هذا المقال جزء من موضوع البحث "تحسين مقاومة البقوليات لمسببات الأمراض والآفات"، اطلع على جميع المقالات الخمسة
يستخدم الفطر المسبب لمرض نخر النبات الفطري، Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary، استراتيجية متعددة المستويات لإصابة نباتات مضيفة مختلفة. تقترح هذه الدراسة استخدام ثنائي الأمين L-ornithine، وهو حمض أميني غير بروتيني يحفز تخليق الأحماض الأمينية الأساسية الأخرى، كاستراتيجية إدارة بديلة لتعزيز الاستجابات الجزيئية والفسيولوجية والكيميائية الحيوية لنبات Phaseolus vulgaris L. للعفن الأبيض الناتج عن بكتيريا Pseudomonas sclerotiorum. أظهرت التجارب المخبرية أن L-ornithine يثبط بشكل ملحوظ نمو الفطريات S. pyrenoidosa بطريقة تعتمد على الجرعة. علاوة على ذلك، يمكنه تقليل شدة العفن الأبيض بشكل ملحوظ في ظروف البيوت الزجاجية. كما حفز L-ornithine نمو النباتات المعالجة، مما يشير إلى أن التركيزات المختبرة من L-ornithine لم تكن سامة للنباتات المعالجة. بالإضافة إلى ذلك، عزز مركب L-ornithine التعبير عن مضادات الأكسدة غير الإنزيمية (المركبات الفينولية والفلافونويدات الذائبة الكلية) ومضادات الأكسدة الإنزيمية (الكاتالاز (CAT) والبيروكسيداز (POX) وأكسيداز البوليفينول (PPO))، وزاد من التعبير عن ثلاثة جينات مرتبطة بمضادات الأكسدة (PvCAT1 وPvSOD وPvGR). علاوة على ذلك، كشف التحليل الحاسوبي عن وجود بروتين أسيتيل هيدرولاز أوكسالوأسيتات (SsOAH) محتمل في جينوم S. sclerotiorum، والذي كان شديد الشبه ببروتينات أسيتيل هيدرولاز أوكسالوأسيتات (SsOAH) في Aspergillus fijiensis (AfOAH) وPenicillium sp. (PlOAH) من حيث التحليل الوظيفي والمجالات المحفوظة والبنية. ومن المثير للاهتمام أن إضافة إل-أورنيثين إلى وسط مرق دكستروز البطاطس (PDB) أدت إلى انخفاض ملحوظ في التعبير الجيني لـ SsOAH في خيوط فطر S. sclerotiorum. وبالمثل، أدى التطبيق الخارجي لـ إل-أورنيثين إلى انخفاض ملحوظ في التعبير الجيني لـ SsOAH في خيوط الفطر المأخوذة من النباتات المعالجة. وأخيرًا، أدى تطبيق إل-أورنيثين إلى انخفاض ملحوظ في إفراز حمض الأكساليك في كل من وسط PDB والأوراق المصابة. في الختام، يلعب إل-أورنيثين دورًا رئيسيًا في الحفاظ على حالة الأكسدة والاختزال، فضلًا عن تعزيز استجابة الدفاع لدى النباتات المصابة. قد تُسهم نتائج هذه الدراسة في تطوير أساليب مبتكرة وصديقة للبيئة لمكافحة العفن الأبيض والتخفيف من آثاره على إنتاج الفاصوليا والمحاصيل الأخرى.
يُعدّ العفن الأبيض، الذي يُسببه الفطر النخراني Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary، مرضًا مُدمرًا يُقلل من إنتاجية الفاصوليا (Phaseolus vulgaris L.) على مستوى العالم، ويُمثل تهديدًا خطيرًا لإنتاج الفاصوليا عالميًا (Bolton et al., 2006). يُعتبر Sclerotinia sclerotiorum من أصعب مسببات الأمراض الفطرية النباتية التي تنتقل عن طريق التربة، حيث يتميز بنطاق عوائل واسع يشمل أكثر من 600 نوع نباتي، وقدرة على إتلاف أنسجة العائل بسرعة وبشكل غير مُحدد (Liang and Rollins, 2018). في ظل الظروف غير المواتية، يمر الفطر بمرحلة حرجة من دورة حياته، حيث يبقى كامنًا لفترات طويلة على شكل تراكيب سوداء صلبة تُشبه البذور تُسمى "الأجسام الصلبة" في التربة، أو على شكل نموات بيضاء زغبية في الغزل الفطري أو لب ساق النباتات المُصابة (Schwartz et al., 2005). يستطيع فطر S. sclerotiorum تكوين أجسام صلبة (sclerotia)، مما يسمح له بالبقاء في الحقول المصابة لفترات طويلة والاستمرار خلال المرض (شوارتز وآخرون، 2005). تتميز هذه الأجسام بغناها بالعناصر الغذائية، وقدرتها على البقاء في التربة لفترات طويلة، كما أنها تُعدّ اللقاح الأولي للعدوى اللاحقة (شوارتز وآخرون، 2005). في ظل الظروف الملائمة، تنبت هذه الأجسام وتنتج أبواغًا محمولة جوًا قادرة على إصابة جميع أجزاء النبات فوق سطح الأرض، بما في ذلك الأزهار والسيقان والقرون (شوارتز وآخرون، 2005).
يستخدم فطر Sclerotinia sclerotiorum استراتيجية متعددة المراحل لإصابة نباتاته المضيفة، تتضمن سلسلة من الأحداث المنسقة بدءًا من إنبات الأجسام الصلبة وحتى ظهور الأعراض. ​​في البداية، ينتج الفطر أبواغًا معلقة (تُسمى الأبواغ الزقية) من تراكيب شبيهة بالفطر تُسمى الأبواغ الثمرية، والتي تنتشر في الهواء وتتطور إلى أجسام صلبة غير متحركة على بقايا النباتات المصابة (بولتون وآخرون، 2006). بعد ذلك، يُفرز الفطر حمض الأكساليك، وهو عامل ضراوة، للتحكم في درجة حموضة جدار الخلية النباتية، وتعزيز التحلل الأنزيمي وغزو الأنسجة (هيغيدوس وريمر، 2005)، وكبح الانفجار التأكسدي للنبات المضيف. تُضعف عملية التحمض هذه جدار الخلية النباتية، مما يوفر بيئة مواتية للتشغيل الطبيعي والفعال للإنزيمات الفطرية المُحللة لجدار الخلية (CWDEs)، مما يسمح للممرض بتجاوز الحاجز المادي واختراق أنسجة المضيف (مارسيانو وآخرون، 1983). بمجرد اختراقها، تفرز فطر Sclerotinia sclerotiorum عددًا من إنزيمات تحلل جدار الخلية، مثل البولي جالاكتيوروناز والسليولاز، مما يُسهّل انتشارها في الأنسجة المصابة ويُسبب نخرها. ويؤدي تطور الآفات وتكوّن الحصائر الفطرية إلى ظهور الأعراض المميزة للعفن الأبيض (هيغيدوس وريمر، 2005). في الوقت نفسه، تتعرف النباتات المضيفة على الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) من خلال مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs)، مما يُحفز سلسلة من الإشارات التي تُفعّل في النهاية الاستجابات الدفاعية.
على الرغم من الجهود المبذولة على مدى عقود لمكافحة الأمراض، لا يزال نقص الأصول الوراثية المقاومة الكافية قائماً في الفاصوليا، كما هو الحال في المحاصيل التجارية الأخرى، وذلك بسبب مقاومة العامل الممرض وقدرته على البقاء والتكيف. ولذلك، تُعدّ إدارة المرض تحدياً بالغاً، وتتطلب استراتيجية متكاملة ومتعددة الجوانب تشمل مزيجاً من الممارسات الزراعية والمكافحة البيولوجية والمبيدات الفطرية الكيميائية (أوسوليفان وآخرون، 2021). تُعدّ المكافحة الكيميائية للعفن الأبيض الأكثر فعالية، لأن المبيدات الفطرية، عند استخدامها بشكل صحيح وفي الوقت المناسب، قادرة على السيطرة الفعالة على انتشار المرض، والحد من شدة الإصابة، وتقليل خسائر المحصول. مع ذلك، فإن الإفراط في استخدام المبيدات الفطرية والاعتماد المفرط عليها قد يؤدي إلى ظهور سلالات مقاومة من فطر Sclerotinia sclerotiorum، ويؤثر سلباً على الكائنات غير المستهدفة، وصحة التربة، وجودة المياه (لو كوينت وآخرون، 2016؛ سيريسيني وآخرون، 2024). لذا، أصبح إيجاد بدائل صديقة للبيئة أولوية قصوى.
تُعدّ البوليامينات، مثل البوترسين والسبيرميدين والسبيرمين والكادافيرين، بدائل واعدة لمكافحة مسببات الأمراض النباتية المنقولة بالتربة، مما يُقلل كليًا أو جزئيًا من استخدام المبيدات الفطرية الكيميائية الخطرة (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). في النباتات الراقية، تُشارك البوليامينات في العديد من العمليات الفيزيولوجية، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، انقسام الخلايا وتمايزها والاستجابة للضغوط اللاأحيائية والأحيائية (Killiny and Nehela, 2020). يمكن أن تعمل هذه المركبات كمضادات للأكسدة، وتساعد في التخلص من أنواع الأكسجين التفاعلية، والحفاظ على التوازن التأكسدي والاختزالي (نيهيلا وكيليني، 2023)، وتحفيز الجينات المرتبطة بالدفاع (روميرو وآخرون، 2018)، وتنظيم مسارات أيضية متنوعة (نيهيلا وكيليني، 2023)، وتعديل الهرمونات النباتية الداخلية (نيهيلا وكيليني، 2019)، وتأسيس مقاومة مكتسبة جهازية، وتنظيم التفاعلات بين النباتات ومسببات الأمراض (نيهيلا وكيليني، 2020؛ أسيا وآخرون، 2022؛ تشيرفونيك، 2022). ومن الجدير بالذكر أن الآليات والأدوار المحددة للأحماض الأمينية في دفاع النبات تختلف باختلاف أنواع النباتات ومسببات الأمراض والظروف البيئية. ويُعدّ حمض البولي أمين الأكثر وفرة في النباتات هو حمض البولي أمين المُصنّع حيويًا من البولي أمين الأساسي إل-أورنيثين (كيليني ونيهيلا، 2020).
يؤدي الأورنيثين أدوارًا متعددة في نمو النبات وتطوره. فعلى سبيل المثال، أظهرت دراسات سابقة أن الأورنيثين في الأرز (Oryza sativa) قد يرتبط بإعادة تدوير النيتروجين (Liu et al., 2018)، وإنتاجية الأرز وجودته ورائحته (Lu et al., 2020)، والاستجابة للإجهاد المائي (Yang et al., 2000). علاوة على ذلك، أدى التطبيق الخارجي للأورنيثين إلى تحسين تحمل الجفاف بشكل ملحوظ في بنجر السكر (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019)، وتخفيف الإجهاد الملحي في البصل (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021) والكاجو (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). وقد يُعزى الدور المحتمل للأورنيثين في مقاومة الإجهاد اللاأحيائي إلى دوره في تراكم البرولين في النباتات المعالجة. على سبيل المثال، أشارت دراسات سابقة إلى أن الجينات المرتبطة باستقلاب البرولين، مثل جينات ناقلة أمين دلتا الأورنيثين (دلتا-OAT) وجينات نازعة هيدروجين البرولين (ProDH1 وProDH2)، تلعب دورًا في دفاع نباتات التبغ (Nicotiana benthamiana) ونباتات الرشاد (Arabidopsis thaliana) ضد سلالات بكتيريا الزائفة السيرينجية غير المضيفة (Senthil-Kumar وMysore، 2012). من جهة أخرى، يُعد إنزيم نازعة كربوكسيل الأورنيثين الفطري (ODC) ضروريًا لنمو مسببات الأمراض (Singh et al.، 2020). وقد أدى استهداف إنزيم ODC في فطر Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici عبر إسكات الجينات المُحفز بواسطة المضيف (HIGS) إلى تعزيز مقاومة نباتات الطماطم لذبول الفيوزاريوم بشكل ملحوظ (Singh et al.، 2020). مع ذلك، لم يُدرس الدور المحتمل لتطبيق الأورنيثين الخارجي ضد الإجهادات الحيوية، مثل مسببات الأمراض النباتية، بشكل كافٍ. والأهم من ذلك، أن تأثيرات الأورنيثين على مقاومة الأمراض والظواهر البيوكيميائية والفسيولوجية المرتبطة بها لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير.
يُعدّ فهم تعقيد عدوى فطر Sclerotinia sclerotiorum في البقوليات أمرًا بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات فعّالة لمكافحته. هدفت هذه الدراسة إلى تحديد الدور المحتمل لثنائي الأمين L-ornithine كعامل رئيسي في تعزيز آليات الدفاع ومقاومة نباتات البقوليات لعدوى Sclerotinia sclerotiorum. نفترض أن L-ornithine، بالإضافة إلى تعزيز استجابات الدفاع لدى النباتات المصابة، يلعب دورًا محوريًا في الحفاظ على حالة الأكسدة والاختزال. نقترح أن التأثيرات المحتملة لـ L-ornithine ترتبط بتنظيم آليات الدفاع المضادة للأكسدة، الإنزيمية وغير الإنزيمية، والتداخل مع عوامل ضراوة الفطر والبروتينات المرتبطة بها. هذه الوظيفة المزدوجة لـ L-ornithine تجعله مرشحًا واعدًا لاستراتيجية مستدامة للتخفيف من تأثير العفن الأبيض وتعزيز مقاومة محاصيل البقوليات الشائعة لهذا الفطر الممرض القوي. قد تُسهم نتائج هذه الدراسة في تطوير أساليب مبتكرة وصديقة للبيئة لمكافحة العفن الأبيض والتخفيف من تأثيره على إنتاج البقوليات.
في هذه الدراسة، استُخدم صنف تجاري قابل للإصابة من الفاصوليا الشائعة، وهو جيزة 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3)، كمادة تجريبية. وقد تم الحصول على بذور سليمة من قسم بحوث البقوليات، معهد بحوث المحاصيل الحقلية، مركز البحوث الزراعية، مصر. زُرعت خمس بذور في أوانٍ بلاستيكية (قطرها الداخلي 35 سم، وعمقها 50 سم) مملوءة بتربة مصابة بفطر Sclerotinia sclerotiorum في ظروف دفيئة (25 ± 2 درجة مئوية، رطوبة نسبية 75 ± 1%، 8 ساعات إضاءة/16 ساعة ظلام). بعد 7-10 أيام من الزراعة، تم تخفيف الشتلات بحيث لم يتبق سوى شتلتين بنمو متجانس وثلاث أوراق مكتملة النمو في كل وعاء. رُويت جميع النباتات المزروعة في الأواني مرة كل أسبوعين، وسُمّدت شهريًا بالكمية الموصى بها لهذا الصنف.
لتحضير محلول بتركيز 500 ملغم/لتر من ل-أورنيثين ديامين (المعروف أيضاً باسم (+)-(S)-2,5-ديامينوبنتانويك أسيد؛ من شركة سيغما-ألدريتش، دارمشتات، ألمانيا)، تم إذابة 50 ملغم منه أولاً في 100 مل من الماء المقطر المعقم. ثم تم تخفيف المحلول الأصلي واستخدامه في التجارب اللاحقة. باختصار، تم اختبار ست مجموعات من تراكيز ل-أورنيثين (12.5، 25، 50، 75، 100، و125 ملغم/لتر) في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، استُخدم الماء المقطر المعقم كعينة تحكم سلبية (Mock)، واستُخدم مبيد الفطريات التجاري "Rizolex-T" على شكل مسحوق قابل للبلل بنسبة 50% (توكولوفوس-ميثيل 20% + ثيرام 30%؛ شركة KZ-Kafr El Zayat للمبيدات والمواد الكيميائية، كفر الزيات، محافظة الغربية، مصر) كعينة تحكم إيجابية. وتم اختبار مبيد الفطريات التجاري "Rizolex-T" في المختبر بخمسة تراكيز (2، 4، 6، 8، و10 ملغم/لتر).
جُمعت عينات من سيقان وقرون الفاصوليا الشائعة التي تظهر عليها أعراض نموذجية للعفن الأبيض (معدل الإصابة: 10-30%) من مزارع تجارية. على الرغم من تحديد معظم المواد النباتية المصابة حسب النوع/الصنف (الصنف التجاري جيزة 3 المعرض للإصابة)، إلا أن بعضها الآخر، وخاصة تلك التي تم الحصول عليها من الأسواق المحلية، كانت من أنواع غير معروفة. عُقّمت المواد المصابة المجمعة سطحيًا أولًا بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم بتركيز 0.5% لمدة 3 دقائق، ثم شُطفت عدة مرات بالماء المقطر المعقم وجُففت بورق ترشيح معقم لإزالة الماء الزائد. بعد ذلك، قُطعت الأعضاء المصابة إلى قطع صغيرة من النسيج الأوسط (بين الأنسجة السليمة والمصابة)، وزُرعت على وسط أجار دكستروز البطاطس (PDA) وحُضنت عند درجة حرارة 25 ± 2 درجة مئوية مع دورة ضوئية/مظلمة مدتها 12 ساعة لمدة 5 أيام لتحفيز تكوين الأجسام الصلبة. كما استُخدمت طريقة طرف الغزل الفطري لتنقية العزلات الفطرية من المزارع المختلطة أو الملوثة. تم تحديد العزلة الفطرية المنقاة مبدئيًا بناءً على خصائصها المورفولوجية في المزرعة، ثم تم التأكد من أنها فطر Sclerotinia sclerotiorum بناءً على خصائصها المجهرية. وأخيرًا، تم اختبار جميع العزلات المنقاة من حيث قدرتها على إحداث المرض على صنف الفاصوليا الشائعة الحساس جيزة 3، وذلك لتحقيق مسلمات كوخ.
بالإضافة إلى ذلك، تم تأكيد عزلة S. sclerotiorum الأكثر غزوًا (العزلة رقم 3) استنادًا إلى تسلسل الفاصل الداخلي المنسوخ (ITS) كما هو موضح في دراسات White et al.، 1990؛ Baturo-Ciesniewska et al.، 2017. باختصار، زُرعت العزلات في مرق دكستروز البطاطس (PDB) وحُضنت عند درجة حرارة 25 ± 2 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام. ثم جُمعت الغزلات الفطرية، ورُشحت عبر قماش الشاش، وغُسلت مرتين بالماء المعقم، وجُففت بورق ترشيح معقم. عُزل الحمض النووي الجينومي باستخدام مجموعة Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka، 1997؛ Atallah et al.، 2022، 2024). تم تضخيم منطقة الحمض النووي الريبوزي الداخلي (ITS rDNA) باستخدام زوج البادئات المحدد ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC؛ الحجم المتوقع: 540 زوجًا قاعديًا) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). أُرسلت نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المنقاة للتسلسل (شركة بكين أوكي دينغشنغ للتكنولوجيا الحيوية المحدودة). تم تسلسل تسلسلات الحمض النووي الريبوزي الداخلي (ITS rDNA) ثنائي الاتجاه باستخدام طريقة سانجر للتسلسل. ثم قورنت تسلسلات الاستعلام المُجمّعة بأحدث البيانات في بنك الجينات (GenBank) والمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI، http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) باستخدام برنامج BLASTn. تمت مقارنة تسلسل الاستعلام مع 20 سلالة/عزلة أخرى من S. sclerotiorum تم استرجاعها من أحدث البيانات في بنك الجينات NCBI (الجدول التكميلي S1) باستخدام ClustalW في حزمة تحليل علم الوراثة التطورية الجزيئية (MEGA-11؛ الإصدار 11) (Kumar et al., 2024). أُجري التحليل التطوري باستخدام طريقة الاحتمال الأقصى ونموذج استبدال النيوكليوتيدات العام القابل للعكس زمنيًا (Nei and Kumar, 2000). تظهر الشجرة ذات أعلى قيمة لوغاريتمية للاحتمال. تم اختيار الشجرة الأولية للبحث الاستدلالي باختيار الشجرة ذات أعلى قيمة لوغاريتمية للاحتمال بين شجرة الانضمام الجواري (NJ) (Kumar et al., 2024) وشجرة البخل الأقصى (MP). تم بناء شجرة الانضمام الجواري باستخدام مصفوفة المسافة الزوجية المحسوبة باستخدام النموذج العام القابل للعكس زمنيًا (Nei and Kumar, 2000).
تم تحديد النشاط المضاد للبكتيريا لمركب L-ornithine والمبيد البكتيري "Rizolex-T" في المختبر باستخدام طريقة الانتشار في الأجار. الطريقة: أُخذت كمية مناسبة من المحلول المركز لمركب L-ornithine (500 ملغم/لتر) ومُزجت جيدًا مع 10 مل من وسط PDA المغذي لتحضير محاليل بتراكيز نهائية 12.5، 25، 50، 75، 100، و125 ملغم/لتر على التوالي. استُخدمت خمسة تراكيز من المبيد الفطري "Rizolex-T" (2، 4، 6، 8، و10 ملغم/لتر) وماء مقطر معقم كعينة ضابطة. بعد تصلب الوسط، نُقلت قطعة من فطر Sclerotinia sclerotiorum، قطرها 4 مم، إلى مركز طبق بتري، وحُضنت عند درجة حرارة 25±2 درجة مئوية حتى غطى الفطر طبق بتري بالكامل، ثم سُجل نمو الفطر. احسب النسبة المئوية لتثبيط النمو الشعاعي لفطر S. sclerotiorum باستخدام المعادلة 1.
أُجريت التجربة مرتين، مع ستة تكرارات بيولوجية لكل مجموعة تجريبية/ضابطة، وخمسة أصص (نبتتان في كل أصيص) لكل تكرار بيولوجي. وتم تحليل كل تكرار بيولوجي مرتين (تكراران تقنيان) لضمان دقة وموثوقية وقابلية تكرار النتائج التجريبية. بالإضافة إلى ذلك، استُخدم تحليل الانحدار البروبيتي لحساب تركيز التثبيط النصفي (IC50) وتركيز التثبيط النصفي (IC99) (برنتيس، 1976).
لتقييم إمكانات إل-أورنيثين في ظروف البيوت الزجاجية، أُجريت تجربتان متتاليتان في أصص. باختصار، مُلئت الأصص بتربة طينية رملية معقمة (3:1) ولُقحت بمزرعة مُحضّرة حديثًا من فطر S. sclerotiorum. في البداية، زُرعت أكثر عزلات S. sclerotiorum غزوًا (العزلة رقم 3) عن طريق قطع جسم فطري صلب (sclerotium) إلى نصفين، ووضعه مقلوبًا على وسط PDA، وحُضن عند درجة حرارة 25 درجة مئوية في ظلام دامس (24 ساعة) لمدة 4 أيام لتحفيز نمو الفطريات. بعد ذلك، أُخذت أربع قطع من الأجار بقطر 5 مم من الحافة الأمامية، ولُقحت بـ 100 غرام من خليط معقم من نخالة القمح والأرز (1:1، حجم/حجم)، وحُضنت جميع القوارير عند درجة حرارة 25 ± 2 درجة مئوية في دورة ضوئية/مظلمة مدتها 12 ساعة لمدة 5 أيام لتحفيز تكوين الأجسام الفطرية الصلبة (sclerotia). تم خلط محتويات جميع القوارير جيدًا لضمان تجانسها قبل إضافة التربة. ثم أُضيف 100 غرام من خليط النخالة المُستَعمِر إلى كل وعاء لضمان تركيز ثابت من مسببات الأمراض. رُويت الأوعية المُلقّحة لتنشيط نمو الفطريات ووُضعت في ظروف دفيئة لمدة 7 أيام.
ثم زُرعت خمس بذور من صنف جيزة 3 في كل أصيص. بالنسبة للأصص المعالجة بمادة L-ornithine ومبيد الفطريات Rizolex-T، نُقعت البذور المعقمة أولاً لمدة ساعتين في محلول مائي من المركبين بتركيز نهائي IC99 يبلغ حوالي 250 ملغم/لتر و50 ملغم/لتر على التوالي، ثم جُففت هوائياً لمدة ساعة قبل الزراعة. في المقابل، نُقعت البذور في ماء مقطر معقم كعينة ضابطة سالبة. بعد 10 أيام، وقبل الري الأول، خُففت الشتلات، بحيث لم يتبق سوى شتلتين نظيفتين في كل أصيص. بالإضافة إلى ذلك، ولضمان الإصابة بفطر Sclerotinia sclerotiorum، قُطعت سيقان نباتات الفاصوليا في نفس مرحلة النمو (10 أيام) في موقعين مختلفين باستخدام مشرط معقم، ووُضع حوالي 0.5 غرام من خليط النخالة المُستعمر في كل جرح، ثم عُرضت لرطوبة عالية لتحفيز العدوى وتطور المرض في جميع النباتات المُلقحة. تم إحداث جروح مماثلة في نباتات التحكم، وتم وضع كمية متساوية (0.5 جم) من خليط النخالة المعقم وغير المستعمر في الجرح، وتم الحفاظ عليها تحت رطوبة عالية لمحاكاة بيئة تطور المرض وضمان الاتساق بين مجموعات العلاج.
طريقة المعالجة: رُويت شتلات الفاصوليا بـ 500 مل من محلول مائي من إل-أورنيثين (250 ملغم/لتر) أو مبيد الفطريات ريزولكس-تي (50 ملغم/لتر) عن طريق ري التربة، ثم تكررت المعالجة ثلاث مرات بفاصل زمني قدره 10 أيام. أما عينات المقارنة (المعالجة بالدواء الوهمي) فقد رُويت بـ 500 مل من الماء المقطر المعقم. أُجريت جميع المعالجات في ظروف دفيئة (25 ± 2 درجة مئوية، 75 ± 1% رطوبة نسبية، وفترة إضاءة 8 ساعات ضوء/16 ساعة ظلام). رُويت جميع الأصص كل أسبوعين، وعُولجت شهريًا بسماد NPK متوازن (20-20-20، مع 3.6% كبريت وعناصر دقيقة؛ بذور زين، مصر) بتركيز 3-4 غ/لتر عن طريق الرش الورقي وفقًا لتوصيات الصنف المحدد وتعليمات الشركة المصنعة. ما لم يُذكر خلاف ذلك، تم جمع الأوراق الناضجة المتوسعة بالكامل (الورقتان الثانية والثالثة من الأعلى) من كل تكرار بيولوجي بعد 72 ساعة من المعالجة (hpt)، وتم تجانسها وتجميعها وتخزينها عند -80 درجة مئوية لإجراء المزيد من التحليلات بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، التحديد النسيجي الكيميائي في الموقع لمؤشرات الإجهاد التأكسدي، وبيروكسيد الدهون، ومضادات الأكسدة الإنزيمية وغير الإنزيمية، والتعبير الجيني.
تم تقييم شدة الإصابة بالعفن الأبيض أسبوعيًا لمدة 21 يومًا بعد التلقيح باستخدام مقياس من 1 إلى 9 (الجدول التكميلي S2) استنادًا إلى مقياس بيتزولد وديكسون (1996) المعدل بواسطة تيران وآخرون (2006). باختصار، تم فحص سيقان وفروع نباتات الفاصوليا بدءًا من نقطة التلقيح لمتابعة تطور الآفات على طول العُقد والمسافات بين العُقد. ثم تم قياس المسافة بين الآفة ونقطة التلقيح وأبعد نقطة على طول الساق أو الفرع، وتم إعطاء درجة من 1 إلى 9 بناءً على موقع الآفة، حيث يشير الرقم (1) إلى عدم وجود إصابة مرئية بالقرب من نقطة التلقيح، وتشير الأرقام من 2 إلى 9 إلى زيادة تدريجية في حجم الآفة وتطورها على طول العُقد والمسافات بين العُقد (الجدول التكميلي S2). بعد ذلك، تم تحويل شدة الإصابة بالعفن الأبيض إلى نسبة مئوية باستخدام الصيغة 2.
بالإضافة إلى ذلك، تم حساب المساحة تحت منحنى تطور المرض (AUDPC) باستخدام الصيغة (Shaner and Finney, 1977)، والتي تم تكييفها مؤخرًا للعفن الأبيض للفاصوليا الشائعة (Chauhan et al., 2020) باستخدام المعادلة 3:
حيث Yi = شدة المرض في الوقت ti، و Yi+1 = شدة المرض في الوقت التالي ti+1، و ti = وقت القياس الأول (بالأيام)، و ti+1 = وقت القياس التالي (بالأيام)، و n = العدد الإجمالي لنقاط القياس أو نقاط الملاحظة. تم تسجيل معايير نمو نبات الفاصوليا، بما في ذلك ارتفاع النبات (سم)، وعدد الفروع لكل نبات، وعدد الأوراق لكل نبات، أسبوعيًا لمدة 21 يومًا في جميع التكرارات البيولوجية.
في كل تجربة بيولوجية، جُمعت عينات من الأوراق (الورقتان الثانية والثالثة مكتملتا النمو من الأعلى) في اليوم 45 بعد المعالجة (بعد 15 يومًا من آخر معالجة). احتوت كل تجربة بيولوجية على خمسة أصص (نبتتان في كل أصيص). استُخدم حوالي 500 ملغ من الأنسجة المسحوقة لاستخلاص أصباغ التمثيل الضوئي (الكلوروفيل أ، والكلوروفيل ب، والكاروتينات) باستخدام 80% من الأسيتون عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام. بعد 24 ساعة، خُضعت العينات للطرد المركزي، وجُمع الراشح لتحديد محتوى الكلوروفيل أ، والكلوروفيل ب، والكاروتينات باستخدام مطياف ضوئي UV-160A (شركة شيمادزو، اليابان) وفقًا لطريقة (ليشتنثالر، 1987) عن طريق قياس الامتصاص عند ثلاثة أطوال موجية مختلفة (470، 646، و663 نانومتر). وأخيرًا، تم حساب محتوى أصباغ التمثيل الضوئي باستخدام الصيغ التالية 4-6 التي وصفها ليشتنثالر (1987).
بعد 72 ساعة من المعالجة، جُمعت الأوراق (الورقتان الثانية والثالثة مكتملتا النمو من الأعلى) من كل عينة بيولوجية لتحديد الموقع النسيجي الكيميائي لبيروكسيد الهيدروجين (H2O2) وأنيون فوق الأكسيد (O2•−) في الموقع. تكونت كل عينة بيولوجية من خمسة أصص (نبتتان في كل أصيص). حُللت كل عينة بيولوجية مرتين (عينتان تقنيتان) لضمان دقة وموثوقية وقابلية تكرار الطريقة. حُدد تركيز H2O2 وO2•− باستخدام 0.1% من ثنائي أمينوبنزيدين 3،3′ (DAB؛ سيجما-ألدريتش، دارمشتات، ألمانيا) أو نيتروبلو تترازوليوم (NBT؛ سيجما-ألدريتش، دارمشتات، ألمانيا)، على التوالي، وفقًا للطرق الموصوفة من قبل روميرو-بويرتاس وآخرون (2004) وآدم وآخرون (1989) مع تعديلات طفيفة. لتحديد موقع بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) في الأنسجة باستخدام تقنية التشريب الفراغي، تم ترشيح وريقات الصمام باستخدام محلول DAB بتركيز 0.1% في محلول منظم Tris بتركيز 10 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 7.8)، ثم حُضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة. بعد ذلك، تم تبييض وريقات الصمام باستخدام محلول حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (TCA) بتركيز 0.15% (حجم/حجم) في خليط من الإيثانول والكلوروفورم بنسبة 4:1 (حجم/حجم) (شركة الجمهورية للأدوية والمستلزمات الطبية، القاهرة، مصر)، ثم عُرضت للضوء حتى اسودت. وبالمثل، تم ترشيح صمامات القلب باستخدام محلول منظم فوسفات البوتاسيوم بتركيز 10 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 7.8) يحتوي على 0.1% (وزن/حجم) من HBT لتحديد موقع أيون الأكسجين الفائق (O2•−) في الأنسجة باستخدام تقنية التشريب الفراغي. حُضنت وريقات الصمام في الضوء لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم تم تبييضها كما سبق، ثم عُرضت للضوء حتى ظهرت بقع زرقاء داكنة/بنفسجية. تم تقييم شدة اللون البني الناتج (كمؤشر H2O2) أو الأزرق البنفسجي (كمؤشر O2•−) باستخدام إصدار فيجي من حزمة معالجة الصور ImageJ (http://fiji.sc؛ تم الوصول إليه في 7 مارس 2024).
تم تحديد مستوى مالونديالدهيد (MDA؛ كمؤشر على بيروكسدة الدهون) وفقًا لطريقة دو وبراملاج (1992) مع تعديلات طفيفة. جُمعت أوراق من كل عينة بيولوجية (الورقتان الثانية والثالثة مكتملتا النمو من الأعلى) بعد 72 ساعة من المعالجة. احتوت كل عينة بيولوجية على خمسة أصص (نبتتان في كل أصيص). تم تحليل كل عينة بيولوجية مرتين (عينتان تقنيتان) لضمان دقة الطريقة وموثوقيتها وقابليتها للتكرار. باختصار، استُخدم 0.5 غرام من نسيج الورقة المطحون لاستخلاص MDA باستخدام حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA) بنسبة 20% (MilliporeSigma، برلنغتون، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) يحتوي على 0.01% من بوتيل هيدروكسي تولوين (BHT؛ Sigma-Aldrich، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية). ثم تم تحديد محتوى MDA في المادة الطافية عن طريق قياس الامتصاص عند 532 و 600 نانومتر باستخدام مطياف UV-160A (شركة شيمادزو، اليابان) ثم تم التعبير عنه بوحدة نانومول غرام-1 من الوزن الطازج.
لتقييم مضادات الأكسدة غير الإنزيمية والإنزيمية، جُمعت الأوراق (الورقتان الثانية والثالثة مكتملتا النمو من الأعلى) من كل عينة بيولوجية بعد 72 ساعة من المعالجة. احتوت كل عينة بيولوجية على خمسة أصص (نبتتان في كل أصيص). حُللت كل عينة بيولوجية مرتين (عينتان تقنيتان). طُحنت ورقتان باستخدام النيتروجين السائل واستُخدمتا مباشرةً لتحديد مضادات الأكسدة الإنزيمية وغير الإنزيمية، والأحماض الأمينية الكلية، ومحتوى البرولين، والتعبير الجيني، وقياس كمية الأكسالات.
تم تحديد إجمالي المركبات الفينولية الذائبة باستخدام كاشف فولين-سيوالتو (سيجما-ألدريتش، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية) مع تعديلات طفيفة على الطريقة الموصوفة من قبل كاهكونين وآخرون (1999). باختصار، تم استخلاص حوالي 0.1 غرام من نسيج الورقة المتجانس باستخدام 20 مل من الميثانول بتركيز 80% في الظلام لمدة 24 ساعة، وتم جمع الراشح بعد الطرد المركزي. تم خلط 0.1 مل من مستخلص العينة مع 0.5 مل من كاشف فولين-سيوالتو (10%)، ورجّ الخليط لمدة 30 ثانية، ثم تركه في الظلام لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، أُضيف 0.5 مل من محلول كربونات الصوديوم بتركيز 20% (Na2CO3؛ شركة الجمهورية للأدوية والمستلزمات الطبية، القاهرة، مصر) إلى كل أنبوب، وخُلط جيدًا، ثم حُضنت العينات في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعة واحدة. بعد فترة التحضين، تم قياس امتصاص مزيج التفاعل عند 765 نانومتر باستخدام مطياف ضوئي UV-160A (شركة شيمادزو، اليابان). وتم تحديد تركيز الفينولات الذائبة الكلية في مستخلصات العينة باستخدام منحنى معايرة حمض الغاليك (شركة فيشر ساينتيفيك، هامبتون، نيو هامبشاير، الولايات المتحدة الأمريكية)، وعُبِّر عنه بوحدة مليغرام من مكافئ حمض الغاليك لكل غرام من الوزن الطازج (مليغرام مكافئ حمض الغاليك/غرام من الوزن الطازج).
تم تحديد إجمالي محتوى الفلافونويدات الذائبة وفقًا لطريقة دجيريدان وآخرون (2006) مع تعديلات طفيفة. باختصار، تم خلط 0.3 مل من مستخلص الميثانول المذكور أعلاه مع 0.3 مل من محلول كلوريد الألومنيوم 5% (AlCl3؛ شركة فيشر ساينتيفيك، هامبتون، نيو هامبشاير، الولايات المتحدة الأمريكية)، وتم تحريك المزيج جيدًا ثم حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، أُضيف 0.3 مل من محلول أسيتات البوتاسيوم 10% (شركة الجمهورية للأدوية والمستلزمات الطبية، القاهرة، مصر)، وتم خلط المزيج جيدًا وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد التحضين، تم قياس امتصاص خليط التفاعل عند 430 نانومتر باستخدام مطياف UV-160A (شركة شيمادزو، اليابان). تم تحديد تركيز الفلافونويدات الذائبة الكلية في مستخلصات العينات باستخدام منحنى معايرة الروتين (TCI America، بورتلاند، أوريغون، الولايات المتحدة الأمريكية) ثم تم التعبير عنه بالمليغرامات من مكافئ الروتين لكل غرام من الوزن الطازج (ملغم مكافئ الروتين غ-1 وزن طازج).
تم تحديد إجمالي محتوى الأحماض الأمينية الحرة في أوراق الفاصوليا باستخدام كاشف النينهيدرين المعدل (Thermo Scientific Chemicals، والتهام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) بناءً على الطريقة التي اقترحها يوكوياما وهيراماتسو (2003) والمعدلة من قبل صن وآخرون (2006). باختصار، تم استخلاص 0.1 غرام من النسيج المطحون باستخدام محلول منظم عند درجة حموضة 5.4، ثم تم تفاعل 200 ميكرولتر من الراشح مع 200 ميكرولتر من النينهيدرين (2%) و200 ميكرولتر من البيريدين (10%؛ Spectrum Chemical، نيو برونزويك، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية)، وحُضنت العينة في حمام مائي مغلي لمدة 30 دقيقة، ثم بُردت وقُيس امتصاصها عند 580 نانومتر باستخدام مطياف ضوئي UV-160A (شركة شيمادزو، اليابان). من ناحية أخرى، تم تحديد البرولين باستخدام طريقة بيتس (Bates et al.، 1973). تم استخلاص البرولين باستخدام حمض السلفوساليسيليك بنسبة 3% (شركة Thermo Scientific Chemicals، والتهام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد الطرد المركزي، تم مزج 0.5 مل من الراشح مع 1 مل من حمض الخليك الجليدي (شركة Fisher Scientific، هامبتون، نيو هامبشاير، الولايات المتحدة الأمريكية) وكاشف النينهيدرين، ثم حُضِن المزيج عند 90 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، ثم بُرِّد وقُيس امتصاصه عند 520 نانومتر باستخدام نفس جهاز قياس الطيف الضوئي المذكور سابقًا. حُدِّد إجمالي الأحماض الأمينية الحرة والبرولين في مستخلصات الأوراق باستخدام منحنيات معايرة الجليسين والبرولين (شركة Sigma-Aldrich، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية)، على التوالي، وعُبِّر عنها بوحدة ملغم/غرام من الوزن الطازج.
لتحديد النشاط الإنزيمي للإنزيمات المضادة للأكسدة، تم استخلاص ما يقرب من 500 ملغ من الأنسجة المتجانسة باستخدام 3 مل من محلول Tris buffer بتركيز 50 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 7.8) يحتوي على 1 ملي مولار من EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية) و7.5% من بولي فينيل بيروليدون (PVP؛ Sigma-Aldrich، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية)، وتم طردها مركزيًا عند 10000 × جم لمدة 20 دقيقة تحت التبريد (4 درجات مئوية)، وتم جمع الراشح (مستخلص الإنزيم الخام) (El-Nagar et al.، 2023؛ Osman et al.، 2023). تمت مفاعلة إنزيم الكاتالاز (CAT) مع 2 مل من محلول فوسفات الصوديوم بتركيز 0.1 مولار (الأس الهيدروجيني 6.5؛ شركة سيجما-ألدريتش، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية) و100 ميكرولتر من محلول بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 269 ملي مولار لتحديد نشاطه الإنزيمي وفقًا لطريقة أيبي (1984) مع تعديلات طفيفة (إل-نجار وآخرون، 2023؛ عثمان وآخرون، 2023). وتم تحديد النشاط الإنزيمي لبيروكسيداز المعتمد على الغاياكول (POX) باستخدام طريقة هاراش وآخرون (2009). (2008) مع تعديلات طفيفة (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023)، وتم تحديد النشاط الإنزيمي لأكسيداز البوليفينول (PPO) بعد تفاعله مع 2.2 مل من محلول فوسفات الصوديوم بتركيز 100 ملي مولار (الأس الهيدروجيني 6.0)، و100 ميكرولتر من غاياكول (شركة TCI Chemicals، بورتلاند، أوريغون، الولايات المتحدة الأمريكية)، و100 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 12 ملي مولار. أُجريت هذه الطريقة بعد تعديل طفيف عن (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). أُجري التحليل بعد تفاعله مع 3 مل من محلول الكاتيكول (شركة Thermo Scientific Chemicals، والتهام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) (0.01 مولار) المُحضر حديثًا في محلول فوسفات بتركيز 0.1 مولار (الأس الهيدروجيني 6.0). تم قياس نشاط CAT عن طريق مراقبة تحلل H2O2 عند 240 نانومتر (A240)، وتم قياس نشاط POX عن طريق مراقبة الزيادة في الامتصاص عند 436 نانومتر (A436)، وتم قياس نشاط PPO عن طريق تسجيل تقلبات الامتصاص عند 495 نانومتر (A495) كل 30 ثانية لمدة 3 دقائق باستخدام مطياف UV-160A (Shimadzu، اليابان).
استُخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-PCR) للكشف عن مستويات نسخ ثلاثة جينات مرتبطة بمضادات الأكسدة، وهي: الكاتالاز البيروكسيسومي (PvCAT1؛ رقم الوصول في بنك الجينات: KF033307.1)، وديسموتاز الفائق (PvSOD؛ رقم الوصول في بنك الجينات: XM_068639556.1)، ومختزلة الجلوتاثيون (PvGR؛ رقم الوصول في بنك الجينات: KY195009.1)، في أوراق الفاصوليا (الورقتان الثانية والثالثة مكتملتا النمو من الأعلى) بعد 72 ساعة من آخر معالجة. باختصار، تم استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي Simply P (رقم المنتج: BSC52S1؛ BioFlux، شركة Biori Technology، الصين) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. ثم تم تصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة TOP script™ لتصنيع الحمض النووي التكميلي وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. ترد تسلسلات البادئات للجينات الثلاثة المذكورة أعلاه في الجدول التكميلي S3. استُخدم جين PvActin-3 (رقم التسجيل في GenBank: XM_068616709.1) كجين مرجعي، وحُسب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2-ΔΔCT (ليفاك وشميتجن، 2001). وقد ثبتت استقرارية الأكتين في ظل الإجهاد الحيوي (التفاعل غير المتوافق بين البقوليات الشائعة وفطر الأنثراكنوز Colletotrichum lindemuthianum) والإجهاد اللاأحيائي (الجفاف، والملوحة، وانخفاض درجة الحرارة) (بورخيس وآخرون، 2012).
أجرينا في البداية تحليلًا حاسوبيًا شاملًا لجينوم بروتينات أسيتيل هيدرولاز الأوكسالوأسيتات (OAH) في فطر S. sclerotiorum باستخدام أداة BLAST للبروتين-بروتين (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). باختصار، استخدمنا بروتين OAH من فطر Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH؛ المعرف التصنيفي: 1191702؛ رقم الوصول في GenBank: XP_040799428.1؛ 342 حمضًا أمينيًا) وفطر Penicillium lagena (PlOAH؛ المعرف التصنيفي: 94218؛ رقم الوصول في GenBank: XP_056833920.1؛ 316 حمضًا أمينيًا) كمتواليات استعلام لرسم خريطة البروتين المتماثل في فطر S. sclerotiorum (المعرف التصنيفي: 5180). تم إجراء BLASTp مقابل أحدث بيانات جينوم S. sclerotiorum المتاحة في GenBank على موقع المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI)، http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
بالإضافة إلى ذلك، تم استنتاج جين OAH المتوقع من S. sclerotiorum (SsOAH) والتحليل التطوري والشجرة التطورية لـ AfOAH من A. fijiensis CBS 313.89 وPlOAH من P. lagena باستخدام طريقة الاحتمال الأقصى في برنامج MEGA11 (Tamura et al., 2021) ونموذج JTT القائم على المصفوفة (Jones et al., 1992). وتم دمج الشجرة التطورية مع تحليل المحاذاة المتعددة لتسلسلات البروتين لجميع جينات OAH المتوقعة (SsOAH) من S. sclerotiorum وتسلسل الاستعلام باستخدام أداة المحاذاة القائمة على القيود (COBALT؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007). بالإضافة إلى ذلك، تمت محاذاة أفضل تسلسلات الأحماض الأمينية المتطابقة لـ SsOAH من S. sclerotiorum مع تسلسلات الاستعلام (AfOAH و PlOAH) (Larkin et al.، 2007) باستخدام ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)، وتمت معاينة المناطق المحفوظة في المحاذاة باستخدام أداة ESPript (الإصدار 3.0؛ https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
علاوة على ذلك، تم تصنيف المجالات الوظيفية التمثيلية المتوقعة والمواقع المحفوظة لبروتين SsOAH في فطر Sclerotinia sclerotiorum بشكل تفاعلي إلى عائلات مختلفة باستخدام أداة InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). وأخيرًا، تم إجراء نمذجة ثلاثية الأبعاد لبنية بروتين SsOAH المتوقع في فطر Sclerotinia sclerotiorum باستخدام محرك التعرف على تماثل/تشابه البروتينات (خادم Phyre2 الإصدار 2.0؛ http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015)، وتم التحقق من صحتها باستخدام خادم SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). تم عرض الهياكل ثلاثية الأبعاد المتوقعة (بتنسيق PDB) بشكل تفاعلي باستخدام حزمة UCSF-Chimera (الإصدار 1.15؛ https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al.، 2004).
استُخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في الوقت الحقيقي لتحديد مستوى التعبير الجيني لإنزيم أسيتيل هيدرولاز أوكسالوأسيتات (SsOAH؛ رقم التسجيل في بنك الجينات: XM_001590428.1) في خيوط فطر Sclerotinia sclerotiorum. باختصار، تم تلقيح فطر S. sclerotiorum في قارورة تحتوي على وسط PDB، ووُضعت في حاضنة هزازة (طراز: I2400، شركة نيو برونزويك ساينتيفيك، إديسون، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية) عند درجة حرارة 25 ± 2 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بسرعة 150 دورة في الدقيقة وفي ظلام دامس (24 ساعة) لتحفيز نمو الخيوط الفطرية. بعد ذلك، عُولجت الخلايا بـ L-أورنيثين ومبيد الفطريات Rizolex-T بتركيزات IC50 نهائية (حوالي 40 و3.2 ملغم/لتر على التوالي)، ثم حُضنت لمدة 24 ساعة أخرى في نفس الظروف. بعد فترة الحضانة، خُضعت المزارع للطرد المركزي بسرعة 2500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، وجُمع الراشح (الفطريات) لتحليل التعبير الجيني. وبالمثل، جُمعت الفطريات بعد 0، 24، 48، 72، 96، و120 ساعة من الإصابة من نباتات مصابة تكونت عليها طبقة من العفن الأبيض وغزل فطري قطني على سطح الأنسجة المصابة. استُخلص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الفطريات، ثم جرى تصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) كما هو موضح سابقًا. ترد تسلسلات البادئات الخاصة بجين SsOAH في الجدول التكميلي S3. استُخدم جين SsActin (رقم الوصول في GenBank: XM_001589919.1) كجين مرجعي، وحُسب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2-ΔΔCT (ليفاك وشميتجن، 2001).
تم تحديد حمض الأكساليك في مرق دكستروز البطاطس (PDB) وعينات نباتية تحتوي على الفطر الممرض Sclerotinia sclerotiorum وفقًا لطريقة Xu وZhang (2000) مع تعديلات طفيفة. باختصار، تم تلقيح عزلات S. sclerotiorum في قوارير تحتوي على مرق دكستروز البطاطس، ثم زُرعت في حاضنة هزازة (طراز I2400، شركة نيو برونزويك ساينتيفيك، إديسون، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية) بسرعة 150 دورة في الدقيقة عند درجة حرارة 25 ± 2 درجة مئوية لمدة 3-5 أيام في ظلام دامس (24 ساعة) لتحفيز نمو الفطريات. بعد التحضين، رُشِّح المستنبت الفطري أولًا باستخدام ورق ترشيح واتمان رقم 1، ثم خُضِعَ للطرد المركزي بسرعة 2500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق لإزالة ما تبقى من الفطريات. جُمع السائل الطافي وحُفِظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لإجراء مزيد من التحديد الكمي للأكسالات. لتحضير عينات النبات، تم استخلاص ما يقارب 0.1 غرام من أجزاء أنسجة النبات ثلاث مرات بالماء المقطر (2 مل في كل مرة). ثم تم طرد العينات مركزياً بسرعة 2500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، وتم ترشيح السائل الطافي جافاً باستخدام ورق ترشيح واتمان رقم 1، ثم تم جمعه لإجراء المزيد من التحليلات.
لتحليل حمض الأكساليك كميًا، تم تحضير مزيج التفاعل في أنبوب زجاجي ذي سدادة بالترتيب التالي: 0.2 مل من العينة (أو مرشح مزرعة PDB أو محلول حمض الأكساليك القياسي)، 0.11 مل من أزرق بروموفينول (BPB، 1 ملي مولار؛ شركة فيشر كيميكال، بيتسبرغ، بنسلفانيا، الولايات المتحدة الأمريكية)، 0.198 مل من حمض الكبريتيك 1 مولار (H2SO4؛ شركة الجمهورية للأدوية والمستلزمات الطبية، القاهرة، مصر)، و0.176 مل من ثنائي كرومات البوتاسيوم 100 ملي مولار (K2Cr2O7؛ شركة TCI للمواد الكيميائية، بورتلاند، أوريغون، الولايات المتحدة الأمريكية). ثم تم تخفيف المحلول إلى 4.8 مل بالماء المقطر، ومزجه جيدًا، ووضعه فورًا في حمام مائي عند درجة حرارة 60 درجة مئوية. بعد 10 دقائق، تم إيقاف التفاعل بإضافة 0.5 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم (NaOH؛ 0.75 مولار). تم قياس الامتصاص (A600) لمزيج التفاعل عند 600 نانومتر باستخدام مطياف ضوئي UV-160 (شركة شيمادزو، اليابان). استُخدم وسط PDB والماء المقطر كضوابط لتحديد كمية مُرشحات المزارع وعينات النباتات، على التوالي. حُددت تراكيز حمض الأكساليك في مُرشحات المزارع، مُعبرًا عنها بميكروغرام من حمض الأكساليك لكل ملليلتر من وسط PDB (ميكروغرام/مل)، وفي مُستخلصات الأوراق، مُعبرًا عنها بميكروغرام من حمض الأكساليك لكل غرام من الوزن الطازج (ميكروغرام/غ وزن طازج)، باستخدام منحنى معايرة حمض الأكساليك (شركة ثيرمو فيشر ساينتيفيك كيميكالز، والتهام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية).
صُممت جميع التجارب في هذه الدراسة وفق تصميم عشوائي كامل (CRD) بستة تكرارات بيولوجية لكل معاملة، وخمسة أصص لكل تكرار بيولوجي (نبتتان لكل أصيص)، ما لم يُذكر خلاف ذلك. وتم تحليل التكرارات البيولوجية مرتين (تكراران تقنيان). استُخدمت التكرارات التقنية للتحقق من قابلية تكرار التجربة نفسها، ولكنها لم تُستخدم في التحليل الإحصائي لتجنب التكرارات الزائفة. وتم تحليل البيانات إحصائيًا باستخدام تحليل التباين (ANOVA) متبوعًا باختبار توكي-كرامر للفرق المعنوي الصادق (HSD) (p ≤ 0.05). أما بالنسبة للتجارب المخبرية، فقد حُسبت قيم IC50 وIC99 باستخدام نموذج بروبيت، وحُسبت فترات الثقة بنسبة 95%.
تم جمع أربع عزلات فطرية من حقول فول الصويا المختلفة في محافظة الغبية بمصر. على وسط PDA، أنتجت جميع العزلات غزلًا فطريًا أبيض كريميًا سرعان ما تحول إلى لون أبيض قطني (الشكل 1أ)، ثم إلى لون بيج أو بني في مرحلة التصلب. عادةً ما تكون الأجسام الصلبة كثيفة، سوداء اللون، كروية أو غير منتظمة الشكل، ويتراوح طولها بين 5.2 و7.7 ملم وقطرها بين 3.4 و5.3 ملم (الشكل 1ب). على الرغم من أن أربع عزلات أظهرت نمطًا هامشيًا للأجسام الصلبة على حافة وسط الزرع بعد 10-12 يومًا من الحضانة عند درجة حرارة 25 ± 2 درجة مئوية (الشكل 1أ)، إلا أن عدد الأجسام الصلبة في كل طبق كان مختلفًا بشكل ملحوظ بينها (P < 0.001)، حيث سجلت العزلة رقم 3 أعلى عدد من الأجسام الصلبة (32.33 ± 1.53 جسمًا صلبًا لكل طبق؛ الشكل 1ج). وبالمثل، أنتجت العزلة رقم 3 كمية أكبر من حمض الأكساليك في وسط PDB مقارنةً بالعزلات الأخرى (3.33 ± 0.49 ميكروغرام/مل؛ الشكل 1D). أظهرت العزلة رقم 3 خصائص مورفولوجية ومجهرية نموذجية للفطر الممرض للنباتات Sclerotinia sclerotiorum. فعلى سبيل المثال، على وسط PDA، نمت مستعمرات العزلة رقم 3 بسرعة، وكانت بيضاء كريمية اللون (الشكل 1A)، ولونها من الجهة الخلفية بيج أو بني مصفر فاتح، واحتاجت إلى 6-7 أيام عند درجة حرارة 25 ± 2 درجة مئوية لتغطية سطح طبق قطره 9 سم بالكامل. وبناءً على هذه الخصائص المورفولوجية والمجهرية، تم تحديد العزلة رقم 3 على أنها Sclerotinia sclerotiorum.
الشكل 1. خصائص وقدرة عزلات S. sclerotiorum على إحداث المرض من محاصيل البقوليات الشائعة. (أ) نمو الفطريات لأربع عزلات من S. sclerotiorum على وسط PDA، (ب) الأجسام الصلبة لأربع عزلات من S. sclerotiorum، (ج) عدد الأجسام الصلبة (لكل طبق)، (د) إفراز حمض الأكساليك على وسط PDB (ميكروغرام/مل)، و(هـ) شدة المرض (%) لأربع عزلات من S. sclerotiorum على صنف البقوليات التجاري القابل للإصابة جيزة 3 في ظروف الدفيئة. تمثل القيم المتوسط ​​± الانحراف المعياري لخمسة تكرارات بيولوجية (ن = 5). تشير الأحرف المختلفة إلى وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المعاملات (ق < 0.05). (و-ح) ظهرت أعراض العفن الأبيض النموذجية على السيقان الهوائية والقرون، على التوالي، بعد 10 أيام من التلقيح بالعزلة رقم 3. (أ) أُجري تحليل تطوري لمنطقة الفاصل الداخلي المنسوخ (ITS) لعزلة S. sclerotiorum رقم 3 باستخدام طريقة الاحتمال الأقصى، وقورنت النتائج بـ 20 عزلة/سلالة مرجعية مُستقاة من قاعدة بيانات المركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). تشير الأرقام أعلى خطوط التجميع إلى نسبة تغطية المنطقة (%)، بينما تشير الأرقام أسفل خطوط التجميع إلى طول الفرع.
علاوة على ذلك، ولتأكيد قدرة الفطر على إحداث المرض، استُخدمت أربع عزلات من فطر Sclerotinia sclerotiorum لتلقيح صنف الفاصوليا التجارية الحساسة "جيزة 3" في ظروف الدفيئة، وهو ما يتوافق مع مسلمات كوخ (الشكل 1هـ). على الرغم من أن جميع العزلات الفطرية المُستخلصة كانت مُمرضة وقادرة على إصابة الفاصوليا الخضراء (صنف جيزة 3)، مُسببةً أعراض العفن الأبيض النموذجية على جميع الأجزاء الهوائية (الشكل 1و)، وخاصةً على السيقان (الشكل 1ز) والقرون (الشكل 1ح) بعد 10 أيام من التلقيح، إلا أن العزلة 3 كانت الأكثر ضراوة في تجربتين مستقلتين. وسجلت العزلة 3 أعلى نسبة شدة للمرض على نباتات الفاصوليا (24.0 ± 4.0، 58.0 ± 2.0، و76.7 ± 3.1 في الأيام 7، 14، و21 بعد الإصابة، على التوالي؛ الشكل 1و).
تم تأكيد هوية العزلة رقم 3 من فطر Sclerotinia sclerotiorum، وهي الأكثر غزوًا، استنادًا إلى تسلسل الفاصل الداخلي المنسوخ (ITS) (الشكل 1I). أظهر التحليل التطوري بين العزلة رقم 3 و20 عزلة/سلالة مرجعية تشابهًا عاليًا (>99%). ومن الجدير بالذكر أن العزلة رقم 3 من فطر Sclerotinia sclerotiorum (533 زوجًا قاعديًا) تُظهر تشابهًا كبيرًا مع العزلة الأمريكية LPM36 من فطر Sclerotinia sclerotiorum المعزولة من بذور البازلاء الجافة (رقم الوصول في GenBank: MK896659.1؛ 540 زوجًا قاعديًا)، والعزلة الصينية YKY211 من فطر Sclerotinia sclerotiorum (رقم الوصول في GenBank: OR206374.1؛ 548 زوجًا قاعديًا)، والتي تُسبب تعفن ساق نبات البنفسج (Matthiola incana)، حيث تتجمع جميعها بشكل منفصل في أعلى مخطط التفرع (الشكل 1I). تم إيداع التسلسل الجديد في قاعدة بيانات المركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية (NCBI) وأُطلق عليه اسم "Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25" (رقم الوصول في GenBank: PV202792). يتضح أن العزلة رقم 3 هي الأكثر غزوًا؛ لذا، تم اختيارها للدراسة في جميع التجارب اللاحقة.
تمت دراسة النشاط المضاد للبكتيريا لثنائي الأمين L-أورنيثين (سيجما-ألدريتش، دارمشتات، ألمانيا) بتراكيز مختلفة (12.5، 25، 50، 75، 100، و125 ملغم/لتر) ضد عزلة S. sclerotiorum رقم 3 في المختبر. ومن الجدير بالذكر أن L-أورنيثين أظهر تأثيرًا مضادًا للبكتيريا، حيث ثبّط تدريجيًا النمو الشعاعي لخيوط S. sclerotiorum بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 2أ، ب). عند أعلى تركيز تم اختباره (125 ملغم/لتر)، أظهر L-ornithine أعلى معدل تثبيط لنمو الفطريات (99.62 ± 0.27%؛ الشكل 2ب)، والذي كان مكافئًا لمبيد الفطريات التجاري Rizolex-T (معدل التثبيط 99.45 ± 0.39%؛ الشكل 2ج) عند أعلى تركيز تم اختباره (10 ملغم/لتر)، مما يشير إلى فعالية مماثلة.
الشكل 2. النشاط المضاد للبكتيريا لمركب L-ornithine ضد فطر Sclerotinia sclerotiorum في المختبر. (أ) مقارنة النشاط المضاد للبكتيريا لتراكيز مختلفة من L-ornithine ضد S. sclerotiorum مع مبيد الفطريات التجاري Rizolex-T (10 ملغم/لتر). (ب، ج) معدل تثبيط نمو الفطريات S. sclerotiorum (%) بعد المعالجة بتراكيز مختلفة من L-ornithine (12.5، 25، 50، 75، 100، و125 ملغم/لتر) أو Rizolex-T (2، 4، 6، 8، و10 ملغم/لتر)، على التوالي. تمثل القيم المتوسط ​​± الانحراف المعياري لخمسة تكرارات بيولوجية (n = 5). تشير الأحرف المختلفة إلى وجود فروق إحصائية بين المعالجات (p < 0.05). (د، هـ) تحليل انحدار نموذج بروبيت لمركب L-ornithine ومبيد الفطريات التجاري Rizolex-T، على التوالي. يظهر خط انحدار نموذج بروبيت كخط أزرق متصل، وتظهر فترة الثقة (95٪) كخط أحمر متقطع.
بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تحليل انحدار بروبيت، وتظهر الرسومات البيانية المقابلة في الجدول 1 والشكلين 2D و2E. باختصار، أشارت قيمة الميل المقبولة (y = 2.92x − 4.67) والإحصائيات الهامة المرتبطة بها (Cox & Snell R2 = 0.3709، Nagelkerke R2 = 0.4998 وp < 0.0001؛ الشكل 2D) لـ L-ornithine إلى نشاط مضاد للفطريات معزز ضد S. sclerotiorum مقارنة بمبيد الفطريات التجاري Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99، Cox & Snell R2 = 0.1242، Nagelkerke R2 = 0.1708 وp < 0.0001) (الجدول 1).
الجدول 1. قيم التركيز المثبط النصفي الأقصى (IC50) و IC99 (ملغم/لتر) لـ L-ornithine ومبيد الفطريات التجاري "Rizolex-T" ضد S. sclerotiorum.
بشكل عام، قلل إل-أورنيثين (بتركيز 250 ملغم/لتر) بشكل ملحوظ من نمو وشدة العفن الأبيض على نباتات الفاصوليا المعالجة مقارنةً بالنباتات غير المعالجة المصابة بفطر Sclerotinia sclerotiorum (المجموعة الضابطة؛ الشكل 3أ). باختصار، على الرغم من أن شدة المرض في النباتات غير المعالجة المصابة (المجموعة الضابطة) ازدادت تدريجيًا (52.67 ± 1.53، 83.21 ± 2.61، و92.33 ± 3.06%)، إلا أن إل-أورنيثين قلل بشكل ملحوظ من شدة المرض (%) طوال فترة التجربة (8.97 ± 0.15، 18.00 ± 1.00، و26.36 ± 3.07) في الأيام 7، 14، و21 بعد المعالجة، على التوالي (الشكل 3أ). وبالمثل، عند معالجة نباتات الفاصوليا المصابة بفطر Sclerotinia sclerotiorum بـ 250 ملغم/لتر من L-ornithine، انخفضت المساحة تحت منحنى تطور المرض (AUDPC) من 1274.33 ± 33.13 في المجموعة الضابطة غير المعالجة إلى 281.03 ± 7.95، وهي قيمة أقل قليلاً من تلك الخاصة بالمجموعة الضابطة الموجبة المعالجة بمبيد الفطريات Rizolex-T بتركيز 50 ملغم/لتر (183.61 ± 7.71؛ الشكل 3ب). وقد لوحظ الاتجاه نفسه في التجربة الثانية.
الشكل 3. تأثير التطبيق الخارجي لـ L-أورنيثين على تطور العفن الأبيض في الفاصوليا الشائعة الناتج عن فطر Sclerotinia sclerotiorum في ظروف البيوت المحمية. (أ) منحنى تطور المرض للعفن الأبيض في الفاصوليا الشائعة بعد المعالجة بـ 250 ملغم/لتر من L-أورنيثين. (ب) المساحة تحت منحنى تطور المرض (AUDPC) للعفن الأبيض في الفاصوليا الشائعة بعد المعالجة بـ L-أورنيثين. تمثل القيم المتوسط ​​± الانحراف المعياري لخمسة تكرارات بيولوجية (n = 5). تشير الأحرف المختلفة إلى وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المعاملات (p < 0.05).
أدى التطبيق الخارجي لـ 250 ملغم/لتر من إل-أورنيثين إلى زيادة تدريجية في طول النبات (الشكل 4أ)، وعدد الفروع لكل نبات (الشكل 4ب)، وعدد الأوراق لكل نبات (الشكل 4ج) بعد 42 يومًا. في حين أن مبيد الفطريات التجاري ريزولكس-تي (50 ملغم/لتر) كان له التأثير الأكبر على جميع المعايير الغذائية المدروسة، كان للتطبيق الخارجي لـ 250 ملغم/لتر من إل-أورنيثين التأثير الثاني الأكبر مقارنةً بالعينات الضابطة غير المعالجة (الأشكال 4أ-ج). من جهة أخرى، لم يُظهر العلاج بـ L-أورنيثين أي تأثير يُذكر على محتوى صبغات التمثيل الضوئي، الكلوروفيل أ (الشكل 4د) والكلوروفيل ب (الشكل 4هـ)، ولكنه زاد قليلاً من إجمالي محتوى الكاروتينات (0.56 ± 0.03 ملغم/غم من الوزن الطازج) مقارنةً بالعينة الضابطة السالبة (0.44 ± 0.02 ملغم/غم من الوزن الطازج) والعينة الضابطة الموجبة (0.46 ± 0.02 ملغم/غم من الوزن الطازج؛ الشكل 4و). وبشكل عام، تُشير هذه النتائج إلى أن L-أورنيثين ليس سامًا للبقوليات المُعالجة، بل قد يُحفز نموها.
الشكل 4. تأثير إضافة الأورنيثين الخارجي على خصائص النمو وأصباغ التمثيل الضوئي لأوراق الفاصوليا المصابة بفطر Sclerotinia sclerotiorum في ظروف الدفيئة. (أ) ارتفاع النبات (سم)، (ب) عدد الأفرع في النبات، (ج) عدد الأوراق في النبات، (د) محتوى الكلوروفيل أ (ملغم/غ وزن رطب)، (هـ) محتوى الكلوروفيل ب (ملغم/غ وزن رطب)، (و) إجمالي محتوى الكاروتينات (ملغم/غ وزن رطب). القيم هي المتوسط ​​± الانحراف المعياري لخمسة تكرارات بيولوجية (ن = 5). تشير الأحرف المختلفة إلى وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المعاملات (ق < 0.05).
أظهر التحديد النسيجي الكيميائي الموضعي لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS؛ معبرًا عنها ببيروكسيد الهيدروجين [H2O2]) والجذور الحرة (معبرًا عنها بأنيونات فوق الأكسيد [O2•−]) أن التطبيق الخارجي لـ L-أورنيثين (250 ملغم/لتر) قلل بشكل ملحوظ من تراكم H2O2 (96.05 ± 5.33 نانومول/غرام من الوزن الطازج؛ الشكل 5أ) وO2•− (32.69 ± 8.56 نانومول/غرام من الوزن الطازج؛ الشكل 5ب) مقارنةً بتراكمها في كل من النباتات المصابة غير المعالجة (173.31 ± 12.06 و149.35 ± 7.94 نانومول/غرام من الوزن الطازج، على التوالي) والنباتات المعالجة بـ 50 ملغم/لتر من مبيد الفطريات التجاري Rizolex-T (170.12 ± 9.50). و157.00 ± 7.81 نانومول/غرام من الوزن الطازج، على التوالي، بعد 72 ساعة. تراكمت مستويات عالية من بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) وجذور الأكسجين الفائقة (O2•−) تحت ضغط عالٍ (الشكل 5أ، ب). وبالمثل، أظهر اختبار مالونديالدهيد (MDA) القائم على حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (TCA) أن نباتات الفاصوليا المصابة بفطر Sclerotinia sclerotiorum تراكمت فيها مستويات أعلى من MDA (113.48 ± 10.02 نانومول/غرام من الوزن الطازج) في أوراقها (الشكل 5ج). ومع ذلك، أدى التطبيق الخارجي لـ L-أورنيثين إلى تقليل بيروكسدة الدهون بشكل ملحوظ، كما يتضح من انخفاض محتوى MDA في النباتات المعالجة (33.08 ± 4.00 نانومول/غرام من الوزن الطازج).
الشكل 5. تأثير تطبيق L-ornithine الخارجي على المؤشرات الرئيسية للإجهاد التأكسدي وآليات الدفاع المضادة للأكسدة غير الأنزيمية في أوراق الفاصوليا المصابة بـ S. sclerotiorum بعد 72 ساعة من الإصابة في ظروف الدفيئة. (أ) بيروكسيد الهيدروجين (H2O2؛ نانومول/غرام من الوزن الطازج) بعد 72 ساعة من المعالجة، (ب) أنيون فوق الأكسيد (O2•−؛ نانومول/غرام من الوزن الطازج) بعد 72 ساعة من المعالجة، (ج) مالونديالدهيد (MDA؛ نانومول/غرام من الوزن الطازج) بعد 72 ساعة من المعالجة، (د) إجمالي الفينولات الذائبة (ملغ مكافئ حمض الغاليك/غرام من الوزن الطازج) بعد 72 ساعة من المعالجة، (هـ) إجمالي الفلافونويدات الذائبة (ملغ مكافئ الريتينول/غرام من الوزن الطازج) بعد 72 ساعة من المعالجة، (و) إجمالي الأحماض الأمينية الحرة (ملغ/غرام من الوزن الطازج) بعد 72 ساعة من المعالجة، و(ز) محتوى البرولين (ملغ/غرام من الوزن الطازج) بعد 72 ساعة من المعالجة. تمثل القيم المتوسط ​​± الانحراف المعياري (المتوسط ​​± الانحراف المعياري) لخمس عينات بيولوجية متكررة (ن = 5). تشير الأحرف المختلفة إلى وجود اختلافات ذات دلالة إحصائية بين العلاجات (p < 0.05).