تُقدّم نظريات الدفاع النباتية المختلفة إرشادات نظرية هامة لتفسير أنماط الأيض المتخصص في النباتات، إلا أن تنبؤاتها الرئيسية لا تزال بحاجة إلى اختبار. في هذه الدراسة، استخدمنا تحليل مطياف الكتلة الترادفي غير المتحيز (MS/MS) لاستكشاف الميتابولوم لسلالات التبغ المُضعفة بشكل منهجي، بدءًا من النباتات الفردية وصولًا إلى المجموعات والأنواع وثيقة الصلة، وقمنا بمعالجة عدد كبير من نظريات خصائص مطياف الكتلة بناءً على أطياف المركبات في إطار المعلومات لاختبار التنبؤات الرئيسية لنظريتي الدفاع الأمثل (OD) والهدف المتحرك (MT). يتوافق مُكوّن المعلومات في علم الأيض النباتي مع نظرية الدفاع الأمثل، ولكنه يتعارض مع التنبؤ الرئيسي لنظرية الهدف المتحرك بشأن ديناميكيات الأيض الناتجة عن الحيوانات العاشبة. من المقياس التطوري الدقيق إلى المقياس التطوري الكلي، تم تحديد إشارة الجاسمونات باعتبارها المحدد الرئيسي للدفاع الأمثل، بينما وفرت إشارة الإيثيلين ضبطًا دقيقًا للاستجابة الخاصة بالحيوانات العاشبة التي تم تحديدها بواسطة الشبكة الجزيئية لتحليل مطياف الكتلة الترادفي.
تُعدّ المستقلبات المتخصصة ذات البنى المتنوعة عناصر أساسية في تكيف النباتات مع البيئة، لا سيما في الدفاع ضد الأعداء (1). وقد حفّز التنوع المذهل لعمليات الأيض المتخصصة في النباتات عقودًا من البحث المعمق حول جوانبها المتعددة من الوظائف البيئية، وأسفر عن ظهور قائمة طويلة من نظريات الدفاع النباتي، التي تُعنى بالتطور التطوري والبيئي للتفاعلات بين النباتات والحشرات. ويُقدّم البحث التجريبي توجيهات هامة (2). مع ذلك، لم تتبع هذه النظريات المنهج المعياري للاستدلال الاستنباطي الافتراضي، حيث كانت التنبؤات الرئيسية على نفس مستوى التحليل (3) وتم اختبارها تجريبيًا لدفع الدورة التالية من التطوير النظري (4). وتُقيّد القيود التقنية جمع البيانات بفئات أيضية محددة، وتستبعد التحليل الشامل للمستقلبات المتخصصة، مما يحول دون إجراء مقارنات بين الفئات، وهي مقارنات ضرورية للتطوير النظري (5). ويُعيق نقص بيانات علم الأيض الشاملة، وعدم وجود معيار موحد لمقارنة سير عمل معالجة الفضاء الأيضي بين مجموعات نباتية مختلفة، النضج العلمي لهذا المجال.
تُتيح أحدث التطورات في مجال علم الأيض باستخدام مطياف الكتلة الترادفي (MS/MS) توصيفًا شاملًا للتغيرات الأيضية داخل وبين أنواع مجموعة تصنيفية معينة، ويمكن دمجها مع الأساليب الحسابية لحساب التشابه البنيوي بين هذه الخلائط المعقدة. (5) يتطلب ذلك معرفة مسبقة بالكيمياء. يوفر الجمع بين التقنيات المتقدمة في التحليل والحوسبة إطارًا ضروريًا لاختبار العديد من التنبؤات التي وضعتها النظريات البيئية والتطورية للتنوع الأيضي على المدى الطويل. قدّم شانون (6) نظرية المعلومات لأول مرة في مقالته الرائدة عام 1948، واضعًا بذلك الأساس للتحليل الرياضي للمعلومات، والذي استُخدم في العديد من المجالات الأخرى إلى جانب تطبيقه الأصلي. في علم الجينوم، طُبقت نظرية المعلومات بنجاح لتحديد كمية المعلومات المحافظة على التسلسل (7). في أبحاث علم النسخ، تُحلل نظرية المعلومات التغيرات الكلية في النسخ الجيني (8). في بحث سابق، طبقنا الإطار الإحصائي لنظرية المعلومات على علم الأيض لوصف الخبرة الأيضية على مستوى الأنسجة في النباتات (9). هنا، نجمع بين سير العمل القائم على MS/MS والإطار الإحصائي لنظرية المعلومات، والذي يتميز بالتنوع الأيضي في العملة المشتركة، لمقارنة التنبؤات الرئيسية لنظرية دفاع النبات عن الميتابولوم الناجم عن الحيوانات العاشبة.
عادةً ما تكون الأطر النظرية للدفاع النباتي متداخلة، ويمكن تقسيمها إلى فئتين: الأولى تحاول تفسير توزيع المستقلبات النباتية المتخصصة بناءً على وظائفها الدفاعية، مثل نظرية الدفاع الأمثل (OD) (10)، ونظرية الهدف المتحرك (MT) (11)، ونظرية الظهور (12)، بينما تسعى أخرى إلى تقديم تفسيرات ميكانيكية لكيفية تأثير تغيرات توافر الموارد على نمو النبات وتراكم المستقلبات المتخصصة، مثل الكربون: فرضية توازن المغذيات (13)، وفرضية معدل النمو (14)، وفرضية توازن النمو والتمايز (15). وتختلف هاتان المجموعتان من النظريات في مستوى التحليل (4). ومع ذلك، تهيمن نظريتان تتناولان الوظائف الدفاعية على المستوى الوظيفي على النقاش الدائر حول الدفاعات النباتية التكوينية والمستحثة: نظرية الدفاع الأمثل (OD)، التي تفترض أن النباتات تستثمر في دفاعاتها الكيميائية المكلفة فقط عند الحاجة، على سبيل المثال، عند تناولها. فعندما يهاجم حيوان عشبي، يتم، وفقًا لاحتمالية الهجوم المستقبلي، تحديد المركب ذي الوظيفة الدفاعية (10). تقترح فرضية MT أنه لا يوجد محور لتغير الأيض الاتجاهي، بل يتغير الأيض عشوائيًا، مما يخلق إمكانية إعاقة "هدف الحركة" الأيضي للحيوانات العاشبة المهاجمة. بعبارة أخرى، تقدم هاتان النظريتان تنبؤات متناقضة حول إعادة تشكيل الأيض التي تحدث بعد هجوم الحيوانات العاشبة: العلاقة بين التراكم أحادي الاتجاه للأيضات ذات الوظيفة الدفاعية (OD) والتغيرات الأيضية غير الموجهة (MT) (11).
لا تقتصر فرضيتا OD وMT على التغيرات المُستحثة في الميتابولوم فحسب، بل تشملان أيضًا العواقب البيئية والتطورية لتراكم هذه المستقلبات، مثل التكاليف والفوائد التكيفية لهذه التغيرات الأيضية في بيئة بيئية محددة (16). ورغم أن كلتا الفرضيتين تُقرّان بالوظيفة الدفاعية للمستقلبات المتخصصة، والتي قد تكون مكلفة أو غير مكلفة، فإن التنبؤ الرئيسي الذي يُميّز فرضيتي OD وMT يكمن في اتجاه التغيرات الأيضية المُستحثة. وقد حظي تنبؤ نظرية OD بأكبر قدر من الاهتمام التجريبي حتى الآن. وتشمل هذه الاختبارات دراسة وظائف الدفاع المباشرة أو غير المباشرة لأنسجة مختلفة لمركبات محددة في البيوت الزجاجية والظروف الطبيعية، بالإضافة إلى التغيرات في مرحلة نمو النبات (17-19). ومع ذلك، ونظرًا لعدم وجود منهجية عمل وإطار إحصائي لتحليل شامل للتنوع الأيضي لأي كائن حي، فإن التنبؤ الرئيسي المُختلف بين النظريتين (أي اتجاه التغيرات الأيضية) لا يزال بحاجة إلى اختبار. نقدم هنا تحليلًا من هذا القبيل.
من أبرز خصائص المستقلبات النباتية المتخصصة تنوعها البنيوي الهائل على جميع المستويات، بدءًا من النباتات المفردة، مرورًا بالمجموعات السكانية، وصولًا إلى الأنواع المتشابهة (20). ويمكن ملاحظة العديد من التغيرات الكمية في المستقلبات المتخصصة على مستوى المجموعات السكانية، بينما تُحافظ الاختلافات النوعية القوية عادةً على وجودها على مستوى الأنواع (20). ولذلك، يُعد التنوع الأيضي النباتي الجانب الرئيسي للتنوع الوظيفي، إذ يعكس القدرة على التكيف مع مختلف البيئات، لا سيما تلك البيئات ذات احتمالات الغزو المختلفة من قِبل الحشرات المتخصصة والحيوانات العاشبة الشائعة (21). منذ نشر مقالة فرانكل الرائدة (22) حول أسباب وجود المستقلبات النباتية المتخصصة، اعتُبرت التفاعلات مع مختلف الحشرات ضغوطًا انتقائية مهمة، ويُعتقد أن هذه التفاعلات قد شكلت النباتات خلال التطور. (23). وقد تعكس الاختلافات بين الأنواع في تنوع المستقلبات المتخصصة أيضًا التوازن الفسيولوجي المرتبط بالدفاع النباتي التكويني والمستحث ضد استراتيجيات الحيوانات العاشبة، حيث غالبًا ما يكون هناك ارتباط سلبي بين النوعين (24). على الرغم من أن الحفاظ على دفاع قوي في جميع الأوقات قد يكون مفيدًا، إلا أن التغيرات الأيضية المصاحبة للدفاع في الوقت المناسب توفر فوائد واضحة للنباتات، إذ تسمح لها بتوجيه مواردها القيّمة نحو وظائف فسيولوجية أخرى (19، 24)، وتجنب الحاجة إلى التكافل. كما أن الأضرار الجانبية (25) قد تُسبب أضرارًا جانبية. بالإضافة إلى ذلك، قد تؤدي عمليات إعادة تنظيم المستقلبات المتخصصة هذه، الناتجة عن الحشرات العاشبة، إلى توزيع مدمر في المجموعة (26)، وقد تعكس قراءات مباشرة لتغيرات طبيعية جوهرية في إشارة حمض الجاسمونيك (JA)، والتي قد تبقى في المجموعة. وتُعد إشارات JA المرتفعة والمنخفضة بمثابة مفاضلة بين الدفاع ضد الحشرات العاشبة والتنافس مع أنواع محددة (27). علاوة على ذلك، ستشهد مسارات التخليق الحيوي للمستقلبات المتخصصة فقدانًا وتحولًا سريعًا خلال التطور، مما يؤدي إلى توزيع أيضي غير متجانس بين الأنواع وثيقة الصلة (28). ويمكن أن تنشأ هذه التغيرات الشكلية بسرعة استجابةً لتغير أنماط الحشرات العاشبة (29)، مما يعني أن تقلب مجتمعات الحشرات العاشبة عامل رئيسي في تباين الأيض.
هنا، قمنا بحل المشكلات التالية تحديدًا: (أ) كيف تُعيد الحشرات العاشبة تشكيل الميتابولوم النباتي؟ (ب) ما هي المكونات المعلوماتية الرئيسية لللدونة الأيضية التي يمكن قياسها لاختبار تنبؤات نظرية الدفاع طويلة الأمد؟ (ج) هل يُعاد برمجة الميتابولوم النباتي بطريقة فريدة للمهاجم؟ وإذا كان الأمر كذلك، فما هو دور الهرمونات النباتية في تصميم استجابة أيضية محددة، وما هي المستقلبات التي تُساهم في خصوصية الدفاع النوعية؟ (د) بما أن التنبؤات التي تُقدمها العديد من نظريات الدفاع يُمكن تعميمها على جميع مستويات الأنسجة البيولوجية، فقد تساءلنا عن مدى اتساق الاستجابة الأيضية الناتجة من المقارنة الداخلية إلى المقارنة بين الأنواع؟ لهذا الغرض، قمنا بدراسة منهجية للميتابولوم الورقي لنبات التبغ، وهو نبات نموذجي بيئي يتميز بعمليات أيض متخصصة غنية، وفعال ضد يرقات نوعين من الحشرات العاشبة المحلية، وهما: حرشفيات الأجنحة (Lepidoptera datura) (شديدة العدوانية، تتغذى بشكل رئيسي على نباتات الفصيلة الباذنجانية) ودودة أوراق القطن (Spodoptera littoralis). تُعتبر ديدان أوراق القطن نوعًا من "الجنس"، حيث تتغذى على نباتات الفصيلة الباذنجانية وغيرها من العوائل النباتية من أجناس وفصائل أخرى. قمنا بتحليل طيف الميتابولوم باستخدام مطياف الكتلة الترادفي (MS/MS) واستخرجنا مؤشرات إحصائية لنظرية المعلومات لمقارنة نظريتي OD وMT. أنشأنا خرائط خصوصية للكشف عن هوية المستقلبات الرئيسية. تم توسيع نطاق التحليل ليشمل المجموعة الأصلية من نبات التبغ (N. nasi) وأنواع التبغ وثيقة الصلة به، وذلك لمزيد من تحليل التباين المشترك بين إشارات الهرمونات النباتية وتحفيز OD.
للحصول على خريطة شاملة حول مرونة وبنية الميتابولوم في أوراق نبات التبغ العاشب، استخدمنا منهجية تحليل وحساب مُطوَّرة سابقًا لجمع وتحليل طيف MS/MS عالي الدقة من مستخلصات النبات (9). تُتيح هذه الطريقة غير المُتمايزة (المُسماة MS/MS) إنشاء أطياف مركبات غير مُتكررة، والتي يُمكن استخدامها في جميع تحليلات مستوى المركبات الموصوفة هنا. تتنوع أنواع مستقلبات النبات المُحللة، حيث تتراوح بين مئات وآلاف المستقلبات (حوالي 500-1000 مستقلب/MS/MS هنا). في هذه الدراسة، نُراعي المرونة الأيضية في إطار نظرية المعلومات، ونُحدد كميًا تنوع وتخصص الميتابولوم بناءً على إنتروبيا شانون لتوزيع التردد الأيضي. باستخدام الصيغة (8) المُطبقة سابقًا، قمنا بحساب مجموعة من المؤشرات التي يمكن استخدامها لتحديد تنوع الميتابولوم (مؤشر Hj)، وتخصص الملامح الأيضية (مؤشر δj)، والخصوصية الأيضية لمستقلب واحد (مؤشر Si). بالإضافة إلى ذلك، طبقنا مؤشر اللدونة النسبية للمسافة (RDPI) لتحديد قابلية تحفيز الميتابولوم بواسطة الحيوانات العاشبة (الشكل 1أ) (30). ضمن هذا الإطار الإحصائي، نعتبر طيف MS/MS وحدة المعلومات الأساسية، ونُعالج الوفرة النسبية لـ MS/MS في خريطة توزيع التردد، ثم نستخدم إنتروبيا شانون لتقدير تنوع الميتابولوم منها. يُقاس تخصص الميتابولوم بمتوسط ​​خصوصية طيف MS/MS واحد. لذلك، فإن الزيادة في وفرة بعض فئات MS/MS بعد تحفيز الحيوانات العاشبة تتحول إلى قابلية تحفيز طيفي، وRDPI، وتخصص، أي الزيادة في مؤشر δj، نظرًا لإنتاج المزيد من المستقلبات المتخصصة وارتفاع مؤشر Si. يعكس انخفاض مؤشر تنوع Hj إما انخفاض عدد إشارات MS/MS المُولَّدة، أو تغير توزيع ترددات الملفات الشخصية في اتجاه أقل انتظامًا، مع تقليل عدم اليقين الإجمالي. ومن خلال حساب مؤشر Si، يُمكن تحديد إشارات MS/MS التي تُحفَّز بواسطة حيوانات عاشبة معينة، وعلى النقيض، تحديد إشارات MS/MS التي لا تستجيب لهذا التحفيز، وهو مؤشر رئيسي للتمييز بين تنبؤات MT وOD.
(أ) المؤشرات الإحصائية المستخدمة لبيانات مطياف الكتلة الترادفي (MS/MS) للنباتات العاشبة (من H1 إلى Hx): قابلية التحفيز (RDPI)، والتنوع (مؤشر Hj)، والتخصص (مؤشر δj)، وخصوصية المستقلبات (مؤشر Si). تشير زيادة درجة التخصص (δj) إلى زيادة إنتاج المستقلبات الخاصة بالنباتات العاشبة في المتوسط، بينما يشير انخفاض التنوع (Hj) إلى انخفاض إنتاج المستقلبات أو عدم انتظام توزيعها في خريطة التوزيع. يقيس مؤشر Si ما إذا كان المستقلب خاصًا بحالة معينة (هنا، النباتات العاشبة) أو على العكس، يبقى عند نفس المستوى. (ب) مخطط مفاهيمي لتوقع نظرية الدفاع باستخدام محور نظرية المعلومات. تتوقع نظرية OD أن هجوم النباتات العاشبة سيزيد من مستقلبات الدفاع، مما يزيد من δj. في الوقت نفسه، ينخفض ​​Hj لأن الملف الشخصي يُعاد تنظيمه نحو تقليل عدم اليقين في المعلومات الأيضية. تتنبأ نظرية MT بأن هجوم الحيوانات العاشبة سيؤدي إلى تغييرات غير موجهة في الميتابولوم، مما يزيد من Hj كمؤشر على زيادة عدم اليقين في المعلومات الأيضية ويؤدي إلى توزيع عشوائي لـ Si. كما اقترحنا نموذجًا مختلطًا، وهو أفضل نموذج MT، حيث ستزداد بعض المستقلبات ذات القيم الدفاعية العالية بشكل خاص (قيمة Si عالية)، بينما تُظهر مستقلبات أخرى استجابات عشوائية (قيمة Si منخفضة).
باستخدام مؤشرات نظرية المعلومات، نفسر نظرية OD للتنبؤ بأن التغيرات الأيضية الخاصة الناتجة عن الحيوانات العاشبة في حالة تكوينية غير محفزة ستؤدي إلى: (1) زيادة في التخصص الأيضي (مؤشر Si) مما يؤدي إلى زيادة التخصص الأيضي (مؤشر δj) (زيادة مجموعات معينة من الأيضات الخاصة ذات القيمة الدفاعية الأعلى)، و(2) انخفاض في تنوع الأيض (مؤشر Hj) نتيجة لتغير توزيع التردد الأيضي نحو توزيع أقرب إلى توزيع اللبتين. على مستوى الأيض الواحد، يُتوقع توزيع Si منتظم، حيث يزيد الأيض قيمة Si وفقًا لقيمته الدفاعية (الشكل 1ب). في هذا السياق، نفسر نظرية MT للتنبؤ بأن الإثارة ستؤدي إلى: (1) تغيرات غير اتجاهية في الأيضات مما يؤدي إلى انخفاض في مؤشر δj، و(2) زيادة في مؤشر Hj نتيجة لزيادة عدم اليقين الأيضي، أو العشوائية، والتي يمكن قياسها بواسطة إنتروبيا شانون في شكل تنوع معمّم. أما بالنسبة للتركيب الأيضي، فإن نظرية MT تتنبأ بالتوزيع العشوائي لـ Si. مع الأخذ في الاعتبار أن بعض المستقلبات تخضع لظروف محددة، بينما لا تخضع أخرى لظروف محددة، وأن قيمتها الدفاعية تعتمد على البيئة، فقد اقترحنا أيضًا نموذجًا دفاعيًا مختلطًا، حيث يتم توزيع δj وHj في اتجاهين على طول Si. يزداد Si في جميع الاتجاهات، وستزيد مجموعات معينة فقط من المستقلبات، التي لها قيم دفاعية أعلى، من Si بشكل خاص، بينما سيكون للآخرين توزيع عشوائي (الشكل 1B).
لاختبار تنبؤ نظرية الدفاع المُعاد تعريفها على محور مُعرِّف نظرية المعلومات، قمنا بتربية يرقات حشرات عاشبة متخصصة (Ms) أو عامة (Sl) على أوراق نبات نيبينثيس بالينز (الشكل 2أ). باستخدام تحليل MS/MS، استرجعنا 599 طيف MS/MS غير متكرر (ملف البيانات S1) من مستخلصات الميثانول لأنسجة الأوراق التي جُمعت بعد تغذية اليرقات. يكشف استخدام مؤشرات RDPI وHj وδj لتصوير إعادة تشكيل محتوى المعلومات في ملفات تكوين MS/MS عن أنماط مثيرة للاهتمام (الشكل 2ب). يتمثل الاتجاه العام، كما هو موضح في مُعرِّف المعلومات، في أنه مع استمرار اليرقات في تناول الأوراق، تزداد درجة إعادة التنظيم الأيضي بمرور الوقت: بعد 72 ساعة من تناول الحشرات العاشبة للأوراق، يزداد مؤشر RDPI بشكل ملحوظ. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة غير المتضررة، انخفض مستوى Hj بشكل ملحوظ، ويعزى ذلك إلى زيادة درجة تخصص الملامح الأيضية، والتي تم قياسها بواسطة مؤشر δj. يتوافق هذا الاتجاه الظاهر مع تنبؤات نظرية OD، ولكنه يتعارض مع التنبؤات الرئيسية لنظرية MT، التي تفترض أن التغيرات العشوائية (غير الموجهة) في مستويات الأيض تُستخدم كتمويه دفاعي (الشكل 1ب). على الرغم من اختلاف محتوى مُحفزات الإفراز الفموي وسلوك التغذية لدى هذين الحيوانين العاشبين، إلا أن تغذيتهما المباشرة أدت إلى تغيرات مماثلة في اتجاهات Hj وδj خلال فترتي الحصاد 24 و72 ساعة. وكان الاختلاف الوحيد عند 72 ساعة من RDPI. بالمقارنة مع ما نتج عن التغذية بواسطة Ms، كان الأيض الكلي الناتج عن التغذية بواسطة Sl أعلى.
(أ) تصميم التجربة: يتم تغذية الخنازير العاشبة العادية (S1) أو الخبيرة (Ms) بأوراق نباتات الإبريق منزوعة الملوحة، بينما في محاكاة الرعي، يُستخدم جهاز استشعار Ms (W + OSMs) للتعامل مع ثقب مواضع محددة من الأوراق. يتم تغذية S1 (W + OSSl) باليرقات أو الماء (W + W). المجموعة الضابطة (C) عبارة عن ورقة غير متضررة. (ب) تم حساب مؤشر الاستحثاث (RDPI مقارنةً بمخطط التحكم)، والتنوع (مؤشر Hj)، والتخصص (مؤشر δj) لخريطة الأيض الخاصة (599 MS/MS؛ ملف البيانات S1). تشير النجوم إلى وجود فروق معنوية بين التغذية المباشرة للخنازير العاشبة ومجموعة التحكم (اختبار t للطالب مع اختبار t المزدوج، *P<0.05 و ***P<0.001). ns، غير مهم. (ج) مؤشر الدقة الزمنية للأطياف الأيضية الرئيسية (المربع الأزرق: الأحماض الأمينية، والأحماض العضوية، والسكريات؛ ملف البيانات S2) والأطياف الأيضية الخاصة (المربع الأحمر: 443 MS/MS؛ ملف البيانات S1) بعد محاكاة معالجة التغذية على النباتات. يشير نطاق اللون إلى فاصل الثقة 95%. تشير العلامة النجمية إلى وجود فرق معنوي بين المعالجة والمجموعة الضابطة [تحليل التباين التربيعي (ANOVA)، متبوعًا باختبار توكي للفرق المعنوي الصادق (HSD) للمقارنات المتعددة اللاحقة، *P<0.05، **P<0.01، و*** P<0.001]. (د) تخصيص مخططات التشتت وملامح الأيض الخاصة (عينات متكررة بمعالجات مختلفة).
لاستكشاف ما إذا كان التغير في مستوى الأيضات الناتج عن التغذية على النباتات ينعكس في تغيرات مستوى الأيضات الفردية، ركزنا أولًا على الأيضات التي دُرست سابقًا في أوراق نبات نيبينثيس بالينز، المعروف بمقاومته المؤكدة للتغذية على النباتات. تُعدّ أميدات الفينول مركبات مترافقة من هيدروكسي سيناميد-بولي أمين، تتراكم أثناء عملية تغذية الحشرات على النباتات، ومن المعروف أنها تُقلل من كفاءة الحشرات (32). بحثنا عن سلائف أميدات الفينول باستخدام مطياف الكتلة الترادفي (MS/MS) ورسمنا منحنياتها الحركية التراكمية (الشكل S1). وكما هو متوقع، انخفضت مستويات مشتقات الفينول غير المشاركة مباشرةً في الدفاع ضد التغذية على النباتات، مثل حمض الكلوروجينيك (CGA) والروتين، بعد التغذية على النباتات. في المقابل، يمكن للحشرات أن تجعل أميدات الفينول شديدة الفعالية. أدى التغذية المستمرة للحيوانين العاشبين إلى طيف إثارة متطابق تقريبًا للفينولاميدات، وكان هذا النمط واضحًا بشكل خاص في التخليق الحيوي للفينولاميدات. وسيُلاحظ الأمر نفسه عند دراسة مسار جليكوسيدات ثنائي التربين 17-هيدروكسي جيرانيل نونانيديول (17-HGL-DTGs)، الذي يُنتج عددًا كبيرًا من ثنائي التربينات غير الحلقية ذات الوظائف الفعالة المضادة للحيوانات العاشبة (33)، والتي أدى التغذية بـ Sl إلى ظهور نمط تعبير جيني مشابه (الشكل S1).
من عيوب تجارب التغذية المباشرة للحيوانات العاشبة اختلاف معدل استهلاك الأوراق وتوقيت التغذية، مما يصعب معه التخلص من التأثيرات الخاصة بكل نوع من الحيوانات العاشبة والناتجة عن الجروح والحيوانات نفسها. ولتحسين فهمنا لتأثير نوع الحيوان العاشب على الاستجابة الأيضية للأوراق، قمنا بمحاكاة تغذية يرقات Ms وSl بتطبيق مستخلصات الأنسجة الطازجة (OSM وOSS1) مباشرةً على موضع ثقب قياسي (W) في أوراق ثابتة. تُعرف هذه العملية بمعالجة W + OS، وهي تُوحّد عملية التحفيز من خلال تحديد توقيت بدء الاستجابة بدقة دون التسبب في تأثيرات مُربكة ناتجة عن اختلاف معدل أو كمية فقدان الأنسجة (الشكل 2A) (34). باستخدام تحليل MS/MS ومنهجية الحساب، استرجعنا 443 طيف MS/MS (ملف البيانات S1)، والتي تداخلت مع الأطياف التي جُمعت سابقًا من تجارب التغذية المباشرة. أظهر تحليل نظرية المعلومات لمجموعة بيانات MS/MS هذه أن إعادة برمجة الميتابولومات المتخصصة في الأوراق عن طريق محاكاة الحيوانات العاشبة أظهرت تحفيزات خاصة بـ OS (الشكل 2C). على وجه الخصوص، بالمقارنة مع المعالجة OSS1، أدت المعالجة OSM إلى تعزيز تخصص الميتابولوم بعد 4 ساعات. تجدر الإشارة إلى أنه بالمقارنة مع مجموعة بيانات التجارب المباشرة لتغذية الحيوانات العاشبة، فإن الحركية الأيضية المصورة في فضاء ثنائي الأبعاد باستخدام Hj وδj كإحداثيات، واتجاه تخصص الميتابولوم استجابةً لمعالجة الحيوانات العاشبة المحاكاة بمرور الوقت، كانت متسقة (الشكل 2D). في الوقت نفسه، قمنا بقياس محتوى الأحماض الأمينية والأحماض العضوية والسكريات (ملف البيانات S2) للتحقق مما إذا كانت هذه الزيادة المستهدفة في تخصص الميتابولوم ناتجة عن إعادة تشكيل استقلاب الكربون المركزي استجابةً للحيوانات العاشبة المحاكاة (الشكل S2). لتوضيح هذا النمط بشكل أفضل، قمنا بمراقبة حركية التراكم الأيضي لمسارات الفينولاميد و17-HGL-DTG التي نوقشت سابقًا. يتحول التحفيز النوعي لـ OS في الحيوانات العاشبة إلى نمط إعادة ترتيب تفاضلي ضمن استقلاب الفينولاميد (الشكل S3). يتم تحفيز أميدات الفينول التي تحتوي على الكومارين وجزيئات الكافويل بشكل تفضيلي بواسطة OSS1، بينما تحفز OSMs تحفيزًا نوعيًا لمقترنات الفيروليل. بالنسبة لمسار 17-HGL-DTG، تم الكشف عن تحفيز تفاضلي لـ OS بواسطة منتجات المالونلة والداي مالونلة اللاحقة (الشكل S3).
بعد ذلك، درسنا مرونة النسخ الجيني المُستحثة بواسطة OS باستخدام مجموعة بيانات المصفوفات الدقيقة المتسلسلة زمنيًا، والتي تحاكي استخدام OSMs لمعالجة أوراق نبات الوردة في الحيوانات العاشبة. تتداخل حركية أخذ العينات بشكل أساسي مع الحركية المستخدمة في دراسة الأيض هذه (35). بالمقارنة مع إعادة تشكيل الأيض التي تزداد فيها المرونة الأيضية بشكل خاص بمرور الوقت، لاحظنا طفرات نسخ عابرة في الأوراق المُستحثة بواسطة Ms، حيث كانت قابلية تحفيز النسخ الجيني (RDPI) والتخصص (δj) عند 1 ساعة، والتنوع (Hj) عند هذه النقطة الزمنية، وانخفض تعبير BMP1 بشكل ملحوظ، تلاه استرخاء تخصص النسخ الجيني (الشكل S4). تشارك عائلات الجينات الأيضية (مثل P450، وجليكوزيل ترانسفيراز، وBAHD أسيل ترانسفيراز) في عملية تجميع مستقلبات خاصة من وحدات بنائية مشتقة من الأيض الأولي، وفقًا لنموذج التخصص العالي المبكر المذكور سابقًا. كدراسة حالة، تم تحليل مسار فينيل ألانين. أكد التحليل أن الجينات الأساسية في استقلاب فينولاميد يتم تحفيزها بشكل كبير بواسطة الإجهاد التأكسدي في الحيوانات العاشبة مقارنةً بالنباتات غير المنجذبة، وأنها متقاربة جدًا في أنماط تعبيرها. أظهر عامل النسخ MYB8 والجينات البنائية PAL1 وPAL2 وC4H و4CL في الجزء العلوي من هذا المسار بدء مبكرًا للنسخ. تُظهر أسيل ترانسفيرازات التي تلعب دورًا في التجميع النهائي للفينولاميد، مثل AT1 وDH29 وCV86، نمط تنظيم تصاعدي مطول (الشكل S4). تشير الملاحظات المذكورة أعلاه إلى أن البدء المبكر لتخصص النسخ الجيني والتحسين اللاحق لتخصص الأيض هما نمط مقترن، والذي قد يكون بسبب النظام التنظيمي المتزامن الذي يبدأ استجابة دفاعية قوية.
يُشكل إعادة تنظيم إشارات الهرمونات النباتية طبقة تنظيمية تُدمج معلومات التغذية على النباتات لإعادة برمجة وظائفها الفسيولوجية. بعد محاكاة التغذية على النباتات، قمنا بقياس الديناميكيات التراكمية لفئات الهرمونات النباتية الرئيسية، وعرضنا التعبير الزمني المشترك بينها [معامل ارتباط بيرسون (PCC) > 0.4] (الشكل 3أ). وكما هو متوقع، ترتبط الهرمونات النباتية المتعلقة بالتخليق الحيوي ضمن شبكة التعبير المشترك للهرمونات النباتية. بالإضافة إلى ذلك، تم ربط الخصوصية الأيضية (مؤشر Si) بهذه الشبكة لتسليط الضوء على الهرمونات النباتية المُحفزة بواسطة المعالجات المختلفة. وقد تم تحديد منطقتين رئيسيتين للاستجابة النوعية للتغذية على النباتات: الأولى في مجموعة JA، حيث يُظهر JA (شكله النشط بيولوجيًا JA-Ile) ومشتقات JA الأخرى أعلى قيمة Si؛ والأخرى هي الإيثيلين (ET). أظهر الجبريلين زيادة طفيفة فقط في خصوصية الاستجابة تجاه الحيوانات العاشبة، بينما أظهرت هرمونات نباتية أخرى، مثل السيتوكينين والأوكسين وحمض الأبسيسيك، خصوصية تحفيز منخفضة تجاه هذه الحيوانات. بالمقارنة مع استخدام W + W وحده، يمكن تحويل تضخيم القيمة القصوى لمشتقات حمض الجاسمونيك من خلال تطبيق OS (W + OS) إلى مؤشر قوي ومحدد لحمض الجاسمونيك. ومن المثير للدهشة أن OSM وOSS1، بمحتواهما المختلف من المحفزات، معروفان بتسببهما في تراكم مماثل لحمض الجاسمونيك وJA-Ile. وعلى عكس OSS1، يتم تحفيز OSM بشكل خاص وقوي بواسطة OSMs، بينما لا يُضخّم OSS1 استجابة الجروح القاعدية (الشكل 3ب).
(أ) تحليل شبكة التعبير المشترك بناءً على حساب معامل ارتباط بيرسون (PCC) لمحاكاة حركية تراكم الهرمونات النباتية المحفزة بواسطة الحيوانات العاشبة. تمثل العقدة هرمونًا نباتيًا واحدًا، ويمثل حجمها مؤشر Si الخاص بهذا الهرمون بين المعاملات. (ب) تراكم حمض الجاسمونيك (JA) وحمض الجاسمونيك-إيزولوسين (JA-Ile) والإيثيلين (ET) في الأوراق نتيجةً لمعاملات مختلفة، موضحة بألوان مختلفة: المشمشي، W + OSM؛ الأزرق، W + OSSl؛ الأسود، W + W؛ الرمادي، C (مجموعة التحكم). تشير النجوم إلى وجود فروق دالة إحصائيًا بين المعاملة ومجموعة التحكم (تحليل التباين ثنائي الاتجاه متبوعًا باختبار توكي للمقارنات المتعددة اللاحقة، *** P < 0.001). تحليل نظرية المعلومات لـ (C)697 MS/MS (ملف البيانات S1) في التخليق الحيوي لحمض الجاسمونيك وطيف الإدراك المتضرر (irAOC و irCOI1) و (D)585 MS/MS (ملف البيانات S1) في ETR1 مع إشارة ET المتضررة. تم تحفيز سلالات نباتية ونباتات تحكم (EV) بمعالجتين محاكاة للحيوانات العاشبة. تشير النجوم إلى وجود فروق معنوية بين المعالجة W+OS والتحكم غير المتضرر (تحليل التباين ثنائي الاتجاه متبوعًا باختبار Tukey HSD للمقارنات المتعددة اللاحقة، *P<0.05، **P<0.01 و ***P<0.001). (E) رسوم بيانية مبعثرة لمعارضة التخصص. تمثل الألوان سلالات معدلة وراثيًا مختلفة؛ وتمثل الرموز طرق معالجة مختلفة: مثلث، W + OSS1؛ مستطيل، W + OSM؛ دائرة C
بعد ذلك، استخدمنا سلالة معدلة وراثيًا من نبات الإبريق المضعف (irCOI1 وsETR1) في الخطوات الرئيسية لتخليق حمض الجاسمونيك (JA) والإيثيلين (ET) (irAOC وirACO) واستقبالهما (irCOI1 وsETR1) لتحليل استقلاب هذين الهرمونين النباتيين على الحيوانات العاشبة، والمساهمة النسبية لإعادة البرمجة. وتماشيًا مع التجارب السابقة، أكدنا تحفيز استجابة الحيوانات العاشبة في النباتات الحاملة الفارغة (EV) (الشكل 3، من C إلى D) والانخفاض العام في مؤشر Hj الناتج عن OSM، بينما ازداد مؤشر δj. وكانت الاستجابة أكثر وضوحًا من الاستجابة التي أثارها OSS1. ويُظهر رسم بياني ثنائي الخطوط، باستخدام Hj وδj كإحداثيات، الخلل التنظيمي المحدد (الشكل 3E). ويتمثل الاتجاه الأبرز في أنه في السلالات التي تفتقر إلى إشارة حمض الجاسمونيك، يتم القضاء تقريبًا على تنوع الميتابولوم وتغيرات التخصص الناتجة عن الحيوانات العاشبة (الشكل 3C). على النقيض من ذلك، فإن إدراك الإيثيلين الصامت في نباتات sETR1، على الرغم من أن تأثيره الإجمالي على تغيرات استقلاب الحيوانات العاشبة أقل بكثير من تأثير إشارات حمض الجاسمونيك، يُخفف من الفرق في مؤشري Hj وδj بين تحفيزات OSM وOSS1 (الشكل 3D والشكل S5). يشير هذا إلى أنه بالإضافة إلى الوظيفة الأساسية لنقل إشارات حمض الجاسمونيك، فإن نقل إشارات الإيثيلين يعمل أيضًا كآلية ضبط دقيق للاستجابة الأيضية الخاصة بكل نوع من الحيوانات العاشبة. وتماشيًا مع وظيفة الضبط الدقيق هذه، لم يطرأ أي تغيير على قابلية تحفيز الميتابولوم الإجمالية في نباتات sETR1. من ناحية أخرى، بالمقارنة مع نباتات sETR1، حثّت نباتات irACO سعات إجمالية مماثلة للتغيرات الأيضية الناتجة عن الحيوانات العاشبة، ولكنها أظهرت درجات Hj وδj مختلفة بشكل ملحوظ بين تحديات OSM وOSS1 (الشكل S5).
بهدف تحديد المستقلبات المتخصصة التي تُسهم بشكلٍ كبير في استجابة الحيوانات العاشبة النوعية، وضبط إنتاجها بدقة عبر إشارات ET، استخدمنا طريقة MS/MS الهيكلية المطورة سابقًا. تعتمد هذه الطريقة على أسلوب التجميع الثنائي لإعادة استنتاج العائلة الأيضية من شظايا MS/MS [الناتج النقطي المُعَيَّر (NDP)] ودرجة التشابه القائمة على الفقد المحايد (NL). أنتجت مجموعة بيانات MS/MS المُنشأة من خلال تحليل السلالات المُعدلة وراثيًا ET، 585 شظية MS/MS (ملف البيانات S1)، والتي تم تحليلها بتجميعها في سبع وحدات MS/MS رئيسية (M) (الشكل 4A). بعض هذه الوحدات مكتظة بمستقلبات خاصة سبق توصيفها: على سبيل المثال، الوحدات M1 وM2 وM3 وM4 وM7 غنية بمشتقات الفينول المختلفة (M1)، وجليكوسيدات الفلافونويد (M2)، وسكريات الأسيل (M3 وM4)، و17-HGL-DTG (M7). بالإضافة إلى ذلك، تُحسب المعلومات الأيضية النوعية (مؤشر Si) لمستقلب واحد في كل وحدة، ويمكن ملاحظة توزيع Si الخاص به بشكل بديهي. باختصار، تتميز أطياف MS/MS التي تُظهر خصوصية عالية تجاه التغذية على النباتات والنمط الجيني بقيم Si عالية، وتشير إحصائيات التفرطح إلى توزيع الفراء في الزاوية اليمنى للذيل. تم الكشف عن أحد هذه التوزيعات الغروية النحيلة في الوحدة M1، حيث أظهر فينول أميد أعلى نسبة Si (الشكل 4ب). أظهر 17-HGL-DTG المُحفز بالتغذية على النباتات، والذي ذُكر سابقًا في الوحدة M7، درجة Si متوسطة، مما يشير إلى درجة متوسطة من التنظيم التفاضلي بين نوعي OS. في المقابل، تُعد معظم المستقلبات المتخصصة المنتجة بشكل دائم، مثل الروتين وCGA وسكريات الأسيل، من بين أدنى درجات Si. من أجل استكشاف التعقيد الهيكلي وتوزيع Si بين المستقلبات الخاصة بشكل أفضل، تم إنشاء شبكة جزيئية لكل وحدة (الشكل 4ب). من أهم تنبؤات نظرية OD (المُلخصة في الشكل 1ب) أن إعادة تنظيم المستقلبات الخاصة بعد التغذية على النباتات يجب أن تؤدي إلى تغييرات أحادية الاتجاه في المستقلبات ذات القيمة الدفاعية العالية، لا سيما من خلال زيادة تخصصها (بدلاً من التوزيع العشوائي). المستقلب الدفاعي المتوقع وفقًا لنظرية MT. ترتبط معظم مشتقات الفينول المتراكمة في M1 وظيفيًا بانخفاض أداء الحشرات (32). عند مقارنة قيم Si في مستقلبات M1 بين الأوراق المُحفزة والأوراق المكونة لنباتات التحكم EV بعد 24 ساعة، لاحظنا أن التخصص الأيضي للعديد من المستقلبات بعد تغذية الحشرات على النباتات له اتجاه تصاعدي ملحوظ (الشكل 4ج). تم رصد الزيادة المحددة في قيمة Si فقط في فينولاميدات الدفاعية، ولكن لم يتم رصد أي زيادة في قيمة Si في الفينولات الأخرى والمستقلبات غير المعروفة الموجودة في هذه الوحدة. هذا نموذج متخصص، يرتبط بنظرية OD. وتتفق التنبؤات الرئيسية للتغيرات الأيضية الناتجة عن التغذية على النباتات مع هذا النموذج. لاختبار ما إذا كانت هذه الخصوصية في طيف الفينولاميد ناتجة عن نقل الإلكترون النوعي لـ OS، قمنا برسم مؤشر Si للمستقلبات، مما أدى إلى قيمة تعبير تفاضلي بين OSM وOSS1 في النمطين الوراثيين EV وsETR1 (الشكل 4D). في sETR1، انخفض الفرق الناتج عن الفينولاميد بين OSM وOSS1 بشكل كبير. كما طُبقت طريقة التجميع الثنائي على بيانات MS/MS التي جُمعت من سلالات ذات مستويات غير كافية من JA لاستنتاج وحدات MS/MS الرئيسية المتعلقة بالتخصص الأيضي المنظم بواسطة JA (الشكل S6).
(أ) تُظهر نتائج تجميع 585 عينة من سلسلة MS/MS، بناءً على تشابه الشظايا المشتركة (تشابه NDP) وفقدان الجزيئات المحايدة المشتركة (تشابه NL)، أن الوحدة (M) تتوافق مع عائلة المركبات المعروفة، أو مع تركيب مستقلبات غير معروفة أو ضعيفة الاستقلاب. ويُعرض بجانب كل وحدة توزيع المستقلبات (MS/MS) النوعي (Si). (ب) الشبكة الجزيئية المعيارية: تمثل العقد سلاسل MS/MS، والحواف تمثل درجات NDP (باللون الأحمر) وNL (باللون الأزرق) لسلاسل MS/MS (الحد الأدنى > 0.6). ويُظهر الشكل مؤشر نوعية المستقلبات المتدرج (Si) مُلونًا بناءً على الوحدة (يسارًا) ومُسقطًا على الشبكة الجزيئية (يمينًا). (ج) الوحدة M1 لنبات EV في الحالة التكوينية (التحكم) والحالة المُستحثة (محاكاة حيوان عاشب) بعد 24 ساعة: مخطط الشبكة الجزيئية (قيمة Si هي حجم العقدة، ويُبرز الفينولاميد الدفاعي باللون الأزرق). (د) مخطط الشبكة الجزيئية M1 لخط الطيف sETR1 مع ضعف إدراك EV وET: المركب الفينولي ممثل بعقدة الدائرة الخضراء، والفرق المعنوي (قيمة P) بين المعالجتين W + OSM وW + OSS1 كحجم للعقدة. CP، N-كافويل-تيروسين؛ CS، N-كافويل-سبيرميدين؛ FP، N-إستر حمض الفيروليك-حمض اليوريك؛ FS، N-فيروليل-سبيرميدين؛ CoP، N'، N'-كوماروليل-تيروسين؛ DCS، N'، N''-ثنائي كافويل-سبيرميدين؛ CFS، N'، N''-كافويل، فيروليل-سبيرميدين؛ Lycium barbarum في ثمار العوسج؛ Nick. O-AS، سكر O-أسيل.
قمنا بتوسيع نطاق التحليل من نمط وراثي واحد مُضعف من نبات الإبريق (Nepenthes) إلى تجمعات طبيعية، حيث وُصفت سابقًا تغيرات قوية داخل النوع الواحد في مستويات حمض الجاسمونيك (JA) ومستويات مستقلبات محددة في التجمعات الطبيعية (26). استخدمنا هذه البيانات لتغطية 43 مجموعة وراثية. تتكون هذه المجموعات الوراثية من 123 نوعًا من نباتات الإبريق (N. pallens). جُمعت هذه النباتات من بذور من بيئات طبيعية مختلفة في ولايات يوتا ونيفادا وأريزونا وكاليفورنيا (الشكل S7). حسبنا تنوع الميتابولوم (المسمى هنا بتنوع بيتا على مستوى التجمع) والتخصص الناتج عن التعرض للعوامل البيئية. تماشيًا مع الدراسات السابقة، لاحظنا نطاقًا واسعًا من التغيرات الأيضية على طول محوري Hj وδj، مما يشير إلى وجود اختلافات كبيرة بين المجموعات الوراثية في مرونة استجاباتها الأيضية للحيوانات العاشبة (الشكل S7). يُذكّر هذا التنظيم بالملاحظات السابقة حول النطاق الديناميكي لتغيرات حمض الجاسمونيك (JA) الناتجة عن الحيوانات العاشبة، وقد حافظ على قيمة عالية جدًا في مجموعة سكانية واحدة (26، 36). وباستخدام حمض الجاسمونيك (JA) وحمض الجاسمونيك-إيزولوسين (JA-Ile) لاختبار الارتباط العام بين Hj وδj، وجدنا ارتباطًا إيجابيًا قويًا بين حمض الجاسمونيك ومؤشر التنوع والتخصص في الميتابولوم (الشكل S7). يشير هذا إلى أن عدم التجانس الناتج عن الحيوانات العاشبة في تحفيز حمض الجاسمونيك، والذي تم رصده على مستوى المجموعة السكانية، قد يكون ناتجًا عن تعدد الأشكال الأيضية الرئيسية الناجمة عن الانتقاء من الحشرات العاشبة.
أظهرت دراسات سابقة أن أنواع التبغ تختلف اختلافًا كبيرًا في نوعها واعتمادها النسبي على آليات الدفاع الأيضية المُستحثة والتكوينية. ويُعتقد أن هذه التغيرات في نقل الإشارات المضادة للحيوانات العاشبة وقدرات الدفاع تُنظَّم بفعل ضغط أعداد الحشرات، ودورة حياة النبات، وتكاليف إنتاج الدفاع في البيئة التي ينمو فيها نوع معين. درسنا مدى اتساق إعادة تشكيل الميتابولوم الورقي المُستحث بواسطة الحيوانات العاشبة لستة أنواع من نباتات التبغ (Nicotiana) الأصلية في أمريكا الشمالية والجنوبية. ترتبط هذه الأنواع ارتباطًا وثيقًا بنباتات الإبريق (Nepenthes) في أمريكا الشمالية، وهي: Nicolas Bociflo. La، وN. nicotinis، وNicotiana n. attenuated grass، وNicotiana tabacum، والتبغ الخطي، والتبغ (Nicotiana spegazzinii)، وتبغ أوراق التبغ (Nicotiana obtusifolia) (الشكل 5أ) (37). ستة من هذه الأنواع، بما فيها النوع المعروف جيدًا N. please، هي نباتات حولية من شعبة البتونيا، بينما يُعدّ النوع obtusifolia N. من النباتات المعمرة من الشعبة الشقيقة Trigonophyllae (38). بعد ذلك، أُجريت تجارب تحفيزية باستخدام W + W و W + OSM و W + OSS1 على هذه الأنواع السبعة لدراسة إعادة تنظيم التمثيل الغذائي على مستوى الأنواع فيما يتعلق بتغذية الحشرات.
(أ) شجرة تطورية مبنية على طريقة بوتستراب، تعتمد على أقصى احتمال [لتخليق الجلوتامين النووي (38)] والتوزيع الجغرافي لسبعة أنواع وثيقة الصلة من نبات التبغ (ألوان مختلفة) (37). (ب) مخطط انتشار للتنوع المتخصص للملامح الأيضية لسبعة أنواع من نبات التبغ (939 MS/MS؛ ملف البيانات S1). على مستوى الأنواع، يرتبط تنوع الميتابولوم عكسيًا بدرجة التخصص. يوضح الشكل 2، S9، تحليل الارتباط على مستوى الأنواع بين التنوع الأيضي والتخصص وتراكم حمض الجاسمونيك. اللون: أنواع مختلفة؛ المثلث: W + OSS1؛ المستطيل: W + OSM. (ج) تم تصنيف ديناميكيات حمض الجاسمونيك وحمض الجاسمونيك-إيزولوسين في نبات التبغ وفقًا لسعة إثارة OS (تحليل التباين ثنائي الاتجاه واختبار توكي HSD للمقارنة المتعددة اللاحقة، * P < 0.05، ** P < 0.01، و** للمقارنة بين W + OS وW + W، P < 0.001). مخطط الصندوق والشارب لتنوع (د) وتخصص (هـ) كل نوع بعد محاكاة التغذية على الأعشاب وميثيل جاسمونات (MeJA). تشير النجمة إلى وجود فرق معنوي بين W + OS و W + W أو اللانولين مع W (Lan + W) أو اللانولين مع MeJA (Lan + MeJa) ومجموعة التحكم Lan (تحليل التباين ثنائي الاتجاه، متبوعًا باختبار Tukey's HSD للمقارنات المتعددة اللاحقة، *P<0.05، **P<0.01 و ***P<0.001).
باستخدام طريقة التجميع المزدوج، حددنا 9 وحدات من أصل 939 وحدة MS/MS (ملف البيانات S1). يتباين تركيب وحدات MS/MS المُعاد تشكيلها بفعل المعالجات المختلفة تبايناً كبيراً بين الوحدات المختلفة بين الأنواع (الشكل S8). يُظهر تصوير Hj (المشار إليه هنا بتنوع غاما على مستوى الأنواع) وδj أن الأنواع المختلفة تتجمع في مجموعات شديدة التباين في الفضاء الأيضي، حيث يكون التقسيم على مستوى الأنواع عادةً أكثر وضوحاً من التحفيز. باستثناء N. linear وN. obliquus، تُظهر هذه الأنواع نطاقاً ديناميكياً واسعاً من تأثيرات التحفيز (الشكل 5B). في المقابل، تُظهر أنواع مثل N. purpurea وN. obtusifolia استجابة أيضية أقل وضوحاً للمعالجة، لكن الميتابولوم فيها أكثر تنوعاً. أدى التوزيع الخاص بالأنواع للاستجابة الأيضية المُحفزة إلى وجود ارتباط سلبي كبير بين التخصص وتنوع غاما (PCC = -0.46، P = 4.9×10-8). ترتبط التغيرات في مستويات حمض الجاسمونيك (JA) الناتجة عن الإجهاد التأكسدي ارتباطًا إيجابيًا بتخصص الميتابولوم، وارتباطًا سلبيًا بتنوع جاما الأيضي الذي تُظهره كل فصيلة (الشكل 5ب والشكل S9). تجدر الإشارة إلى أن الفصائل التي يُشار إليها عادةً باسم "فصائل الاستجابة للإشارة" في الشكل 5ج، مثل ديدان نيبينثس، ونيبينثس نيبينثس، ونيبينثس الحاد، ونيبينثس المضعف، أظهرت علامات واضحة بعد 30 دقيقة. وقد لوحظت مؤخرًا حالات تفشٍّ خاصة بحمض الجاسمونيك (JA) وحمض الجاسمونيك-إيزولوسين (JA-Ile) نتيجةً للإجهاد التأكسدي، بينما أظهرت بكتيريا أخرى تُسمى "غير مستجيبة للإشارة"، مثل نيبينثس ميلز، ونيبينثس المسحوق، ونيبينثس أوبتوسيفوليا، تحفيزًا لحمض الجاسمونيك-إيزولوسين (JA-Ile Edge) فقط دون أي خصوصية للإجهاد التأكسدي (الشكل 5ج). على المستوى الأيضي، وكما ذُكر سابقًا، بالنسبة لنيبينثس المضعف، أظهرت المواد المستجيبة للإشارة خصوصية للإجهاد التأكسدي وزادت بشكل ملحوظ من δj، بينما قللت من Hj. لم يُرصد هذا التأثير التحفيزي الخاص بالجسيمات العضوية في الأنواع المصنفة كأنواع غير متفاعلة مع الإشارة (الشكل 5، D وE). تتشارك المستقلبات الخاصة بالجسيمات العضوية بشكل متكرر بين الأنواع المستجيبة للإشارة، وتتجمع هذه المجموعات الإشارية مع الأنواع ذات الاستجابات الإشارية الأضعف، بينما تُظهر الأنواع ذات الاستجابات الإشارية الأضعف ترابطًا أقل (الشكل S8). تشير هذه النتيجة إلى أن التحفيز الخاص بالجسيمات العضوية لحمض الجاسمونيك وإعادة تشكيل الميتابولوم اللاحق الخاص بالجسيمات العضوية مرتبطان على مستوى النوع.
بعد ذلك، استخدمنا معجون اللانولين المحتوي على ميثيل حمض الجاسمونيك (MeJA) لمعالجة النباتات لدراسة ما إذا كانت أنماط الاقتران هذه مقيدة بتوافر حمض الجاسمونيك المُضاف خارجيًا، والذي يتواجد في سيتوبلازم النباتات. يُعدّ نزع الإستر السريع من حمض الجاسمونيك عمليةً حيوية. وجدنا نفس الاتجاه للتغير التدريجي من الأنواع المستجيبة للإشارات إلى الأنواع غير المستجيبة لها، والناجم عن الإمداد المستمر بحمض الجاسمونيك (الشكل 5، D وE). باختصار، أعادت معالجة MeJA برمجة الميتابولوم للديدان الخيطية الخطية، N. obliquus وN. aquaticus وN. pallens وN. mikimotoi، بشكلٍ كبير، مما أدى إلى زيادة ملحوظة في δj وانخفاض في Hj. أظهرت N. purpurea زيادةً في δj فقط، دون Hj. كما أن N. obtusifolia، التي سبق أن ثبت تراكمها لمستويات منخفضة للغاية من حمض الجاسمونيك، تستجيب بشكلٍ ضعيف لمعالجة MeJA من حيث إعادة تشكيل الميتابولوم. تشير هذه النتائج إلى أن إنتاج حمض الجاسمونيك أو نقل الإشارة مقيد فسيولوجيًا في الأنواع غير المستجيبة للإشارات. ولاختبار هذه الفرضية، درسنا أربعة أنواع (N. pallens، وN. mills، وN. pink، وN. microphylla) مُحفزة بواسطة W + W، وW + OSMs، وW + OSS1 Transcriptome (39). وتماشيًا مع نمط إعادة تشكيل الميتابولوم، فإن الأنواع منفصلة جيدًا في فضاء النسخ الجيني، حيث أظهر N. attenuated أعلى معدل RDPI مُحفز بواسطة OS، بينما كان لدى N. gracilis أدنى معدل (الشكل 6A). ومع ذلك، وُجد أن تنوع النسخ الجيني المُحفز بواسطة N. oblonga كان الأدنى بين الأنواع الأربعة، على عكس أعلى تنوع ميتابولومي لـ N. oblonga الذي سبق إظهاره في سبعة أنواع. وقد أظهرت دراسات سابقة أن مجموعة من الجينات المرتبطة بإشارات الدفاع المبكرة، بما في ذلك إشارات حمض الجاسمونيك، تُفسر خصوصية استجابات الدفاع المبكرة المُحفزة بواسطة مُحفزات مرتبطة بالحيوانات العاشبة في أنواع Nicotiana (39). أظهرت مقارنة مسارات إشارات حمض الجاسمونيك بين هذه الأنواع الأربعة نمطًا مثيرًا للاهتمام (الشكل 6ب). فقد أظهرت معظم الجينات في هذا المسار، مثل AOC وOPR3 وACX وCOI1، مستويات تحفيز عالية نسبيًا في هذه الأنواع الأربعة. مع ذلك، فإن جينًا رئيسيًا، JAR4، يحول حمض الجاسمونيك إلى شكله النشط بيولوجيًا JA-Ile، تتراكم نسخه، ومستوى نسخه منخفض جدًا، لا سيما في أنواع N. mills وNepenthes pieris وN. microphylla. إضافةً إلى ذلك، لم يُرصد نسخ جين آخر، وهو AOS، في N. bifidum. قد تكون هذه التغيرات في التعبير الجيني مسؤولة عن الأنماط الظاهرية المتطرفة الناتجة عن انخفاض إنتاج حمض الجاسمونيك في الأنواع غير المستجيبة للإشارات، وعن تحفيز N. gracilis.
(أ) تحليل نظرية المعلومات لإعادة برمجة الاستجابات النسخية المبكرة لأربعة أنواع من التبغ وثيقة الصلة، تم أخذ عينات منها بعد 30 دقيقة من تحفيز التغذية على النبات. تم حساب مؤشر RDPI بمقارنة الأوراق المحفزة بواسطة OS مع عينة التحكم (الجرح). تشير الألوان إلى الأنواع المختلفة، وتشير الرموز إلى طرق المعالجة المختلفة. (ب) تحليل التعبير الجيني في مسارات إشارات حمض الجاسمونيك (JA) بين الأنواع الأربعة. يظهر مسار JA المبسط بجوار مخطط الصندوق. تشير الألوان المختلفة إلى طرق معالجة مختلفة. تشير النجمة إلى وجود فرق معنوي بين المعالجة W + OS وعينة التحكم W + W (لاختبار t للطالب للفروق الزوجية، *P<0.05، **P<0.01، و***P<0.001). OPDA: حمض 12-أوكسوفيتودينويك؛ OPC-8: حمض 0,3-أوكسو-2(2′(Z)-بنتينيل)-سيكلوبنتان-1-أوكتانويك.
في الجزء الأخير، درسنا كيف يمكن لإعادة تشكيل الميتابولوم الخاصة بأنواع الحشرات في أنواع نباتية مختلفة أن تُكسبها مقاومةً للحشرات العاشبة. ركزت الأبحاث السابقة على جنس التبغ (Nicotiana)، حيث تختلف مقاومته للحشرات العاشبة واليرقات اختلافًا كبيرًا (40). في هذه الدراسة، بحثنا العلاقة بين هذا النموذج ومرونته الأيضية. باستخدام أنواع التبغ الأربعة المذكورة أعلاه، واختبار العلاقة بين تنوع الميتابولوم وتخصصه الناتج عن الحشرات العاشبة ومقاومة النباتات للحشرات العاشبة واليرقات، وجدنا أن المقاومة والتنوع والتخصص للحشرة العامة (اليرقات) جميعها مرتبطة ارتباطًا إيجابيًا، بينما العلاقة بين المقاومة لليرقات المتخصصة والتخصص ضعيفة، والعلاقة مع التنوع غير ذات دلالة إحصائية (الشكل S10). فيما يتعلق بمقاومة اليرقات، أظهر كل من نوعي التبغ المُضعف (N. chinensis) و(N. gracilis)، اللذين سبق أن أظهرا مستويات نقل إشارة حمض الجاسمونيك ومرونة الميتابولوم، استجابات مختلفة تمامًا لتحفيز الحشرات العاشبة، كما أظهرا مقاومة عالية مماثلة.
على مدى الستين عامًا الماضية، وفرت نظرية الدفاع النباتي إطارًا نظريًا، استند إليه الباحثون في التنبؤ بعدد كبير من تطورات ووظائف المستقلبات النباتية المتخصصة. لا تتبع معظم هذه النظريات الإجراء المعتاد للاستدلالات القوية (41). فهي تقترح تنبؤات رئيسية (3) على نفس مستوى التحليل. وعندما يسمح اختبار هذه التنبؤات الرئيسية بتحليل نظريات محددة، فإن ذلك سيؤدي إلى تقدم المجال. بدلًا من ذلك، تقدم النظرية الجديدة تنبؤات على مستويات تحليل مختلفة، وتضيف طبقة جديدة من الاعتبارات الوصفية (42). ومع ذلك، يمكن تفسير النظريتين المقترحتين على المستوى الوظيفي، وهما نظرية MT ونظرية OD، بسهولة على أنهما تنبؤات مهمة للتغيرات الأيضية المتخصصة التي تسببها الحيوانات العاشبة: إذ ترى نظرية OD أن التغيرات في "الفضاء" الأيضي المتخصص ذات اتجاهية عالية. بينما ترى نظرية MT أن هذه التغيرات ستكون غير اتجاهية وموجودة عشوائيًا في الفضاء الأيضي، وتميل إلى إنتاج مستقلبات ذات قيمة دفاعية عالية. تم اختبار الدراسات السابقة لتوقعات OD وMT باستخدام مجموعة محدودة من المركبات "الدفاعية" المحددة مسبقًا. هذه الاختبارات التي تركز على المستقلبات تحول دون تحليل مدى ومسار إعادة تشكيل الميتابولوم أثناء التغذية على النباتات، ولا تسمح بالاختبار ضمن إطار إحصائي متسق يتطلب توقعات رئيسية يمكن اعتبارها ككل. قياس التغيرات في ميتابولوم النبات. هنا، استخدمنا تقنية مبتكرة في علم الميتابولوميات تعتمد على مطياف الكتلة الحاسوبي، وأجرينا تحليلًا لفك التشفير باستخدام معايير نظرية المعلومات لاختبار التمييز بين التوقعين المقترحين على مستوى الميتابولوميات العالمي. وقد طُبقت نظرية المعلومات في العديد من المجالات، لا سيما في سياق أبحاث التنوع البيولوجي وتدفق المغذيات (43). ومع ذلك، على حد علمنا، هذا هو التطبيق الأول المستخدم لوصف فضاء المعلومات الأيضية للنباتات وحل المشكلات البيئية المتعلقة بالتغيرات الأيضية المؤقتة استجابةً للمؤثرات البيئية. تكمن قدرة هذه الطريقة، على وجه الخصوص، في إمكانية مقارنة الأنماط داخل الأنواع النباتية وفيما بينها لدراسة كيفية تطور الحيوانات العاشبة من أنواع مختلفة إلى أنماط تطورية كلية بين الأنواع على مستويات تطورية مختلفة. الأيض.
يحوّل تحليل المكونات الرئيسية (PCA) مجموعة بيانات متعددة المتغيرات إلى فضاء ذي أبعاد منخفضة، مما يسمح بتفسير الاتجاه الرئيسي للبيانات. ولذلك، يُستخدم عادةً كتقنية استكشافية لتحليل البيانات، مثل تحليل الميتابولوم. مع ذلك، يؤدي تقليل الأبعاد إلى فقدان جزء من المعلومات في مجموعة البيانات، ولا يستطيع تحليل المكونات الرئيسية توفير معلومات كمية حول الخصائص ذات الصلة بنظرية علم البيئة، مثل: كيف تُعيد الحيوانات العاشبة تشكيل التنوع في مجالات متخصصة (مثل الثراء والتوزيع والوفرة) من خلال تحليل الأيض؟ ما هي الأيضات التي تُنبئ بالحالة المُستحثة لحيوان عاشب معين؟ من منظور التخصص والتنوع والتحفيز، تم تحليل محتوى المعلومات الخاص بملف الأيض في أوراق النبات، ووُجد أن تناول الحيوانات العاشبة للنباتات يُمكن أن يُنشط عمليات أيضية محددة. لاحظنا، على نحو غير متوقع، أنه كما هو موضح في مؤشرات نظرية المعلومات المُطبقة، تتداخل الحالة الأيضية الناتجة بشكل كبير بعد هجمات نوعين من الحيوانات العاشبة (الحيوان العام Sl الذي يتغذى ليلاً) والنبات الخبير في الفصيلة الباذنجانية Ms، على الرغم من اختلاف سلوك التغذية وتركيزها بشكل ملحوظ. يُعد مُركب الأحماض الدهنية والأحماض الأمينية (FAC) مُحفزًا رئيسيًا في OS (31). وباستخدام OS المُحاكي للحيوانات العاشبة لمعالجة جروح الثقب المعيارية، أظهرت المعالجة المُحاكاة للحيوانات العاشبة اتجاهًا مشابهًا. يُزيل هذا الإجراء المعياري لمحاكاة استجابة النباتات لهجمات الحيوانات العاشبة العوامل المُربكة الناتجة عن التغيرات في سلوك التغذية لدى الحيوانات العاشبة، والتي تؤدي إلى درجات متفاوتة من الضرر في أوقات مختلفة (34). يُقلل مُركب الأحماض الدهنية والأحماض الأمينية (FAC)، المعروف بأنه السبب الرئيسي لـ OSM، من استجابات JAS وهرمونات نباتية أخرى في OSS1، بينما يُقلل OSS1 من هذه الاستجابات مئات المرات (31). ومع ذلك، تسبب OSS1 في مستويات مماثلة من تراكم JA مقارنةً بـ OSM. لقد ثبت سابقًا أن استجابة حمض الجاسمونيك في نباتات الإبريق الضعيفة حساسة للغاية لمركب OSM، حيث يمكن لمركب FAC الحفاظ على فعاليته حتى عند تخفيفه بنسبة 1:1000 بالماء (44). لذلك، بالمقارنة مع مركب OSM، على الرغم من أن تركيز مركب FAC في نبات OSS1 منخفض جدًا، إلا أنه كافٍ لتحفيز إفراز كمية كافية من حمض الجاسمونيك. وقد أظهرت دراسات سابقة أن البروتينات الشبيهة بالبورين (45) والسكريات قليلة التعدد (46) يمكن استخدامها كمؤشرات جزيئية لتحفيز استجابات الدفاع النباتية في نبات OSS1. ومع ذلك، لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت هذه المحفزات في نبات OSS1 مسؤولة عن تراكم حمض الجاسمونيك الملاحظ في هذه الدراسة.
على الرغم من قلة الدراسات التي تصف البصمات الأيضية التفاضلية الناتجة عن استخدام أنواع مختلفة من الحيوانات العاشبة أو حمض الجاسمونيك (JA) أو حمض الساليسيليك (SA) الخارجي (47)، لم يسبق لأحد أن درس تأثير اضطراب نوع الحيوان العاشب على شبكة نبات العشب وتأثيراته على المعلومات الشخصية المحددة. وقد أكد هذا التحليل كذلك أن ارتباط شبكة الهرمونات الداخلية بهرمونات نباتية أخرى غير حمض الجاسمونيك يُحدد خصوصية إعادة التنظيم الأيضي الناجم عن الحيوانات العاشبة. وعلى وجه الخصوص، لاحظنا أن الإيثيلين الناتج عن OSM كان أكبر بكثير من ذلك الناتج عن OSS1. ويتوافق هذا النمط مع زيادة محتوى FAC في OSM، وهو شرط ضروري وكافٍ لتحفيز طفرة الإيثيلين (48). وفي سياق التفاعل بين النباتات والحيوانات العاشبة، لا تزال وظيفة الإشارة للإيثيلين على ديناميكيات الأيض الخاصة بالنباتات متقطعة وتستهدف مجموعة مركبات واحدة فقط. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت معظم الدراسات تطبيقًا خارجيًا للإيثيلين أو سلائفه أو مثبطات مختلفة لدراسة تنظيم الإيثيلين، ومن بين هذه التطبيقات الكيميائية الخارجية، ينتج عن هذه التطبيقات العديد من الآثار الجانبية غير المحددة. على حد علمنا، تمثل هذه الدراسة أول فحص منهجي واسع النطاق لدور الإيثيلين في استخدامه لإنتاج نباتات معدلة وراثيًا ذات قدرة على الإدراك، وذلك لتنسيق ديناميكيات الأيض النباتي. يمكن لتحفيز الإيثيلين الخاص بالحيوانات العاشبة أن يعدل في نهاية المطاف استجابة الأيض. والأهم من ذلك هو التلاعب المعدل وراثيًا بجينات التخليق الحيوي للإيثيلين (ACO) والإدراك (ETR1)، والذي كشف عن تراكم الفينولاميدات من جديد بشكل خاص بالحيوانات العاشبة. وقد ثبت سابقًا أن الإيثيلين يمكنه ضبط تراكم النيكوتين الناتج عن حمض الجاسمونيك بدقة عن طريق تنظيم إنزيم ناقل ميثيل البوترسين (49). ومع ذلك، من وجهة نظر ميكانيكية، ليس من الواضح كيف يضبط الإيثيلين بدقة تحفيز الفيناميد. إضافةً إلى وظيفة نقل الإشارة لـ ET، يمكن أيضًا توجيه التدفق الأيضي إلى S-أدينوزيل-1-ميثيونين لتنظيم الاستثمار في بولي أمينوفينول أميدات. يُعد S-أدينوزيل-1-ميثيونين ET وسيطًا شائعًا في مسار التخليق الحيوي للبولي أمينات. ولا تزال آلية تنظيم إشارة ET لمستوى الفينول أميد بحاجة إلى مزيد من الدراسة.
لفترة طويلة، ونظرًا للعدد الكبير من المستقلبات المتخصصة ذات البنية غير المعروفة، لم يُفلح التركيز المكثف على فئات أيضية محددة في التقييم الدقيق للتغيرات الزمنية للتنوع الأيضي بعد التفاعلات البيولوجية. حاليًا، واستنادًا إلى تحليل نظرية المعلومات، فإن النتيجة الرئيسية لاكتساب طيف MS/MS باستخدام مستقلبات غير متحيزة هي أن الحيوانات العاشبة التي تتغذى على النباتات أو تحاكيها تستمر في تقليل التنوع الأيضي الكلي لميتابولوم الأوراق مع زيادة درجة تخصصه. ترتبط هذه الزيادة المؤقتة في خصوصية الميتابولوم، الناتجة عن الحيوانات العاشبة، بزيادة تآزرية في خصوصية النسخ الجيني. السمة التي تُسهم بشكل أكبر في هذا التخصص الأكبر للميتابولوم (ذات قيمة Si أعلى) هي المستقلب المتخصص ذو الوظيفة العاشبة التي تم تحديدها سابقًا. يتوافق هذا النموذج مع تنبؤات نظرية OD، لكن تنبؤات MT المتعلقة بعشوائية إعادة برمجة الميتابولوم لا تتوافق معه. ومع ذلك، فإن هذه البيانات تتفق أيضًا مع تنبؤ النموذج المختلط (أفضل MT؛ الشكل 1B)، لأن المستقلبات الأخرى غير الموصوفة ذات الوظائف الدفاعية غير المعروفة قد لا تزال تتبع توزيع Si عشوائيًا.
من الأنماط الجديرة بالملاحظة التي رصدها هذا البحث، أنه بدءًا من مستوى التطور الدقيق (نبات واحد ومجموعة من نباتات التبغ) وصولًا إلى نطاق تطوري أوسع (أنواع التبغ وثيقة الصلة)، توجد مستويات مختلفة من التنظيم التطوري في "أفضل دفاع". وتوجد اختلافات كبيرة في قدرات الحيوانات العاشبة. اقترح كل من مور وآخرون (20) وكيسلر وكالسكي (1) بشكل مستقل تحويل المستويات الوظيفية الثلاثة للتنوع البيولوجي التي ميزها ويتاكر (50) إلى التغيرات الزمنية التكوينية والمستحثة للتنوع الكيميائي؛ ولم يلخص أي من هذين الباحثين إجراءات جمع بيانات الميتابولوم على نطاق واسع، كما لم يحددا كيفية حساب التنوع الأيضي من هذه البيانات. في هذه الدراسة، ستُجرى تعديلات طفيفة على تصنيف ويتاكر الوظيفي، حيث سيُعتبر التنوع الأيضي ألفا تنوع أطياف MS/MS في نبات معين، والتنوع الأيضي بيتا الأيضي الأساسي داخل النوع الواحد لمجموعة من المجموعات السكانية، وسيكون التنوع الأيضي غاما امتدادًا لتحليل الأنواع المتشابهة.
تُعدّ إشارة حمض الجاسمونيك (JA) ضروريةً لمجموعة واسعة من الاستجابات الأيضية لدى الحيوانات العاشبة. مع ذلك، لا يزال هناك نقص في الاختبارات الكمية الدقيقة التي تُقيّم مساهمة التنظيم داخل النوع الواحد لتخليق حمض الجاسمونيك في تنوّع الأيض، كما أن ما إذا كانت إشارة حمض الجاسمونيك موقعًا عامًا للتنوّع الأيضي الناجم عن الإجهاد على نطاق تطوري أوسع لا يزال غير واضح. لاحظنا أن الطبيعة العاشبة لنباتات نيبينثس (Nepenthes herbivorous) تُحفّز تخصص الأيض، وأن تباين تخصص الأيض داخل مجموعات أنواع نبات نيكوتيانا (Nicotiana) وبين الأنواع وثيقة الصلة يرتبط ارتباطًا إيجابيًا منهجيًا بإشارة حمض الجاسمونيك. إضافةً إلى ذلك، عند اختلال إشارة حمض الجاسمونيك، يتم إلغاء التخصص الأيضي الناجم عن نمط وراثي واحد من الحيوانات العاشبة (الشكل 3، جـ وهـ). بما أن التغيرات في الطيف الأيضي لمجموعات نباتات الإبريق المتناقصة طبيعياً هي في الغالب كمية، فإن التغيرات في تنوع وخصوصية الأيض في هذا التحليل قد تكون ناتجة بشكل كبير عن التنشيط القوي لفئات المركبات الغنية بالأيضات. تهيمن هذه الفئات من المركبات على جزء من ملف تعريف الأيض وتؤدي إلى ارتباط إيجابي مع إشارات حمض الجاسمونيك.
نظرًا للاختلاف الكبير في الآليات البيوكيميائية لأنواع التبغ وثيقة الصلة، يتم تحديد المستقلبات بدقة نوعية، مما يجعل التحليل أكثر دقة. يكشف تحليل البيانات الأيضية باستخدام نظرية المعلومات أن التحفيز الناتج عن الحيوانات العاشبة يُفاقم المفاضلة بين تنوع وتخصص الأيض. وتلعب إشارة حمض الجاسمونيك (JA) دورًا محوريًا في هذه المفاضلة. يتوافق ازدياد تخصص الأيض مع التنبؤ الرئيسي لكثافة الضوء، ويرتبط إيجابيًا بإشارة حمض الجاسمونيك، بينما ترتبط إشارة حمض الجاسمونيك سلبيًا بتنوع وتخصص الأيض. تشير هذه النماذج إلى أن قدرة النباتات على تحمل كثافة الضوء تتحدد بشكل أساسي بمرونة حمض الجاسمونيك، سواء على نطاق التطور الدقيق أو على نطاق تطوري أوسع. كما تكشف تجارب تطبيق حمض الجاسمونيك الخارجي، التي تتجاوز عيوب التخليق الحيوي لحمض الجاسمونيك، أنه يمكن تمييز أنواع التبغ وثيقة الصلة إلى أنواع تستجيب للإشارة وأخرى لا تستجيب لها، تمامًا كما هو الحال مع نمط استجابة حمض الجاسمونيك ومرونة الأيض الناتجة عن الحيوانات العاشبة. لا تستطيع الأنواع غير المستجيبة للإشارات الاستجابة بسبب عجزها عن إنتاج حمض الجاسمونيك الداخلي، وبالتالي تخضع لقيود فسيولوجية. قد يكون هذا ناتجًا عن طفرات في بعض الجينات الرئيسية في مسار إشارات حمض الجاسمونيك (AOS وJAR4 في نبات N. crescens). تُبرز هذه النتيجة أن أنماط التطور الكلي بين الأنواع قد تكون مدفوعة بشكل أساسي بتغيرات في إدراك الهرمونات الداخلية والاستجابة لها.
بالإضافة إلى التفاعل بين النباتات والحيوانات العاشبة، يرتبط استكشاف التنوع الأيضي بجميع التطورات النظرية الهامة في أبحاث التكيف البيولوجي مع البيئة وتطور السمات الظاهرية المعقدة. مع ازدياد كمية البيانات التي يتم الحصول عليها بواسطة أجهزة قياس الطيف الكتلي الحديثة، أصبح بإمكان اختبار فرضيات التنوع الأيضي تجاوز الاختلافات الفردية/الفئوية في الأيضات وإجراء تحليل شامل للكشف عن أنماط غير متوقعة. في عملية التحليل واسع النطاق، يُعدّ تصور خرائط ذات دلالة يمكن استخدامها لاستكشاف البيانات استعارة مهمة. لذلك، تتمثل إحدى النتائج المهمة للدمج الحالي بين علم الأيض غير المتحيز باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي ونظرية المعلومات في توفير مقياس بسيط يمكن استخدامه لإنشاء خرائط لاستعراض التنوع الأيضي على مختلف المستويات التصنيفية. وهذا هو الشرط الأساسي لهذه الطريقة. دراسة التطور الجزئي/الكلي وعلم بيئة المجتمعات.
على المستوى التطوري الكلي، يرتكز جوهر نظرية التطور المشترك بين النباتات والحشرات لإيرليخ ورافين (51) على التنبؤ بأن تباين التنوع الأيضي بين الأنواع هو سبب تنوع السلالات النباتية. مع ذلك، خلال الخمسين عامًا التي تلت نشر هذا العمل الرائد، نادرًا ما تم اختبار هذه الفرضية (52). ويعود ذلك في الغالب إلى الخصائص التطورية للخصائص الأيضية المتشابهة عبر السلالات النباتية المتباعدة. ويمكن استخدام هذه الندرة كأساس لأساليب تحليل الأهداف. تعمل آلية عمل MS/MS الحالية، التي تُعالج بنظرية المعلومات، على تحديد التشابه البنيوي لـ MS/MS للمستقلبات غير المعروفة (دون اختيار مسبق للمستقلبات) وتحويل هذه الـ MS/MS إلى مجموعة من الـ MS/MS، وبالتالي، في مجال الأيض الاحترافي، تتم مقارنة نماذج التطور الكلي هذه على مقياس تصنيفي باستخدام مؤشرات إحصائية بسيطة. تشبه هذه العملية التحليل التطوري، الذي يمكنه استخدام محاذاة التسلسل لتحديد معدل التنوع أو تطور الصفات كميًا دون تنبؤ مسبق.
على المستوى البيوكيميائي، تُظهر فرضية الفرز لفيرن وجونز (53) أن التنوع الأيضي يُحافظ عليه على مستويات مختلفة لتوفير المواد الخام اللازمة لممارسة الأنشطة البيولوجية للمستقلبات غير المرتبطة سابقًا أو المُستبدلة. تُوفر أساليب نظرية المعلومات إطارًا يُمكن من خلاله قياس هذه التحولات التطورية الخاصة بالمستقلبات، والتي تحدث أثناء تخصص المستقلبات، كجزء من عملية الفرز التطوري المقترحة: التكيف النشط بيولوجيًا من خصوصية منخفضة إلى خصوصية عالية، والمستقلبات المُثبطة لبيئة معينة.
باختصار، في بدايات علم الأحياء الجزيئي، طُورت نظريات هامة حول دفاع النبات، وتُعتبر الأساليب الاستنتاجية القائمة على الفرضيات الوسيلة الوحيدة للتقدم العلمي. ويعود ذلك في معظمه إلى القيود التقنية لقياس الميتابولوم بأكمله. ورغم أن هذه الأساليب مفيدة بشكل خاص في تحديد الآليات السببية الأخرى، إلا أن قدرتها على تعزيز فهمنا للشبكات البيوكيميائية محدودة مقارنةً بالأساليب الحسابية المتاحة حاليًا في العلوم المعاصرة كثيفة البيانات. لذا، فإن النظريات التي لا يمكن التنبؤ بها تقع خارج نطاق البيانات المتاحة، وبالتالي لا يمكن إلغاء دورة الفرضية/الاختبار في مجال البحث (4). نتوقع أن يُعيد سير العمل الحسابي لعلم الميتابولوميات، المُقدم هنا، إحياء الاهتمام بقضايا التنوع الأيضي الحديثة (كيف) والنهائية (لماذا)، وأن يُسهم في عصر جديد من علم البيانات الموجه نظريًا. وقد أعاد هذا العصر النظر في النظريات الهامة التي ألهمت الأجيال السابقة.
تتم عملية التغذية المباشرة للحشرات العاشبة عن طريق تربية يرقة في طورها الثاني (اليرقة Sl) على ورقة واحدة من نبات إبريق ذي لون باهت من نبتة ورد مزهرة واحدة، مع تكرار التجربة عشر مرات لكل نبتة. تم تثبيت اليرقات بملاقط، وجُمع نسيج الورقة المتبقي بعد 24 و72 ساعة من الإصابة، ثم جُمّد سريعًا، واستُخلصت منه المواد الأيضية.
محاكاة المعاملة العاشبة بطريقة متزامنة للغاية. تتمثل الطريقة في استخدام عجلات نمط القماش لثقب ثلاثة صفوف من الأشواك على كل جانب من العرق الوسطي للأوراق الثلاث المتفتحة بالكامل للنبات خلال مرحلة نمو إكليل القماش، ثم وضع محلول مخفف بنسبة 1:5 من مادة Ms. أو استخدام أصابع مغطاة بقفازات لإدخال S1 OS في جرح الثقب. يتم حصاد ورقة ومعالجتها كما هو موضح أعلاه. استخدم الطريقة الموصوفة سابقًا لاستخلاص المستقلبات الأولية والهرمونات النباتية (54).
في تطبيقات حمض الجاسمونيك الخارجي، تُعالج الأوراق الثلاث ذات الأعناق من كل نبتة من نباتات الورد الستة المزهرة من كل نوع بـ 20 ميكرولتر من معجون اللانولين المحتوي على 150 ميكروغرام من ميثيل جاسمونيك (لانولين + ميثيل جاسمونيك)، أو بـ 20 ميكرولتر من اللانولين مع معالجة الجروح (لانولين + معالجة الجروح)، أو يُستخدم 20 ميكرولتر من اللانولين النقي كعينة ضابطة. تُجمع الأوراق بعد 72 ساعة من المعالجة، وتُجمد تجميدًا سريعًا في النيتروجين السائل، وتُخزن عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لحين استخدامها.
تم تحديد أربعة سلالات معدلة وراثيًا من نبات الجاسمونيوم والإيثيلين، وهي: irAOC (36)، وirCOI1 (55)، وirACO، وsETR1 (48)، في مجموعتنا البحثية. أظهرت سلالة irAOC انخفاضًا ملحوظًا في مستويات الجاسمونيوم وحمض الجاسمونيك-إيزولوسين، بينما لم تتأثر سلالة irCOI1 بالجاسمونيوم. وبالمقارنة مع سلالة EV، ازداد تراكم حمض الجاسمونيك-إيزولوسين. وبالمثل، ستُقلل سلالة irACO من إنتاج الإيثيلين، وبالمقارنة مع سلالة EV، ستزيد سلالة sETR1، غير المتأثرة بالإيثيلين، من إنتاج الإيثيلين.
يُستخدم مطياف ليزري كهروضوئي (مستشعر التبخر النتحي ETD-300 من Sensor Sense) لإجراء قياس التبخر النتحي بطريقة غير جراحية. مباشرةً بعد المعالجة، قُطِع نصف الأوراق ونُقِل إلى قارورة زجاجية محكمة الإغلاق سعتها 4 مل، وتُرِك الفراغ العلوي ليتراكم خلال 5 ساعات. أثناء القياس، جرى ضخ تيار من الهواء النقي بمعدل 2 لتر/ساعة في كل قارورة لمدة 8 دقائق، بعد أن مرّ هذا الهواء عبر محفز مُقدَّم من Sensor Sense لإزالة ثاني أكسيد الكربون والماء.
نُشرت بيانات المصفوفة الدقيقة في الأصل في المرجع (35) وحُفظت في قاعدة بيانات التعبير الجيني الشاملة التابعة للمركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية (NCBI) (رقم الوصول GSE30287). استُخرجت البيانات الخاصة بالأوراق المتضررة نتيجة المعالجة بـ W + OSMs، بالإضافة إلى بيانات المجموعة الضابطة غير المتضررة، لهذه الدراسة. يُقاس مستوى الشدة الخام باستخدام اللوغاريتم الثنائي (log2). قبل التحليل الإحصائي، حُوِّل خط الأساس ووُحِّدَ إلى النسبة المئوية الخامسة والسبعين باستخدام حزمة برامج R.
تم استرجاع بيانات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) الأصلية لأنواع نبات التبغ (Nicotiana) من أرشيف القراءات القصيرة (SRA) التابع للمركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية (NCBI)، برقم المشروع PRJNA301787، كما ورد في دراسة Zhou et al. (39)، وتمت معالجتها وفقًا للطريقة الموضحة في (56). تم اختيار البيانات الأولية المُعالجة بواسطة W + W و W + OSM و W + OSS1، والمطابقة لأنواع نبات التبغ، لتحليلها في هذه الدراسة، وتمت معالجتها على النحو التالي: أولًا، تم تحويل قراءات RNA-seq الأولية إلى صيغة FASTQ. ثم قام برنامج HISAT2 بتحويل FASTQ إلى صيغة SAM، وقام برنامج SAMtools بتحويل ملفات SAM إلى ملفات BAM مُرتبة. استُخدم برنامج StringTie لحساب التعبير الجيني، وتعتمد طريقة حسابه على عدد القطع لكل ألف قطعة قاعدية لكل مليون قطعة من النسخ المُتسلسل.
يتكون عمود الفصل الكروماتوغرافي Acclaim (150 مم × 2.1 مم؛ حجم الجسيمات 2.2 ميكرومتر) المستخدم في التحليل، وعمود الحماية (4 مم × 4 مم)، من نفس المادة. يُستخدم التدرج الثنائي التالي في نظام كروماتوغرافيا السائل فائق الأداء Dionex UltiMate 3000 (UHPLC): من 0 إلى 0.5 دقيقة، تركيز متساوي 90% من المذيب A [ماء منزوع الأيونات، 0.1% (حجم/حجم) أسيتونيتريل، و0.05% حمض الفورميك]، و10% من المذيب B (أسيتونيتريل و0.05% حمض الفورميك)؛ من 0.5 إلى 23.5 دقيقة، يكون تركيز المذيب 10% من المذيب A و90% من المذيب B على التوالي؛ من 23.5 إلى 25 دقيقة، تركيز متساوي 10% من المذيب A و90% من المذيب B. معدل التدفق 400 ميكرولتر/دقيقة. بالنسبة لجميع تحليلات MS، يتم حقن مذيب العمود في محلل رباعي الأقطاب ووقت الطيران (qTOF) مزود بمصدر رذاذ كهربائي يعمل في وضع التأين الموجب (جهد الشعيرة، 4500 فولت؛ مخرج الشعيرة 130 فولت؛ درجة حرارة التجفيف 200 درجة مئوية؛ تدفق هواء التجفيف 10 لترات/دقيقة).
يُجرى تحليل تجزئة MS/MS (يُشار إليه فيما يلي بـ MS/MS) غير ذي صلة أو غير قابل للتمييز عن البيانات للحصول على معلومات هيكلية حول المظهر الأيضي الكلي القابل للكشف. يعتمد مفهوم طريقة MS/MS غير الانتقائية على حقيقة أن جهاز رباعي الأقطاب يتمتع بنافذة عزل كتلي واسعة جدًا [لذلك، تُعتبر جميع إشارات نسبة الكتلة إلى الشحنة (m/z) شظايا]. لهذا السبب، ولأن جهاز Impact II لم يكن قادرًا على إنشاء ميل CE، أُجريت عدة تحليلات مستقلة باستخدام قيم طاقة تصادم (CE) مُحسّنة للتفكك الناتج عن التصادم. باختصار، يُحلل العينة أولًا بواسطة UHPLC-التأين بالرذاذ الإلكتروني/qTOF-MS باستخدام وضع قياس الطيف الكتلي الأحادي (ظروف تجزئة منخفضة ناتجة عن التجزئة داخل المصدر)، مع المسح من m/z 50 إلى 1500 بتردد تكرار 5 هرتز. استخدم النيتروجين كغاز تصادم لتحليل MS/MS، وقم بإجراء قياسات مستقلة عند أربعة جهود تفكك مختلفة ناتجة عن التصادم: 20، 30، 40، و50 إلكترون فولت. خلال عملية القياس، يتميز جهاز التحليل الرباعي الأقطاب بأكبر نطاق لعزل الكتلة، من m/z 50 إلى 1500. عند ضبط m/z وعرض العزل في الجزء الأمامي للجهاز على 200، يتم تفعيل نطاق الكتلة تلقائيًا بواسطة برنامج تشغيل الجهاز. امسح شظايا الكتلة كما في وضع الكتلة المفردة. استخدم فورمات الصوديوم (50 مل من الإيزوبروبانول، 200 ميكرولتر من حمض الفورميك، و1 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم المائي 1 مولار) لمعايرة الكتلة. باستخدام خوارزمية المعايرة عالية الدقة من Bruker، تتم معايرة ملف البيانات بعد تشغيل متوسط ​​الطيف خلال فترة زمنية محددة. استخدم وظيفة التصدير في برنامج Data Analysis v4.0 (Brook Dalton، بريمن، ألمانيا) لتحويل ملفات البيانات الخام إلى تنسيق NetCDF. تم حفظ مجموعة بيانات MS/MS في قاعدة بيانات الأيض المفتوحة MetaboLights (www.ebi.ac.uk) برقم الوصول MTBLS1471.
يمكن تحقيق تجميع MS/MS من خلال تحليل الارتباط بين إشارات جودة MS1 وMS/MS لطاقة تصادم منخفضة وعالية، وذلك باستخدام قواعد مُطبقة حديثًا. يُستخدم برنامج R النصي لإجراء تحليل الارتباط لتوزيع السلائف إلى المنتج، بينما يُستخدم برنامج C# النصي (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) لتطبيق القواعد.
لتقليل الأخطاء الإيجابية الكاذبة الناتجة عن الضوضاء الخلفية والارتباطات الخاطئة الناتجة عن اكتشاف بعض خصائص m/z في عدد قليل من العينات، نستخدم دالة "filled peak" من حزمة XCMS في لغة R (لتصحيح الضوضاء الخلفية) لاستبدال شدة "NA" (القمة غير المكتشفة). عند استخدام دالة fill peak، تظل هناك العديد من قيم الشدة "0" في مجموعة البيانات، مما يؤثر على حساب الارتباط. لذلك، نقارن نتائج معالجة البيانات عند استخدام دالة fill peak وعند عدم استخدامها، ونحسب قيمة الضوضاء الخلفية بناءً على متوسط ​​القيمة المقدرة المصححة، ثم نستبدل قيم الشدة "0" بقيمة الضوضاء الخلفية المحسوبة. كما نأخذ في الاعتبار فقط الخصائص التي تتجاوز شدتها ثلاثة أضعاف قيمة الضوضاء الخلفية ونعتبرها "قممًا حقيقية". لحسابات معامل ارتباط بيرسون (PCC)، نأخذ في الاعتبار فقط إشارات m/z لعينة السلائف (MS1) ومجموعات بيانات الشظايا التي تحتوي على ثماني قمم حقيقية على الأقل.
إذا كانت شدة خاصية الجودة الأولية في العينة بأكملها مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بانخفاض شدة نفس الخاصية عند تعرضها لطاقة تصادم منخفضة أو عالية، ولم تُصنّف هذه الخاصية كذروة نظيرية بواسطة برنامج CAMERA، فيمكن تحديدها بدقة أكبر. بعد ذلك، يتم إجراء تحليل الارتباط بحساب جميع أزواج السلائف والمنتجات الممكنة خلال 3 ثوانٍ (وهي فترة الاحتفاظ المقدرة للذروة). ولا تُعتبر شظية إلا إذا كانت قيمة m/z أقل من قيمة السلائف، وحدث تجزئة MS/MS في نفس موقع العينة في مجموعة البيانات كما هو الحال مع السلائف التي اشتُقت منها.
استنادًا إلى هاتين القاعدتين البسيطتين، نستبعد الشظايا المحددة ذات قيم m/z الأكبر من قيمة m/z للمركب الأولي المُحدد، وذلك بناءً على موضع العينة الذي يظهر فيه المركب الأولي والشظية المحددة. من الممكن أيضًا اختيار خصائص الجودة الناتجة عن العديد من الشظايا المُولَّدة داخل المصدر في وضع MS1 كسلائف مُحتملة، مما يُؤدي إلى توليد مركبات MS/MS زائدة. وللحد من هذا التكرار في البيانات، إذا تجاوز تشابه NDP للأطياف 0.6، وكانت تنتمي إلى مجموعة الكروماتوجرام "pcgroup" المُعَلَّمة بواسطة CAMERA، فسنقوم بدمجها. أخيرًا، ندمج جميع نتائج الفصل الكهربائي الشعيري الأربعة المرتبطة بالمركب الأولي والشظايا في طيف مُركَّب نهائي مُفكَّك، وذلك باختيار قمة الشدة الأعلى من بين جميع القمم المُرشَّحة التي لها نفس قيمة m/z عند طاقات تصادم مختلفة. وتستند خطوات المعالجة اللاحقة إلى مفهوم الطيف المركب وتأخذ في الاعتبار ظروف CE المختلفة المطلوبة لزيادة احتمالية التجزئة إلى أقصى حد، لأنه لا يمكن اكتشاف بعض الشظايا إلا في ظل طاقة تصادم محددة.
استُخدم برنامج RDPI (30) لحساب قابلية تحفيز الملامح الأيضية. يُستخلص تنوع الطيف الأيضي (مؤشر Hj) من وفرة سلائف MS/MS باستخدام إنتروبيا شانون لتوزيع تردد MS/MS وفقًا للمعادلة التالية الموصوفة من قِبل مارتينيز وآخرون (8): Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij)، حيث يُمثل Pij التردد النسبي لسلائف MS/MS رقم i في العينة رقم j (حيث j = 1, 2,…, m).
تُعرَّف الخصوصية الأيضية (مؤشر Si) بأنها مدى تطابق التعبير في طيف الكتلة الترادفي (MS/MS) بالنسبة إلى التردد بين العينات قيد الدراسة. تُحسب خصوصية طيف الكتلة الترادفي (MS/MS) وفقًا للمعادلة التالية: Si = 1/t (∑j = 1/tPijPilog2PijPi)
استخدم الصيغة التالية لقياس مؤشر δj الخاص بالميتابولوم لكل عينة j، ومتوسط ​​خصوصية MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
تُحاذى أطياف MS/MS في أزواج، ويُحسب التشابه بناءً على درجتي التشابه. أولًا، باستخدام طريقة NDP القياسية (المعروفة أيضًا باسم طريقة ارتباط جيب التمام)، تُستخدم المعادلة التالية لحساب تشابه القطاعات بين الأطياف: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 حيث S1 وS2. وبالمثل، بالنسبة للطيف 1 والطيف 2، وكذلك WS1, i وWS2, i، يُمثل الوزن بناءً على شدة الذروة بحيث يكون الفرق بين الذروة المشتركة رقم i بين الطيفين أقل من 0.01 دالتون. يُحسب الوزن كما يلي: W = [شدة الذروة] m [الجودة] n، m = 0.5، n = 2، كما هو مُقترح من MassBank.
تم تطبيق طريقة تقييم ثانية، تتضمن تحليل قائمة NL المشتركة بين MS/MS. ولتحقيق ذلك، استخدمنا قوائم NL الـ 52 التي تُصادف بكثرة أثناء عملية تجزئة MS، بالإضافة إلى قائمة NL الأكثر تحديدًا (ملف البيانات S1) التي سبق شرحها لطيف MS/MS للمستقلبات الثانوية لأنواع Nepenthes الضعيفة (9، 26). يتم إنشاء متجه ثنائي من 1 و0 لكل MS/MS، يُشير إلى وجود قائمة NL الحالية أو عدم وجودها على التوالي. وبناءً على تشابه المسافة الإقليدية، يتم حساب درجة تشابه NL لكل زوج من متجهات NL الثنائية.
لإجراء التجميع الثنائي، استخدمنا حزمة R المسماة DiffCoEx، وهي مبنية على امتداد لتحليل التعبير الجيني المشترك الموزون (WGCNA). وباستخدام مصفوفات تسجيل NDP وNL لأطياف MS/MS، استخدمنا DiffCoEx لحساب مصفوفة الارتباط المقارنة. يتم إجراء التجميع الثنائي بضبط المعامل "cutreeDynamic" على القيم التالية: method = "hybrid"، cutHeight = 0.9999، deepSplit = T، وminClusterSize = 10. تم تنزيل شفرة المصدر R الخاصة بـ DiffCoEx من الملف الإضافي 1 بواسطة Tesson وآخرون (57). يمكن العثور على حزمة برامج R WGCNA المطلوبة على الرابط التالي: https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
من أجل إجراء تحليل الشبكة الجزيئية MS/MS، قمنا بحساب الاتصال الطيفي المزدوج بناءً على أنواع التشابه NDP و NL، واستخدمنا برنامج Cytoscape لتصور طوبولوجيا الشبكة باستخدام التخطيط العضوي في تطبيق امتداد خوارزمية تخطيط CyFilescape yFiles.
استُخدم برنامج R الإصدار 3.0.1 لإجراء التحليل الإحصائي للبيانات. تم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA)، متبوعًا باختبار توكي للفرق المعنوي الصادق (HSD) للمقارنات المتعددة. ولتحليل الفرق بين المعاملة التي تعرضت للرعي والمجموعة الضابطة، تم تحليل التوزيع ثنائي الطرف لمجموعتي العينات اللتين لهما نفس التباين باستخدام اختبار t للطالب.
للاطلاع على المواد التكميلية لهذه المقالة، يرجى زيارة الرابط التالي: http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
هذه مقالة متاحة للجميع بموجب شروط رخصة المشاع الإبداعي نَسب المُؤَلِّف - غير تجاري، والتي تسمح باستخدامها وتوزيعها وإعادة إنتاجها بأي وسيلة، شريطة ألا يكون الاستخدام النهائي لأغراض تجارية وأن يكون العمل الأصلي صحيحًا. مرجع.
ملاحظة: نطلب منك فقط تزويدنا بعنوان بريدك الإلكتروني لكي يعلم الشخص الذي توصي به للصفحة أنك ترغب في أن يرى الرسالة وأنها ليست رسالة مزعجة. لن نقوم بتسجيل أي عناوين بريد إلكتروني.
يُستخدم هذا السؤال لاختبار ما إذا كنت زائرًا ولمنع إرسال الرسائل غير المرغوب فيها تلقائيًا.
توفر نظرية المعلومات عملة عالمية لمقارنة الميتابولومات الخاصة والتنبؤ بنظريات الدفاع عن الاختبار.
توفر نظرية المعلومات عملة عالمية لمقارنة الميتابولومات الخاصة والتنبؤ بنظريات الدفاع عن الاختبار.
©2021 الجمعية الأمريكية لتقدم العلوم. جميع الحقوق محفوظة. AAAS هي شريك لـ HINARI، وAGORA، وOARE، وCHORUS، وCLOCKSS، وCrossRef، وCOUNTER. تقدم العلوم ISSN 2375-2548.