجسيمات (PDI) وكفاءة التغليف (EE) بشكل ملحوظ (p > 0.05) بعد إعادة تجميع جميع الجسيمات النانوية في هذه الدراسة (الجدول 1). تشير هذه النتيجة إلى أن معظم الجسيمات ظلت سليمة بعد إعادة الذوبان. مع ذلك، أدت إضافة المانيتول إلى انخفاض كبير في تحميل الأنسولين في الجسيمات النانوية المجففة بالتجميد والمجففة بالرش مع المانيتول (الجدول 1). في المقابل، ظل محتوى تحميل الأنسولين في الجسيمات النانوية المجففة بالرش بدون مانيتول كما هو قبل (الجدول 1).
من المعروف أن تحميل الجسيمات النانوية أمر بالغ الأهمية عند استخدامها لأغراض توصيل الأدوية. ففي حالة الجسيمات النانوية ذات التحميل المنخفض، يلزم استخدام كميات كبيرة جدًا من المادة للوصول إلى العتبة العلاجية. ومع ذلك، فإن اللزوجة العالية لهذه التركيزات العالية من الجسيمات النانوية تؤدي إلى صعوبة في الإعطاء عن طريق الفم وفي تركيبات الحقن، على التوالي²². إضافةً إلى ذلك، يمكن استخدام جسيمات الأنسولين النانوية لصنع الأقراص والأغشية الحيوية اللزجة^{23، 24}، الأمر الذي يتطلب استخدام كميات كبيرة من الجسيمات النانوية بمستويات تحميل منخفضة، مما ينتج عنه أقراص كبيرة وأغشية حيوية سميكة غير مناسبة للاستخدام عن طريق الفم. لذلك، تُعد الجسيمات النانوية المجففة ذات التحميل العالي من الأنسولين مرغوبة للغاية. تشير نتائجنا إلى أن التحميل العالي من الأنسولين في الجسيمات النانوية المجففة بالرش الخالية من المانيتول يمكن أن يوفر العديد من المزايا الجذابة لهذه الطرق البديلة لتوصيل الأدوية.
حُفظت جميع الجسيمات النانوية المجففة في الثلاجة لمدة ثلاثة أشهر. وأظهرت نتائج المجهر الإلكتروني الماسح أن مورفولوجيا جميع الجسيمات النانوية المجففة لم تتغير بشكل ملحوظ خلال فترة التخزين (الشكل 4). بعد إعادة تكوينها في الماء، أظهرت جميع الجسيمات النانوية انخفاضًا طفيفًا في كفاءة التغليف، وأطلقت كمية صغيرة (حوالي 5%) من الأنسولين خلال فترة التخزين (الجدول 2). ومع ذلك، ازداد متوسط ​​حجم الجسيمات لجميع الجسيمات النانوية. فقد ازداد حجم الجسيمات النانوية المجففة بالرش بدون مانيتول إلى 525 نانومتر، بينما ازداد حجم الجسيمات النانوية المجففة بالرش والمجففة بالتجميد مع المانيتول إلى 872 و921 نانومتر على التوالي (الجدول 2).
مورفولوجيا جسيمات الأنسولين النانوية المجففة المختلفة المخزنة لمدة ثلاثة أشهر: (أ) صورة مجهرية إلكترونية ماسحة لجسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالتجميد مع المانيتول؛ (ب) صورة مجهرية إلكترونية ماسحة لجسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالرش بدون مانيتول؛ (ج) صور مجهرية إلكترونية ماسحة لجسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالرش بدون مانيتول.
علاوة على ذلك، لوحظ وجود رواسب في جزيئات الأنسولين النانوية المُعاد تكوينها والمجففة بالرش باستخدام المانيتول والمجففة بالتجميد (الشكل S2). قد يكون سبب ذلك عدم تعليق الجزيئات الكبيرة بشكل كافٍ في الماء. تُظهر جميع النتائج المذكورة أعلاه أن تقنية التجفيف بالرش قادرة على حماية جزيئات الأنسولين النانوية من الجفاف، وأنه يمكن الحصول على كميات كبيرة من جزيئات الأنسولين النانوية دون الحاجة إلى أي مواد مالئة أو مواد حافظة من التجميد.
تم اختبار احتفاظ الجسيمات النانوية بالأنسولين في وسط ذي درجة حموضة 2.5 باستخدام البيبسين والتربسين والكيموتريبسين ألفا لإثبات قدرتها على حماية هذه الجسيمات من الهضم الأنزيمي بعد التجفيف. وقورنت نسبة احتفاظ الجسيمات النانوية المجففة بالأنسولين مع تلك المحضرة حديثًا، واستُخدم الأنسولين الحر كعينة ضابطة سالبة. في هذه الدراسة، أظهر الأنسولين الحر إزالة سريعة للأنسولين خلال 4 ساعات في جميع المعالجات الأنزيمية الثلاث (الشكل 5أ-ج). في المقابل، أظهر اختبار إزالة الأنسولين من الجسيمات النانوية المجففة بالتجميد مع المانيتول والجسيمات النانوية المجففة بالرش مع أو بدون المانيتول حماية أعلى بكثير لهذه الجسيمات النانوية ضد الهضم الأنزيمي، وهو ما يماثل حماية جسيمات الأنسولين النانوية المحضرة حديثًا (الشكل 1). وبمساعدة الجسيمات النانوية في البيبسين والتربسين والكيموتريبسين ألفا، أمكن حماية أكثر من 50% و60% و75% من الأنسولين خلال 4 ساعات، على التوالي. (الشكل 5أ-ج). قد تزيد هذه القدرة على حماية الأنسولين من فرصة امتصاص الأنسولين بشكل أكبر في مجرى الدم25. تشير هذه النتائج إلى أن التجفيف بالرش مع أو بدون مانيتول والتجفيف بالتجميد مع مانيتول يمكن أن يحافظ على قدرة الجسيمات النانوية على حماية الأنسولين بعد التجفيف.
سلوك الحماية والإطلاق لجزيئات الأنسولين النانوية المجففة: (أ) حماية الأنسولين في محلول البيبسين؛ (ب) حماية الأنسولين في محلول التربسين؛ (ج) حماية الأنسولين بواسطة محلول ألفا-كيموتريبسين؛ (د) سلوك إطلاق الجزيئات النانوية المجففة في محلول ذي درجة حموضة 2.5؛ (هـ) سلوك إطلاق الجزيئات النانوية المجففة في محلول ذي درجة حموضة 6.6؛ (و) سلوك إطلاق الجزيئات النانوية المجففة في محلول ذي درجة حموضة 7.0.
تم تحضير وإعادة تكوين جزيئات الأنسولين النانوية الجافة حديثًا في محاليل منظمة مختلفة (الأس الهيدروجيني = 2.5، 6.6، 7.0) عند 37 درجة مئوية، لمحاكاة بيئة الأس الهيدروجيني للمعدة والاثني عشر والجزء العلوي من الأمعاء الدقيقة، وذلك لدراسة تأثير الأنسولين على مقاومة الأنسولين. سلوك الإطلاق في بيئات مختلفة. جزء من الجهاز الهضمي. عند درجة حموضة 2.5، أظهرت الجسيمات النانوية المحملة بالأنسولين والجسيمات النانوية الجافة المعاد إذابتها إطلاقًا أوليًا سريعًا خلال الساعة الأولى، يليه إطلاق بطيء على مدى الساعات الخمس التالية (الشكل 5د). يُعزى هذا الإطلاق السريع في البداية على الأرجح إلى التحرر السطحي السريع لجزيئات البروتين غير المثبتة بالكامل في البنية الداخلية للجسيم. عند درجة حموضة 6.5، أظهرت الجسيمات النانوية المحملة بالأنسولين والجسيمات النانوية الجافة المعاد تكوينها إطلاقًا سلسًا وبطيئًا على مدى 6 ساعات، نظرًا لتشابه درجة حموضة محلول الاختبار مع درجة حموضة محلول تحضير الجسيمات النانوية (الشكل 5هـ). عند درجة حموضة 7، كانت الجسيمات النانوية غير مستقرة وتحللت بالكامل تقريبًا خلال الساعتين الأوليين (الشكل 5و). ويعود ذلك إلى حدوث نزع بروتون من الكيتوزان عند درجة حموضة أعلى، مما ينتج عنه شبكة بوليمرية أقل كثافة وإطلاق أقل للأنسولين المحمل.
علاوة على ذلك، أظهرت جسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالرش دون استخدام المانيتول معدل إطلاق أسرع من الجسيمات النانوية المجففة الأخرى (الشكل 5د-و). وكما ذُكر سابقًا، فإن جسيمات الأنسولين النانوية المُعاد تكوينها والمجففة دون استخدام المانيتول تتميز بأصغر حجم للجسيمات. توفر الجسيمات الصغيرة مساحة سطح أكبر، لذا فإن معظم الدواء سيكون على سطح الجسيم أو بالقرب منه، مما يؤدي إلى إطلاق سريع للدواء.
تم التحقق من سمية الجسيمات النانوية بواسطة اختبار MTT. وكما هو موضح في الشكل S4، لم يكن للجسيمات النانوية المجففة أي تأثير كبير على حيوية الخلايا عند تركيزات تتراوح بين 50 و500 ميكروغرام/مل، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام جميع الجسيمات النانوية المجففة بأمان للوصول إلى النطاق العلاجي.
يُعد الكبد العضو الرئيسي الذي يُمارس من خلاله الأنسولين وظائفه الفيزيولوجية. خلايا HepG2 هي سلالة خلايا ورم كبدي بشري تُستخدم عادةً كنموذج لامتصاص الخلايا الكبدية في المختبر. في هذه الدراسة، استُخدمت خلايا HepG2 لتقييم امتصاص الخلايا للجسيمات النانوية المُجففة باستخدام طريقتي التجفيف بالتجميد والتجفيف بالرش. تم قياس امتصاص الخلايا باستخدام المجهر متحد البؤر الماسح بتقنية قياس التدفق الخلوي والرؤية بعد عدة ساعات من الحضانة مع أنسولين FITC الحر بتركيز 25 ميكروغرام/مل، وجسيمات نانوية مُحملة بأنسولين FITC مُحضرة حديثًا، وجسيمات نانوية مُحملة بأنسولين FITC مُجففة بتركيزات أنسولين متساوية. أُجريت ملاحظات مجهرية كمية (CLSM). تَلِفت الجسيمات النانوية المُجففة بالتجميد بدون مانيتول أثناء التجفيف، ولم تُقيّم في هذه التجربة. تم قياس شدة التألق داخل الخلايا للجسيمات النانوية المُحملة بالأنسولين المُحضرة حديثًا، والجسيمات النانوية المُجففة بالتجميد مع مانيتول، والجسيمات النانوية المُجففة بالرش. كانت قيم الأنسولين مع المانيتول وبدونه (الشكل 6أ) أعلى بمقدار 4.3 و2.6 و2.4 و4.1 مرة على التوالي من قيم الأنسولين الحر. أما قيم الأنسولين المُغلف (الشكل 6ب) فكانت أعلى بمقدار 4.3 و2.6 و2.4 و4.1 مرة على التوالي من قيم الأنسولين الحر. تشير هذه النتائج إلى أن الأنسولين المُغلف أكثر فعالية في الامتصاص الخلوي من الأنسولين الحر، ويعود ذلك أساسًا إلى صغر حجم الجسيمات النانوية المحملة بالأنسولين التي تم إنتاجها في هذه الدراسة.
امتصاص خلايا HepG2 بعد 4 ساعات من الحضانة مع الجسيمات النانوية المحضرة حديثًا والجسيمات النانوية المجففة: (أ) توزيع امتصاص الأنسولين FITC بواسطة خلايا HepG2. (ب) المتوسط ​​الهندسي لشدة الفلورة التي تم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي (ن = 3)، *P < 0.05 مقارنة بالأنسولين الحر.
وبالمثل، أظهرت صور المجهر الليزري الماسح متحد البؤر (CLSM) أن شدة تألق FITC في الجسيمات النانوية المحملة بالأنسولين المحضرة حديثًا والمحملة بالأنسولين المجففة بالرش (بدون مانيتول) كانت أقوى بكثير من تلك الموجودة في العينات الأخرى (الشكل 6أ). علاوة على ذلك، مع إضافة المانيتول، زادت لزوجة المحلول، مما زاد من مقاومة الامتصاص الخلوي، وأدى إلى انخفاض تكاثر الأنسولين. تشير هذه النتائج إلى أن الجسيمات النانوية المجففة بالرش الخالية من المانيتول أظهرت أعلى كفاءة امتصاص خلوي لأن حجم جسيماتها كان أصغر من حجم الجسيمات النانوية المجففة بالتجميد بعد إعادة إذابتها.
تم شراء الكيتوزان (بمتوسط ​​وزن جزيئي 100 كيلو دالتون، منزوع الأسيتيل بنسبة 75-85%) من شركة سيجما-ألدريتش (أوكفيل، أونتاريو، كندا). وتم شراء ثلاثي فوسفات الصوديوم (TPP) من شركة VWR (رادنور، بنسلفانيا، الولايات المتحدة الأمريكية). أما الأنسولين البشري المؤتلف المستخدم في هذه الدراسة فقد تم الحصول عليه من شركة فيشر ساينتيفيك (والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية). كما تم شراء الأنسولين البشري الموسوم بـ FITC و 4'،6-ثنائي أميدينو-2-فينيل إندول ثنائي هيدروكلوريد (DAPI) من شركة سيجما-ألدريتش (أوكفيل، أونتاريو، كندا). وتم الحصول على سلالة خلايا HepG2 من ATCC (ماناساس، فيرجينيا، الولايات المتحدة الأمريكية). جميع الكواشف الأخرى كانت من الدرجة التحليلية أو الكروماتوغرافية.
حضّر محلول CS بتركيز 1 ملغم/مل بإذابته في ماء مقطر مرتين يحتوي على 0.1% حمض أسيتيك. حضّر محاليل TPP والأنسولين بتركيز 1 ملغم/مل بإذابتهما في ماء مقطر مرتين وحمض أسيتيك بنسبة 0.1% على التوالي. تم تحضير المستحلب الأولي باستخدام جهاز التجنيس عالي السرعة Polytron PCU-2-110 (شركة برينكمان للصناعات، ويستبري، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). عملية التحضير كالتالي: أولاً، يُضاف 2 مل من محلول TPP إلى 4 مل من محلول الأنسولين، ويُحرّك المزيج لمدة 30 دقيقة حتى يمتزج تمامًا. ثم، يُضاف المحلول المختلط قطرة قطرة إلى محلول CS باستخدام محقنة مع التحريك بسرعة عالية (10000 دورة في الدقيقة). وُضعت المخاليط في حمام جليدي مع التحريك بسرعة عالية (15000 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة، وضُبطت درجة حموضتها للحصول على جسيمات نانوية متشابكة من الأنسولين. لمزيد من التحليل، لتجانس وتقليل حجم جسيمات الأنسولين النانوية، تم معالجتها بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة إضافية في حمام جليدي باستخدام جهاز سونيكاتور من نوع المسبار (UP 200ST، Hielscher Ultrasonics، Teltow، ألمانيا).
تم اختبار جسيمات الأنسولين النانوية من حيث متوسط ​​القطر (Z-average) ومؤشر التشتت (PDI) وجهد زيتا باستخدام قياسات تشتت الضوء الديناميكي (DLS) بواسطة جهاز Litesizer 500 (Anton Paar، غراتس، النمسا) عن طريق تخفيفها في ماء منزوع الأيونات عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. تم توصيف الشكل وتوزيع الحجم بواسطة مجهر إلكتروني نافذ (TEM) من نوع Hitachi H7600 (Hitachi، طوكيو، اليابان)، ثم تم تحليل الصور باستخدام برنامج تصوير من Hitachi (Hitachi، طوكيو، اليابان). لتقييم كفاءة التغليف (EE) وقدرة التحميل (LC) لجسيمات الأنسولين النانوية، تم سحب الجسيمات النانوية باستخدام ماصة ووضعها في أنابيب ترشيح فائق بوزن جزيئي مقطوع يبلغ 100 كيلو دالتون، ثم تم طردها مركزيًا عند 500 × جم لمدة 30 دقيقة. تم تحديد كمية الأنسولين غير المغلف في الرشاحة باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء من سلسلة Agilent 1100 (Agilent، سانتا كلارا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) يتكون من مضخة رباعية، وجهاز أخذ عينات تلقائي، وسخان عمود، وكاشف ثنائي المصفوفة الضوئية (DAD). تم تحليل الأنسولين باستخدام عمود C18 (Zorbax، 3.5 ميكرومتر، 4.6 مم × 150 مم، Agilent، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم الكشف عنه عند 214 نانومتر. كان الطور المتحرك عبارة عن أسيتونيتريل وماء، يحتوي على 0.1% من حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك (TFA)، بنسب تدرج من 10/90 إلى 100/0، وتم تشغيله لمدة 10 دقائق. تم ضخ الطور المتحرك بمعدل تدفق 1.0 مل/دقيقة. تم ضبط درجة حرارة العمود على 20 درجة مئوية. احسب النسب المئوية لكل من كفاءة التغليف (EE) وطول السلسلة (LC) باستخدام المعادلتين (1) و(2).
تم اختبار نسب مختلفة من CS/الأنسولين تتراوح بين 2.0 و4.0 لتحسين جسيمات الأنسولين النانوية. أُضيفت كميات مختلفة من محلول CS أثناء التحضير، مع الحفاظ على نسبة الأنسولين/TPP ثابتة. حُضِّرت جسيمات الأنسولين النانوية في نطاق الأس الهيدروجيني من 4.0 إلى 6.5 من خلال التحكم الدقيق في درجة حموضة الخليط بعد إضافة جميع المحاليل (الأنسولين، وTPP، وCS). قُيِّمت كفاءة التغليف وحجم جسيمات الأنسولين النانوية عند قيم أس هيدروجيني ونسب كتلية مختلفة من CS/الأنسولين لتحسين تكوين جسيمات الأنسولين النانوية.
وُضعت جزيئات الأنسولين النانوية المُحسّنة على حاوية ألومنيوم وغُطيت بورق مناديل مُحكم الإغلاق بشريط لاصق. بعد ذلك، وُضعت الحاويات المُحكمة الإغلاق في مُجفف تجميد من نوع Labconco FreeZone (شركة Labconco، مدينة كانساس سيتي، ولاية ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية) مُجهز بمُجفف صواني. ضُبطت درجة الحرارة وضغط الفراغ على -10 درجة مئوية و0.350 تور لأول ساعتين، ثم على 0 درجة مئوية و0.120 تور للساعات الـ 22 المتبقية من فترة الـ 24 ساعة للحصول على جزيئات أنسولين نانوية جافة.
تم استخدام مجفف الرذاذ الصغير Buchi B-290 (BÜCHI، فلاويل، سويسرا) لإنتاج الأنسولين المغلف. وكانت معايير التجفيف المختارة هي: درجة الحرارة 100 درجة مئوية، ومعدل تدفق التغذية 3 لتر/دقيقة، ومعدل تدفق الغاز 4 لتر/دقيقة.
تم توصيف جسيمات الأنسولين النانوية قبل وبعد التجفيف باستخدام مطيافية FTIR-ATR. وتم تحليل الجسيمات النانوية المجففة، بالإضافة إلى الأنسولين الحر والكيتوزان، باستخدام مطياف Spectrum 100 FTIR (بيركن إلمر، والتهام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) المزود بملحق أخذ عينات ATR عالمي (بيركن إلمر، والتهام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية). وتم الحصول على متوسطات الإشارة من 16 مسحًا بدقة 4 سم⁻² في نطاق التردد 4000-600 سم⁻².
تم تقييم مورفولوجيا جسيمات الأنسولين النانوية الجافة باستخدام صور المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لجسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالتجميد والمجففة بالرش، والتي تم التقاطها بواسطة مجهر إلكتروني ماسح ذي حزمة أيونية مركزة (FIB-SEM) من نوع Helios NanoLab 650 (FEI، هيلزبورو، أوريغون، الولايات المتحدة الأمريكية). وكانت المعلمة الرئيسية المستخدمة هي الجهد 5 كيلو فولت والتيار 30 مللي أمبير.
أُعيد إذابة جميع جزيئات الأنسولين النانوية المجففة في الماء المقطر. أُعيد اختبار حجم الجسيمات، ومؤشر التشتت (PDI)، وكفاءة التغليف (EE)، وسعة التخزين (LC) باستخدام الطريقة نفسها المذكورة سابقًا لتقييم جودتها بعد التجفيف. كما قُيسَ استقرار جزيئات الأنسولين النانوية اللامائية باختبار خصائصها بعد تخزينها لفترة طويلة. في هذه الدراسة، خُزِّنت جميع الجزيئات النانوية بعد تجفيفها في الثلاجة لمدة ثلاثة أشهر. بعد ثلاثة أشهر من التخزين، خضعت الجزيئات النانوية لاختبارات مورفولوجية شملت حجم الجسيمات، ومؤشر التشتت (PDI)، وكفاءة التغليف (EE)، وسعة التخزين (LC).
قم بإذابة 5 مل من الجسيمات النانوية المُعاد تكوينها في 45 مل من سائل معدي مُحاكى (درجة حموضة 1.2، يحتوي على 1% بيبسين)، أو سائل معوي (درجة حموضة 6.8، يحتوي على 1% تريبسين)، أو محلول كيموتريبسين (100 ميكروغرام/مل، في محلول منظم فوسفات، درجة حموضة 7.8) لتقييم فعالية الأنسولين في حماية الجسيمات النانوية بعد التجفيف. تم تحضين العينات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع سرعة تحريك 100 دورة في الدقيقة. تم جمع 500 ميكرولتر من المحلول في نقاط زمنية مختلفة، وتم تحديد تركيز الأنسولين باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC).
تم اختبار سلوك إطلاق الأنسولين في المختبر لجزيئات نانوية مُحضّرة حديثًا ومُجففة من الأنسولين باستخدام طريقة كيس الغسيل الكلوي (بوزن جزيئي مقطوع 100 كيلو دالتون، شركة سبيكترا بور). خضعت الجزيئات النانوية المُحضّرة حديثًا والمُجففة لعملية غسيل كلوي في سوائل عند درجة حموضة 2.5، و6.6، و7.0 (محلول ملحي مُخفّف بالفوسفات 0.1 مولار، PBS) لمحاكاة بيئة الحموضة في المعدة، والاثني عشر، والجزء العلوي من الأمعاء الدقيقة، على التوالي. حُضنت جميع العينات عند 37 درجة مئوية مع رجّ مستمر بسرعة 200 دورة في الدقيقة. سُحب السائل من خارج كيس الغسيل الكلوي سعة 5 مل في الأوقات التالية: 0.5، 1، 2، 3، 4، و6 ساعات، وأُعيد ملء الحجم فورًا بمحلول غسيل كلوي جديد. حُلل تلوث الأنسولين في السائل باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)، وحُسب معدل إطلاق الأنسولين من الجزيئات النانوية من... نسبة الأنسولين الحر المنطلق إلى إجمالي الأنسولين المغلف في الجسيمات النانوية (المعادلة 3).
تمت زراعة خلايا خط خلايا سرطان الكبد البشري HepG2 في أطباق قطرها 60 مم باستخدام وسط دولبيكو المعدل (DMEM) المحتوي على 10% من مصل الأبقار الجنيني، و100 وحدة دولية/مل من البنسلين، و100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين. حُفظت المزارع عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ورطوبة نسبية 95%، وتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون. في تجارب الامتصاص، زُرعت خلايا HepG2 بكثافة 1 × 10⁵ خلية/مل على شريحة نظام غرف Nunc Lab-Tek ذات 8 آبار (Thermo Fisher، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). أما في تجارب السمية الخلوية، فزُرعت في صفائح ذات 96 بئراً (Corning، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية) بكثافة 5 × 10⁴ خلية/مل.
استُخدم اختبار MTT لتقييم السمية الخلوية لجزيئات الأنسولين النانوية المُحضّرة حديثًا والمُجفّفة. زُرعت خلايا HepG2 في صفائح ذات 96 بئرًا بكثافة 5 × 10⁴ خلية/مل، وحُضنت لمدة 7 أيام قبل الاختبار. خُففت جزيئات الأنسولين النانوية إلى تراكيز مختلفة (من 50 إلى 500 ميكروغرام/مل) في وسط الاستنبات، ثم أُضيفت إلى الخلايا. بعد 24 ساعة من التحضين، غُسلت الخلايا 3 مرات بمحلول الفوسفات الملحي (PBS)، ثم حُضنت في وسط يحتوي على 0.5 ملغ/مل من MTT لمدة 4 ساعات إضافية. قُيّمت السمية الخلوية بقياس الاختزال الإنزيمي لصبغة التترازوليوم الصفراء MTT إلى فورمازان بنفسجي عند 570 نانومتر باستخدام جهاز قياس الطيف الضوئي Tecan infinite M200 pro (Tecan، مانيدورف، سويسرا).
تم اختبار كفاءة امتصاص الخلايا للجسيمات النانوية باستخدام المجهر الماسح الليزري متحد البؤر وتحليل التدفق الخلوي. عولجت كل بئر من نظام شريحة حجرة Nunc Lab-Tek بالأنسولين الحر المفلور (FITC-insulin)، والجسيمات النانوية المحملة بالأنسولين المفلور (FITC-insulin)، ومحلول مُعاد تكوينه بتركيز 25 ميكروغرام/مل من الجسيمات النانوية المجففة المحملة بالأنسولين المفلور (FITC-insulin) بنفس التركيز، ثم حُضنت لمدة 4 ساعات. غُسلت الخلايا 3 مرات بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) وثُبتت بمحلول بارافورمالدهيد 4%. صُبغت النوى بصبغة 4'،6-ثنائي أميدينو-2-فينيل إندول (DAPI). لُوحظ توضع الأنسولين باستخدام مجهر Olympus FV1000 الماسح الليزري/مجهر متحد البؤر ثنائي الفوتون (Olympus، مدينة شينجوكو، طوكيو، اليابان). ولتحليل التدفق الخلوي، استُخدمت نفس تراكيز 10 ميكروغرام/مل من الأنسولين الحر المفلور (FITC-insulin). تمت إضافة جسيمات نانوية محملة بالأنسولين FITC، وجسيمات نانوية مجففة معاد إذابتها محملة بالأنسولين FITC إلى صفائح ذات 96 بئراً مزروعة بخلايا HepG2 وحُضنت لمدة 4 ساعات. بعد 4 ساعات من التحضين، أُزيلت الخلايا وغُسلت 3 مرات بمصل بقري جنيني. تم تحليل 5 × 104 خلية لكل عينة بواسطة جهاز قياس التدفق الخلوي BD LSR II (BD، فرانكلين ليكس، نيو جيرسي، الولايات المتحدة).
جميع القيم معبر عنها كمتوسط ​​± انحراف معياري. تم تقييم المقارنات بين جميع المجموعات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه أو اختبار t بواسطة برنامج IBM SPSS Statistics 26 لنظام التشغيل Mac (IBM، إنديكوت، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية) واعتُبرت قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
تُظهر هذه الدراسة مرونة وقدرة التجفيف بالرش على تجفيف جسيمات نانوية من الكيتوزان/TPP/الأنسولين المتشابكة، مع تحسين إعادة تكوينها مقارنةً بطرق التجفيف بالتجميد التقليدية باستخدام عوامل التكتل أو المواد الواقية من التجمد، بالإضافة إلى قدرتها العالية على التحميل. وقد حققت جسيمات الأنسولين النانوية المُحسّنة متوسط ​​حجم جسيمات يبلغ 318 نانومتر وكفاءة تغليف تصل إلى 99.4%. وأظهرت نتائج المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) ومطيافية الأشعة تحت الحمراء بتحويل فورييه (FTIR) بعد التجفيف أن البنية الكروية احتُفظ بها فقط في الجسيمات النانوية المجففة بالرش مع وبدون مانيتول، وكذلك في الجسيمات المجففة بالتجميد مع المانيتول، بينما تحللت الجسيمات النانوية المجففة بالتجميد بدون مانيتول أثناء التجفيف. وفي اختبار قدرة إعادة التكوين، أظهرت جسيمات الأنسولين النانوية المجففة بالرش بدون مانيتول أصغر متوسط ​​حجم جسيمات وأعلى تحميل عند إعادة التكوين. وأظهرت سلوكيات إطلاق جميع هذه الجسيمات النانوية المجففة أنها تُطلق بسرعة في محاليل ذات أس هيدروجيني 2.5 و7، وأنها مستقرة للغاية. في محلول ذي درجة حموضة 6.5. بالمقارنة مع الجسيمات النانوية المجففة الأخرى المعاد إذابتها، أظهرت الجسيمات النانوية المجففة بالرش بدون مانيتول أسرع إطلاق. تتوافق هذه النتيجة مع ما لوحظ في اختبار الامتصاص الخلوي، حيث حافظت الجسيمات النانوية المجففة بالرش في غياب المانيتول بشكل شبه كامل على كفاءة الامتصاص الخلوي للجسيمات النانوية المحضرة حديثًا. تشير هذه النتائج إلى أن جسيمات الأنسولين النانوية الجافة المحضرة بالتجفيف بالرش الخالي من المانيتول هي الأنسب لمزيد من المعالجة إلى أشكال جرعات لا مائية أخرى، مثل الأقراص الفموية أو الأغشية اللاصقة الحيوية.
بسبب قضايا الملكية الفكرية، فإن مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها و/أو تحليلها خلال الدراسة الحالية غير متاحة للجمهور، ولكنها متاحة من المؤلفين المعنيين عند تقديم طلب معقول.
كاجان، أ. داء السكري من النوع الثاني: الأصول الاجتماعية والعلمية، والمضاعفات الطبية، والآثار المترتبة على المرضى وغيرهم. (ماكفارلين، 2009).
سينغ، أ.ب، غو، ي.، سينغ، أ.، شي، و. وجيانغ، ب. تطوير تغليف الأنسولين: هل أصبح تناوله عن طريق الفم ممكنًا الآن؟ مجلة الصيدلة. الصيدلة الحيوية. الخزان.1، ​​74-92 (2019).
وونغ، سي واي، السلامي، إتش. وداس، سي آر. التطورات الحديثة في أنظمة توصيل الليبوسومات المحملة بالأنسولين عن طريق الفم لعلاج مرض السكري. التفسير. مجلة الصيدلة. 549، 201-217 (2018).