سبق أن أشرنا إلى انخفاض مستويات حمض الإندول-3-بروبيونيك (IPA)، وهو مستقلب التربتوفان المشتق من الأمعاء، في مصل الدم لدى مرضى تليف الكبد. في هذه الدراسة، بحثنا في النسخ الجيني والميثيلوم الخاص بالحمض النووي في أكباد المصابين بالسمنة وعلاقتهما بمستويات IPA في مصل الدم، بالإضافة إلى دور IPA في تحفيز تعطيل النمط الظاهري للخلايا النجمية الكبدية (HSCs) في المختبر.
شملت الدراسة 116 مريضًا يعانون من السمنة المفرطة دون الإصابة بداء السكري من النوع الثاني (متوسط ​​العمر 46.8 ± 9.3 سنة؛ مؤشر كتلة الجسم: 42.7 ± 5.0 كجم/م²) والذين خضعوا لجراحة السمنة في مركز كوبيو لجراحة السمنة. تم قياس مستويات IPA في الدم باستخدام تقنية كروماتوغرافيا السائل-مطياف الكتلة (LC-MS)، وأُجري تحليل النسخ الجيني للكبد باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبوزي الكلي، كما أُجري تحليل مثيلة الحمض النووي باستخدام شريحة Infinium HumanMethylation450 BeadChip. استُخدمت خلايا الكبد النجمية البشرية (LX-2) في التجارب المخبرية.
ارتبطت مستويات IPA في مصل الدم بتعبير الجينات المشاركة في مسارات موت الخلايا المبرمج، والالتهام الذاتي للميتوكوندريا، وإطالة العمر في الكبد. وكان جين كيناز سيرين/ثريونين 1 (AKT1) هو الجين الأكثر وفرةً وهيمنةً في تفاعلات النسخ الجيني وملامح مثيلة الحمض النووي في الكبد. وقد حثّ علاج IPA على موت الخلايا المبرمج، وخفّض التنفس الميتوكوندري، وغيّر من مورفولوجيا الخلية وديناميكيات الميتوكوندريا عن طريق تعديل تعبير الجينات المعروفة بتنظيم التليف، وموت الخلايا المبرمج، وبقاء خلايا LX-2.
وبالنظر إلى هذه البيانات مجتمعة، فإنها تدعم أن IPA له تأثيرات علاجية محتملة ويمكنه أن يحفز موت الخلايا المبرمج ويحول النمط الظاهري للخلايا النجمية الكبدية نحو حالة غير نشطة، مما يوسع إمكانية تثبيط تليف الكبد عن طريق التدخل في تنشيط الخلايا النجمية الكبدية واستقلاب الميتوكوندريا.
يرتبط انتشار السمنة ومتلازمة التمثيل الغذائي بزيادة معدل الإصابة بمرض الكبد الدهني المرتبط بالتمثيل الغذائي (MASLD)، والذي يصيب ما بين 25% و30% من عامة السكان [1]. يُعد تليف الكبد النتيجة الرئيسية لمرض الكبد الدهني المرتبط بالتمثيل الغذائي، وهي عملية ديناميكية تتميز بتراكم مستمر للمادة الخلوية خارج الخلية الليفية [2]. الخلايا الرئيسية المتورطة في تليف الكبد هي الخلايا النجمية الكبدية (HSCs)، والتي تُظهر أربعة أنماط ظاهرية معروفة: السكون، والتنشيط، والتثبيط، والشيخوخة [3، 4]. يمكن تنشيط الخلايا النجمية الكبدية والتحول من شكلها الساكن إلى خلايا ليفية تكاثرية ذات متطلبات طاقة عالية، مع زيادة في التعبير عن أكتين العضلات الملساء ألفا (α-SMA) والكولاجين من النوع الأول (Col-I) [5، 6]. أثناء عملية عكس تليف الكبد، يتم التخلص من الخلايا النجمية الكبدية المنشطة عن طريق الاستماتة الخلوية أو التثبيط. وتشمل هذه العمليات خفض تنظيم الجينات الليفية وتعديل الجينات المؤيدة للبقاء (مثل مسارات إشارات NF-κB و PI3K/Akt) [7، 8]، بالإضافة إلى تغييرات في ديناميكيات الميتوكوندريا ووظيفتها [9].
وُجد أن مستويات حمض الإندول-3-بروبيونيك (IPA)، وهو مستقلب التربتوفان الذي يُنتج في الأمعاء، تنخفض في مصل الدم لدى مرضى الأمراض الأيضية، بما في ذلك مرض الكبد الدهني المرتبط بالبروتين السكري (MASLD) [10-13]. يرتبط حمض الإندول-3-بروبيونيك بتناول الألياف الغذائية، ويُعرف بخصائصه المضادة للأكسدة والالتهابات، كما أنه يُخفف من أعراض التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) الناجم عن النظام الغذائي، سواءً في الجسم الحي أو في المختبر [11-14]. وتشير بعض الأدلة إلى ذلك من دراستنا السابقة، التي أظهرت انخفاض مستويات حمض الإندول-3-بروبيونيك في مصل الدم لدى مرضى تليف الكبد مقارنةً بمرضى السمنة الذين لا يعانون من تليف الكبد، وذلك في دراسة جراحة السمنة في كوبيو (KOBS). علاوة على ذلك، أظهرنا أن العلاج بحمض الإندول-3-بروبيونيك يُمكن أن يُقلل من التعبير الجيني للجينات التي تُعد مؤشرات كلاسيكية لالتصاق الخلايا وهجرتها وتنشيط الخلايا الجذعية المكونة للدم في نموذج خلايا الكبد النجمية البشرية (LX-2)، وهو مستقلب محتمل لحماية الكبد [15]. ومع ذلك، لا يزال من غير الواضح كيف يحفز IPA تراجع تليف الكبد عن طريق تنشيط موت الخلايا النجمية الكبدية والطاقة الحيوية للميتوكوندريا.
نُبين هنا أن مستوى بروتين IPA في مصل الدم يرتبط بتعبير الجينات المُشاركة في مسارات موت الخلايا المبرمج، والالتهام الذاتي للميتوكوندريا، وطول العمر في كبد الأفراد البدينين غير المصابين بداء السكري من النوع الثاني (KOBS). علاوة على ذلك، وجدنا أن بروتين IPA قادر على تحفيز إزالة وتحلل الخلايا الجذعية المكونة للدم المُنشطة (HSCs) عبر مسار التثبيط. تكشف هذه النتائج عن دور جديد لبروتين IPA، مما يجعله هدفًا علاجيًا محتملاً لتعزيز تراجع تليف الكبد.
أظهرت دراسة سابقة ضمن مجموعة KOBS أن المرضى المصابين بتليف الكبد لديهم مستويات أقل من IPA في الدورة الدموية مقارنةً بالمرضى غير المصابين بتليف الكبد [15]. ولاستبعاد التأثير المُربك المحتمل لداء السكري من النوع الثاني، قمنا بتجنيد 116 مريضًا يعانون من السمنة المفرطة ولا يعانون من داء السكري من النوع الثاني (متوسط ​​العمر ± الانحراف المعياري: 46.8 ± 9.3 سنة؛ مؤشر كتلة الجسم: 42.7 ± 5.0 كجم/م²) (الجدول 1) من دراسة KOBS الجارية كمجموعة الدراسة [16]. وقدّم جميع المشاركين موافقة خطية مستنيرة، وتمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى مقاطعة شمال سافو وفقًا لإعلان هلسنكي (54/2005، 104/2008، و27/2010).
تم الحصول على عينات خزعة الكبد أثناء جراحة السمنة، وقام أخصائيو علم الأمراض ذوو الخبرة بتقييمها نسيجياً وفقاً للمعايير الموصوفة سابقاً [17، 18]. وتلخص معايير التقييم في الجدول التكميلي S1، وقد تم وصفها سابقاً [19].
تم تحليل عينات مصل الدم بعد الصيام باستخدام تقنية كروماتوغرافيا السائل غير الموجهة المقترنة بقياس الطيف الكتلي (LC-MS) لتحليل الأيض (عدد العينات = 116). وتم تحليل العينات باستخدام نظام UHPLC-qTOF-MS (1290 LC، 6540 qTOF-MS، شركة Agilent Technologies، فالدبرون، كارلسروه، ألمانيا) كما هو موضح سابقًا¹⁹. واعتمد تحديد هوية كحول الأيزوبروبيل (IPA) على زمن الاحتفاظ ومقارنة طيف MS/MS مع المعايير النقية. وتم أخذ شدة إشارة كحول الأيزوبروبيل (مساحة الذروة) في الاعتبار في جميع التحليلات اللاحقة^[20].
أُجري تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) للكبد بالكامل باستخدام جهاز Illumina HiSeq 2500، وخضعت البيانات للمعالجة المسبقة كما هو موضح سابقًا [19، 21، 22]. أجرينا تحليلًا مُستهدفًا للتعبير التفاضلي للنسخ الجينية المؤثرة على وظيفة/تكوين الميتوكوندريا باستخدام 1957 جينًا مُختارًا من قاعدة بيانات MitoMiner 4.0 [23]. أُجري تحليل مثيلة الحمض النووي (DNA) للكبد باستخدام شريحة Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام نفس المنهجية الموصوفة سابقًا [24، 25].
تم الحصول على خلايا الكبد النجمية البشرية (LX-2) من البروفيسور ستيفانو روميو، وتمت زراعتها وحفظها في وسط DMEM/F12 (Biowest، L0093-500، 1% بنسلين/ستربتومايسين؛ Lonza، DE17-602E، 2% مصل بقري جنيني؛ Gibco، 10270-106). ولتحديد الجرعة الفعالة من IPA، عولجت خلايا LX-2 بتراكيز مختلفة من IPA (10 ميكرومولار، 100 ميكرومولار، و1 ميليمولار؛ Sigma، 220027) في وسط DMEM/F12 لمدة 24 ساعة. علاوة على ذلك، وللتحقق من قدرة IPA على تعطيل الخلايا الجذعية المكونة للدم، عولجت خلايا LX-2 بـ 5 نانوغرام/مل من TGF-β1 (R&D systems، 240-B-002/CF) و1 ملي مول من IPA في وسط خالٍ من المصل لمدة 24 ساعة. أما بالنسبة لمجموعات التحكم، فقد استُخدم 4 نانومول من حمض الهيدروكلوريك المحتوي على 0.1% من ألبومين المصل البقري لمعالجة TGF-β1، واستُخدم 0.05% من ثنائي ميثيل سلفوكسيد لمعالجة IPA، واستُخدم كلاهما معًا في العلاج المركب.
تم تقييم موت الخلايا المبرمج باستخدام مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج FITC Annexin V مع 7-AAD (Biolegend، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية، رقم المنتج 640922) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار، زُرعت خلايا LX-2 (1 × 10⁵ خلية/بئر) طوال الليل في أطباق ذات 12 بئرًا، ثم عُولجت بجرعات متعددة من IPA أو IPA وTGF-β1. في اليوم التالي، جُمعت الخلايا العائمة والملتصقة، وفُصلت بالتربسين، وغُسلت بمحلول PBS، وأُعيد تعليقها في محلول ربط Annexin V، وحُضنت مع FITC-Annexin V و7-AAD لمدة 15 دقيقة.
تم تلوين الميتوكوندريا في الخلايا الحية للكشف عن النشاط التأكسدي باستخدام صبغة Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (شركة Thermo Fisher Scientific، كارلسباد، كاليفورنيا). ولإجراء فحوصات MTR، حُضنت خلايا LX-2 بكثافات متساوية مع IPA وTGF-β1. بعد 24 ساعة، عُولجت الخلايا الحية بالتربسين، وغُسلت بمحلول PBS، ثم حُضنت مع 100 ميكرومول من MTR في وسط خالٍ من المصل عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة كما وُصف سابقًا [26]. ولتحليل مورفولوجيا الخلايا الحية، حُلل حجم الخلية وتعقيد السيتوبلازم باستخدام معاملي التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC)، على التوالي.
تم الحصول على جميع البيانات (30000 حدث) باستخدام NovoCyte Quanteon (Agilent) وتم تحليلها باستخدام برنامج NovoExpress® 1.4.1 أو FlowJo V.10.
تم قياس معدل استهلاك الأكسجين (OCR) ومعدل تحمض الوسط خارج الخلوي (ECAR) في الوقت الحقيقي باستخدام جهاز تحليل التدفق الخلوي الخارجي Seahorse (شركة Agilent Technologies، سانتا كلارا، كاليفورنيا) المزود بوحدة Seahorse XF Cell Mito Stress، وذلك وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار، زُرعت 2 × 10⁴ خلية LX-2 في كل بئر على أطباق زراعة الخلايا XF96. بعد حضانة ليلية، عُولجت الخلايا بالإيزوبروبانول (IPA) وعامل النمو المحول بيتا 1 (TGF-β1) (انظر الملحق 1). أُجري تحليل البيانات باستخدام برنامج Seahorse XF Wave، الذي يتضمن مولد تقارير اختبار النمط الظاهري لطاقة الخلية Seahorse XF. ومن هذا التحليل، حُسب مؤشر الصحة البيولوجية (BHI) [27].
تم نسخ الحمض النووي الريبوزي الكلي إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA). للاطلاع على الطرق المحددة، يُرجى مراجعة المرجع [15]. استُخدمت مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) للبروتين الحمضي الريبوسومي البشري 60S P0 (RPLP0) والسيكلوفيلين A1 (PPIA) كضوابط جينية أساسية. استُخدم نظام QuantStudio 6 pro Real-Time PCR (Thermo Fisher، لاندسمير، هولندا) مع مجموعة TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) أو مجموعة Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline، BIO 94050)، وحُسبت نسبة التعبير الجيني باستخدام معلمات دورة قيمة العتبة المقارنة (ΔΔCt) وطريقة ∆∆Ct. تتوفر تفاصيل البادئات في الجداول التكميلية S2 وS3.
تم استخلاص الحمض النووي النووي (ncDNA) والحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) باستخدام مجموعة DNeasy لاستخلاص الحمض النووي من الدم والأنسجة (Qiagen) كما هو موضح سابقًا [28]. حُسبت الكمية النسبية للحمض النووي للميتوكوندريا بحساب نسبة كل منطقة مستهدفة من الحمض النووي للميتوكوندريا إلى المتوسط ​​الهندسي لمناطق الحمض النووي النووي الثلاث (mtDNA/ncDNA)، كما هو مفصل في الطرق التكميلية 2. ترد تفاصيل البادئات الخاصة بالحمض النووي للميتوكوندريا والحمض النووي النووي في الجدول التكميلي S4.
صُبغت الخلايا الحية بصبغة Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (شركة Thermo Fisher Scientific، كارلسباد، كاليفورنيا) لتصوير شبكات الميتوكوندريا بين الخلايا وداخلها. زُرعت خلايا LX-2 (1 × 10⁴ خلية/بئر) على شرائح زجاجية في أطباق زراعة زجاجية القاع (شركة Ibidi GmbH، مارتينسريد، ألمانيا). بعد 24 ساعة، حُضنت خلايا LX-2 الحية مع 100 ميكرومول من MTR لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ثم صُبغت أنوية الخلايا بصبغة DAPI (1 ميكروغرام/مل، شركة Sigma-Aldrich) كما وُصف سابقًا [29]. تم تصوير شبكات الميتوكوندريا باستخدام مجهر مقلوب من نوع Zeiss Axio Observer (شركة Carl Zeiss Microimaging GmbH، يينا، ألمانيا) مزود بوحدة Zeiss LSM 800 متحدة البؤرة، عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5% ثاني أكسيد الكربون، باستخدام عدسة موضوعية 63×NA 1.3. تم الحصول على عشر صور متسلسلة (Z-series) لكل نوع عينة. تحتوي كل سلسلة Z على 30 مقطعًا، بسماكة 9.86 ميكرومتر لكل مقطع. لكل عينة، تم الحصول على صور لعشرة مجالات رؤية مختلفة باستخدام برنامج ZEN 2009 (شركة Carl Zeiss Microimaging GmbH، يينا، ألمانيا)، وأُجري تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا باستخدام برنامج ImageJ (الإصدار 1.54d) [30، 31] وفقًا للمعايير الموضحة بالتفصيل في الملحق 3.
ثُبِّتت الخلايا باستخدام غلوتارالدهيد بنسبة 2% في محلول فوسفات بتركيز 0.1 مولار، ثم ثُبِّتت بمحلول رباعي أكسيد الأوزميوم بنسبة 1% (سيغما ألدريتش، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية)، وجُفِّفت تدريجيًا باستخدام الأسيتون (ميرك، دارمشتات، ألمانيا)، وأُخيراً دُفنت في راتنج إيبوكسي. أُعدَّت مقاطع رقيقة جدًا وصُبغت بأسيتات اليورانيل بنسبة 1% (ميرك، دارمشتات، ألمانيا) وسترات الرصاص بنسبة 1% (ميرك، دارمشتات، ألمانيا). حُصِلت على صور البنية الدقيقة باستخدام مجهر إلكتروني نافذ JEM 2100F EXII (شركة JEOL المحدودة، طوكيو، اليابان) بجهد تسريع 80 كيلو فولت.
تم تحليل مورفولوجيا خلايا LX-2 المعالجة بـ IPA لمدة 24 ساعة بواسطة المجهر الضوئي ذي التباين الطوري عند تكبير 50x باستخدام مجهر ضوئي مقلوب من Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 و AxioCam MRm، Jena، ألمانيا).
عُرضت البيانات السريرية كمتوسط ​​± انحراف معياري أو وسيط (المدى الربيعي: IQR). استُخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه (للمتغيرات المستمرة) أو اختبار مربع كاي (للمتغيرات الفئوية) لمقارنة الاختلافات بين مجموعات الدراسة الثلاث. استُخدم معدل النتائج الإيجابية الكاذبة (FDR) لتصحيح اختبارات الفرضيات المتعددة، واعتُبرت الجينات ذات معدل FDR < 0.05 ذات دلالة إحصائية. استُخدم تحليل ارتباط سبيرمان لربط مثيلة الحمض النووي CpG بشدة إشارة IPA، مع الإبلاغ عن قيم p الاسمية (p < 0.05).
أُجري تحليل المسارات باستخدام أداة تحليل مجموعات الجينات عبر الإنترنت (WebGestalt) لـ 268 نسخة جينية (قيمة p الاسمية < 0.01)، و119 نسخة جينية مرتبطة بالميتوكوندريا (قيمة p الاسمية < 0.05)، و4350 موقع CpG من أصل 3093 نسخة جينية كبدية مرتبطة بمستويات IPA في مصل الدم. استُخدمت أداة Venny DB المجانية (الإصدار 2.1.0) للعثور على الجينات المتداخلة، واستُخدمت أداة StringDB (الإصدار 11.5) لتصوير تفاعلات البروتين-بروتين.
في تجربة LX-2، تم اختبار العينات للتأكد من توزيعها الطبيعي باستخدام اختبار داغوستينو-بيرسون. تم الحصول على البيانات من ثلاث عينات بيولوجية على الأقل، وخضعت لتحليل التباين الأحادي (ANOVA) مع اختبار بونفيروني اللاحق. واعتُبرت قيمة p أقل من 0.05 دالة إحصائيًا. تُعرض البيانات كمتوسط ​​± انحراف معياري، ويُشار إلى عدد التجارب في كل شكل. أُجريت جميع التحليلات والرسوم البيانية باستخدام برنامج GraphPad Prism 8 الإحصائي لنظام التشغيل ويندوز (GraphPad Software Inc.، الإصدار 8.4.3، سان دييغو، الولايات المتحدة الأمريكية).
في البداية، بحثنا في العلاقة بين مستويات IPA في المصل ونسخ الجينات في الكبد والجسم والميتوكوندريا. في ملف النسخ الجيني الكلي، كان الجين الأكثر ارتباطًا بمستويات IPA في المصل هو MAPKAPK3 (معدل الاكتشاف الخاطئ = 0.0077؛ كيناز البروتين المنشط بالميتوجين 3)؛ أما في ملف النسخ الجيني المتعلق بالميتوكوندريا، فكان الجين الأكثر ارتباطًا هو AKT1 (معدل الاكتشاف الخاطئ = 0.7621؛ كيناز سيرين/ثريونين 1) (الملف الإضافي 1 والملف الإضافي 2).
ثم قمنا بتحليل النسخ الجينية العامة (عددها 268؛ قيمة p < 0.01) والنسخ الجينية المرتبطة بالميتوكوندريا (عددها 119؛ قيمة p < 0.05)، وتوصلنا في النهاية إلى تحديد موت الخلايا المبرمج باعتباره المسار الكلاسيكي الأكثر أهمية (قيمة p = 0.0089). بالنسبة للنسخ الجينية الميتوكوندرية المرتبطة بمستويات IPA في المصل، ركزنا على موت الخلايا المبرمج (معدل الاكتشاف الخاطئ = 0.00001)، والالتهام الذاتي للميتوكوندريا (معدل الاكتشاف الخاطئ = 0.00029)، ومسارات إشارات TNF (معدل الاكتشاف الخاطئ = 0.000006) (الشكل 1أ، الجدول 2، والأشكال التكميلية 1أ-ب).
تحليل متداخل للنسخ الجينية العالمية، والنسخ المرتبطة بالميتوكوندريا، ومَثْيَلَة الحمض النووي في كبد الإنسان وعلاقتها بمستويات IPA في المصل. يُمثل الشكل (أ) 268 نسخة جينية عالمية، و119 نسخة جينية مرتبطة بالميتوكوندريا، ونسخًا جينية مُمَثْيَلَة الحمض النووي، والتي تم ربطها بـ 3092 موقع CpG مرتبطة بمستويات IPA في المصل (قيمة p < 0.01 للنسخ الجينية العالمية والنسخ الجينية المُمَثْيَلَة، وقيمة p < 0.05 للنسخ الجينية الميتوكوندرية). تظهر النسخ الجينية المتداخلة الرئيسية في المنتصف (AKT1 وYKT6). الشكل (ب) خريطة التفاعل للجينات الـ 13 ذات أعلى درجة تفاعل (0.900) مع الجينات الأخرى، والتي تم إنشاؤها من الجينات الـ 56 المتداخلة (المنطقة ذات الخط الأسود) المرتبطة بشكل كبير بمستويات IPA في المصل باستخدام أداة StringDB الإلكترونية. اللون الأخضر: الجينات المرتبطة بالمكون الخلوي لعلم الجينات (GO): الميتوكوندريا (GO:0005739). يُعدّ بروتين AKT1 البروتين الحائز على أعلى درجة (0.900) في تفاعلاته مع البروتينات الأخرى، وذلك استنادًا إلى البيانات (المستندة إلى استخراج النصوص، والتجارب، وقواعد البيانات، والتعبير المشترك). تمثل عقد الشبكة البروتينات، بينما تمثل الحواف الروابط بينها.
بما أن نواتج أيض الميكروبات المعوية قادرة على تنظيم التركيب فوق الجيني عبر مثيلة الحمض النووي [32]، فقد بحثنا فيما إذا كانت مستويات IPA في المصل مرتبطة بمثيلة الحمض النووي في الكبد. ووجدنا أن موقعي المثيلة الرئيسيين المرتبطين بمستويات IPA في المصل يقعان بالقرب من المنطقة الغنية بالبرولين-سيرين 3 (C19orf55) والعضو 6 من عائلة بروتينات الصدمة الحرارية B (الصغيرة) (HSPB6) (الملف الإضافي 3). وارتبطت مثيلة الحمض النووي لـ 4350 موقع CpG (p < 0.01) بمستويات IPA في المصل، وكانت غنية بمسارات تنظيم طول العمر (p = 0.006) (الشكل 1A، الجدول 2، والشكل التكميلي 1C).
لفهم الآليات البيولوجية الكامنة وراء الارتباطات بين مستويات IPA في مصل الدم، والنسخ الجينية العامة، والنسخ الجينية المرتبطة بالميتوكوندريا، ومَثْيَلَة الحمض النووي في كبد الإنسان، أجرينا تحليلًا للتداخل بين الجينات التي تم تحديدها في تحليل المسار السابق (الشكل 1أ). أظهرت نتائج تحليل إثراء المسار للجينات الـ 56 المتداخلة (داخل الخط الأسود في الشكل 1أ) أن مسار موت الخلايا المبرمج (p = 0.00029) أبرز جينين مشتركين بين التحليلات الثلاثة: AKT1 وYKT6 (المتماثل لـ YKT6 v-SNARE)، كما هو موضح في مخطط فين (الشكل التكميلي 2 والشكل 1أ). ومن المثير للاهتمام، وجدنا أن AKT1 (cg19831386) وYKT6 (cg24161647) يرتبطان ارتباطًا إيجابيًا بمستويات IPA في مصل الدم (الملف الإضافي 3). لتحديد التفاعلات البروتينية المحتملة بين منتجات الجينات، اخترنا 13 جينًا من بين 56 جينًا متداخلًا، ممن حصلوا على أعلى درجة في المنطقة المشتركة (0.900)، كمدخلات، ثم أنشأنا خريطة تفاعل. ووفقًا لمستوى الثقة (الثقة الهامشية)، كان جين AKT1، الحاصل على أعلى درجة (0.900)، في أعلى الخريطة (الشكل 1ب).
استنادًا إلى تحليل المسارات، وجدنا أن الاستماتة الخلوية هي المسار الرئيسي، لذا بحثنا فيما إذا كان العلاج بـ IPA سيؤثر على استماتة الخلايا الجذعية المكونة للدم في المختبر. وقد أثبتنا سابقًا أن جرعات مختلفة من IPA (10 ميكرومولار، 100 ميكرومولار، و1 ملي مولار) غير سامة لخلايا LX-2 [15]. أظهرت هذه الدراسة أن العلاج بـ IPA بتركيزي 10 ميكرومولار و100 ميكرومولار زاد من عدد الخلايا الحية والميتة. مع ذلك، بالمقارنة مع المجموعة الضابطة، انخفضت حيوية الخلايا عند تركيز 1 ملي مولار من IPA، بينما بقي معدل نخر الخلايا دون تغيير (الشكل 2أ، ب). بعد ذلك، ولتحديد التركيز الأمثل لتحفيز الاستماتة الخلوية في خلايا LX-2، اختبرنا تراكيز 10 ميكرومولار، 100 ميكرومولار، و1 ملي مولار من IPA لمدة 24 ساعة (الشكل 2أ-هـ والشكل التكميلي 3أ-ب). ومن المثير للاهتمام أن تركيزي IPA 10 ميكرومتر و 100 ميكرومتر قللا من معدل موت الخلايا المبرمج (%)، ومع ذلك، فإن تركيز IPA 1 مليمتر زاد من موت الخلايا المبرمج المتأخر ومعدل موت الخلايا المبرمج (%) مقارنة بالتحكم، ولذلك تم اختياره لإجراء المزيد من التجارب (الشكل 2A-D).
يحفز IPA موت الخلايا المبرمج في خلايا LX-2. استُخدمت طريقة التلوين المزدوج باستخدام Annexin V و7-AAD لتحديد معدل موت الخلايا المبرمج وشكلها باستخدام قياس التدفق الخلوي. حُضنت خلايا BA مع 10 ميكرومتر، و100 ميكرومتر، و1 ملي مولار من IPA لمدة 24 ساعة، أو مع F–H TGF-β1 (5 نانوغرام/مل) و1 ملي مولار من IPA في وسط خالٍ من المصل لمدة 24 ساعة. أ: خلايا حية (Annexin V -/ 7AAD-)؛ ب: خلايا نخرية (Annexin V -/ 7AAD+)؛ ج، و: خلايا في المراحل المبكرة (Annexin V+/ 7AAD-)؛ د، ز: خلايا في المراحل المتأخرة (Annexin V+/7AAD+)؛ هـ، ح: النسبة المئوية للخلايا الميتة في المراحل المبكرة والمتأخرة من إجمالي معدل موت الخلايا المبرمج (%). تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري، ن = 3 تجارب مستقلة. أُجريت المقارنات الإحصائية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) مع اختبار بونفيروني اللاحق. *p < 0.05؛ ****p < 0.0001
كما أوضحنا سابقًا، يُمكن لـ 5 نانوغرام/مل من TGF-β1 أن يُحفز تنشيط الخلايا الجذعية المكونة للدم عن طريق زيادة التعبير عن جينات العلامات الكلاسيكية [15]. عُولجت خلايا LX-2 بـ 5 نانوغرام/مل من TGF-β1 و1 ملي مول من IPA معًا (الشكل 2E-H). لم يُغير العلاج بـ TGF-β1 معدل موت الخلايا المبرمج، إلا أن العلاج المشترك بـ IPA زاد من موت الخلايا المبرمج المتأخر ومعدل موت الخلايا المبرمج (%) مقارنةً بالعلاج بـ TGF-β1 وحده (الشكل 2E-H). تُشير هذه النتائج إلى أن 1 ملي مول من IPA يُمكنه تعزيز موت الخلايا المبرمج في خلايا LX-2 بشكل مستقل عن تحفيز TGF-β1.
أجرينا مزيدًا من البحث حول تأثير IPA على التنفس الميتوكوندري في خلايا LX-2. وأظهرت النتائج أن تركيز 1 ملي مولار من IPA قلل من معدل استهلاك الأكسجين (OCR) في المعايير التالية: التنفس غير الميتوكوندري، والتنفس القاعدي والأقصى، وتسرب البروتونات، وإنتاج ATP، مقارنةً بمجموعة التحكم (الشكل 3A، B)، بينما لم يتغير مؤشر الصحة الحيوية (BHI).
يُقلل IPA من التنفس الميتوكوندري في خلايا LX-2. يُعرض منحنى التنفس الميتوكوندري (OCR) كمعايير للتنفس الميتوكوندري (التنفس غير الميتوكوندري، التنفس القاعدي، التنفس الأقصى، تسرب البروتونات، إنتاج ATP، سعة الاحتياطي التنفسي، ومؤشر الصحة الحيوية). حُضنت الخلايا A وB مع 10 ميكرومولار، و100 ميكرومولار، و1 ملي مولار من IPA لمدة 24 ساعة، على التوالي. حُضنت الخلايا C وD مع TGF-β1 (5 نانوغرام/مل) و1 ملي مولار من IPA في وسط خالٍ من المصل لمدة 24 ساعة، على التوالي. نُظمت جميع القياسات وفقًا لمحتوى الحمض النووي باستخدام مجموعة CyQuant. BHI: مؤشر الصحة الحيوية؛ SRC: سعة الاحتياطي التنفسي؛ OCR: معدل استهلاك الأكسجين. تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري (SD)، n = 5 تجارب مستقلة. أُجريت المقارنات الإحصائية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه واختبار بونفيروني اللاحق. *p < 0.05؛ **p < 0.01؛ و***p < 0.001
للحصول على فهم أشمل لتأثير IPA على خصائص الطاقة الحيوية لخلايا LX-2 المنشطة بواسطة TGF-β1، قمنا بتحليل الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا باستخدام OCR (الشكل 3C، D). أظهرت النتائج أن المعالجة بـ TGF-β1 يمكن أن تقلل من التنفس الأقصى، وسعة الاحتياطي التنفسي (SRC)، ومؤشر صحة الرئة (BHI) مقارنةً بمجموعة التحكم (الشكل 3C، D). بالإضافة إلى ذلك، أدى العلاج المركب إلى انخفاض التنفس القاعدي، وتسرب البروتونات، وإنتاج ATP، ولكن سعة الاحتياطي التنفسي ومؤشر صحة الرئة كانا أعلى بشكل ملحوظ من تلك التي تم الحصول عليها عند المعالجة بـ TGF-β1 فقط (الشكل 3C، D).
أجرينا أيضًا "اختبار النمط الظاهري للطاقة الخلوية" المُقدم من برنامج Seahorse (الشكل التكميلي 4أ-د). وكما هو موضح في الشكل التكميلي 3ب، انخفض كل من معدل استهلاك الأكسجين (OCR) ومعدل إنتاج الحمض خارج الخلية (ECAR) بعد المعالجة بـ TGF-β1، ومع ذلك، لم يُلاحظ أي فرق في مجموعتي العلاج المُركب والعلاج بـ IPA مقارنةً بالمجموعة الضابطة. علاوة على ذلك، انخفض كل من مستوى OCR الأساسي ومستوى OCR تحت الإجهاد بعد العلاج المُركب والعلاج بـ IPA مقارنةً بالمجموعة الضابطة (الشكل التكميلي 4ج). ومن المثير للاهتمام، لوحظ نمط مماثل مع العلاج المُركب، حيث لم يُلاحظ أي تغيير في مستوى ECAR الأساسي ومستوى ECAR تحت الإجهاد مقارنةً بالمعالجة بـ TGF-β1 (الشكل التكميلي 4ج). في الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، لم يُؤثر انخفاض الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا وقدرة العلاج المُركب على استعادة معدل استهلاك الأكسجين (SCR) ومعدل إنتاج الحمض خارج الخلية (BHI) بعد التعرض للمعالجة بـ TGF-β1 على القدرة الأيضية (OCR وECAR). تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن IPA قد يقلل من الطاقة الحيوية في الخلايا الجذعية المكونة للدم، مما يشير إلى أن IPA قد يؤدي إلى انخفاض مستوى الطاقة الذي يحول النمط الظاهري للخلايا الجذعية المكونة للدم نحو التعطيل (الشكل التكميلي 4D).
تمّ التحقق من تأثير IPA على ديناميكيات الميتوكوندريا باستخدام قياس ثلاثي الأبعاد لشكل الميتوكوندريا وروابط الشبكة، بالإضافة إلى تلوين MTR (الشكل 4 والشكل التكميلي 5). يُظهر الشكل 4 أنه بالمقارنة مع المجموعة الضابطة، أدى العلاج بـ TGF-β1 إلى انخفاض متوسط ​​مساحة السطح، وعدد التفرعات، وإجمالي طول التفرعات، وعدد نقاط اتصال التفرعات (الشكل 4A وB)، وتغيير نسبة الميتوكوندريا من الشكل الكروي إلى الشكل المتوسط ​​(الشكل 4C). أدى العلاج بـ IPA فقط إلى انخفاض متوسط ​​حجم الميتوكوندريا وتغيير نسبة الميتوكوندريا من الشكل الكروي إلى الشكل المتوسط ​​مقارنةً بالمجموعة الضابطة (الشكل 4A). في المقابل، بقيت كروية الميتوكوندريا، ومتوسط ​​طول التفرعات، ونشاط الميتوكوندريا المُقاس بواسطة MTR المعتمد على جهد غشاء الميتوكوندريا (الشكل 4A وE) دون تغيير، ولم تختلف هذه المعايير بين المجموعات. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن العلاج بـ TGF-β1 و IPA يبدو أنه يعدل شكل وحجم الميتوكوندريا بالإضافة إلى تعقيد الشبكة في خلايا LX-2 الحية.
يُغير IPA ديناميكيات الميتوكوندريا ووفرة الحمض النووي للميتوكوندريا في خلايا LX-2. أ. صور مجهرية بؤرية نموذجية لخلايا LX-2 حية تم تحضينها مع TGF-β1 (5 نانوغرام/مل) و1 ملي مولار من IPA لمدة 24 ساعة في وسط خالٍ من المصل، تُظهر شبكات الميتوكوندريا المصبوغة بـ Mitotracker™ Red CMXRos والنوى المصبوغة باللون الأزرق باستخدام DAPI. احتوت جميع البيانات على 15 صورة على الأقل لكل مجموعة. تم الحصول على 10 صور متسلسلة على المحور Z لكل نوع عينة. احتوى كل تسلسل على المحور Z على 30 شريحة، بسماكة 9.86 ميكرومتر لكل شريحة. مقياس الرسم: 10 ميكرومتر. ب. أجسام نموذجية (الميتوكوندريا فقط) تم تحديدها بتطبيق عتبة تكيفية على الصورة. تم إجراء تحليل كمي ومقارنة لوصلات شبكة مورفولوجيا الميتوكوندريا لجميع الخلايا في كل مجموعة. ج. تردد نسب أشكال الميتوكوندريا. تشير القيم القريبة من الصفر إلى الأشكال الكروية، بينما تشير القيم القريبة من الواحد إلى الأشكال الخيطية. تم تحديد محتوى الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) كما هو موضح في قسم المواد والطرائق. أُجري تحليل Mitotracker™ Red CMXRos باستخدام قياس التدفق الخلوي (30,000 حدث) كما هو موضح في قسم المواد والطرائق. تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري، n = 3 تجارب مستقلة. أُجريت المقارنات الإحصائية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه واختبار بونفيروني اللاحق. *p < 0.05؛ **p < 0.01؛ ***p < 0.001؛ ****p < 0.0001
ثم قمنا بتحليل محتوى الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) في خلايا LX-2 كمؤشر على عدد الميتوكوندريا. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة، ازداد محتوى الحمض النووي للميتوكوندريا في المجموعة المعالجة بـ TGF-β1 (الشكل 4D). وبالمقارنة مع المجموعة المعالجة بـ TGF-β1، انخفض محتوى الحمض النووي للميتوكوندريا في مجموعة العلاج المركب (الشكل 4D)، مما يشير إلى أن IPA قد يقلل من محتوى الحمض النووي للميتوكوندريا، وربما من عدد الميتوكوندريا، بالإضافة إلى التنفس الميتوكوندري (الشكل 3C). علاوة على ذلك، بدا أن IPA يقلل من محتوى الحمض النووي للميتوكوندريا في العلاج المركب، لكنه لم يؤثر على نشاط الميتوكوندريا بوساطة MTR (الأشكال 4A-C).
درسنا العلاقة بين IPA ومستويات mRNA للجينات المرتبطة بالتليف، والاستماتة الخلوية، والبقاء، وديناميكيات الميتوكوندريا في خلايا LX-2 (الشكل 5A-D). بالمقارنة مع المجموعة الضابطة، أظهرت المجموعة المعالجة بـ TGF-β1 زيادة في التعبير عن جينات مثل سلسلة ألفا 2 من الكولاجين من النوع الأول (COL1A2)، وأكتين العضلات الملساء ألفا (αSMA)، وميتالوبروتينيز المصفوفة 2 (MMP2)، ومثبط الأنسجة لميتالوبروتينيز 1 (TIMP1)، وجين شبيه بالدينامين 1 (DRP1)، مما يشير إلى زيادة التليف والتنشيط. علاوة على ذلك، بالمقارنة مع المجموعة الضابطة، أدى العلاج بـ TGF-β1 إلى خفض مستويات mRNA لكل من مستقبل البريغنان X النووي (PXR)، وكاسبيز 8 (CASP8)، وMAPKAPK3، ومثبط عامل النسخ α للخلايا البائية، ومعزز الببتيد الخفيف لجين عامل النسخ النووي κ (NFκB1A)، ومثبط الوحدة الفرعية β لكيناز عامل النسخ النووي κB (IKBKB) (الشكل 5A-D). وبالمقارنة مع العلاج بـ TGF-β1 وحده، أدى العلاج المركب بـ TGF-β1 وIPA إلى خفض التعبير عن COL1A2 وMMP2، ولكنه زاد من مستويات mRNA لكل من PXR، وTIMP1، وبروتين اللمفوما للخلايا البائية-2 (BCL-2)، وCASP8، وNFκB1A، وNFκB1-β، وIKBKB. أدى العلاج بـ IPA إلى انخفاض ملحوظ في التعبير عن MMP2، والبروتين المرتبط بـ Bcl-2 (BAX)، وAKT1، وبروتين ضمور العصب البصري 1 (OPA1)، وبروتين اندماج الميتوكوندريا 2 (MFN2)، بينما ازداد التعبير عن CASP8، وNFκB1A، وNFκB1B، وIKBKB مقارنةً بمجموعة التحكم. مع ذلك، لم يُلاحظ أي اختلاف في التعبير عن كاسبيز-3 (CASP3)، وعامل تنشيط الببتيداز المبرمج 1 (APAF1)، وبروتين اندماج الميتوكوندريا 1 (MFN1)، وبروتين الانشطار 1 (FIS1). تشير هذه النتائج مجتمعةً إلى أن العلاج بـ IPA يُعدّل التعبير عن الجينات المرتبطة بالتليف، وموت الخلايا المبرمج، والبقاء على قيد الحياة، وديناميكيات الميتوكوندريا. تشير بياناتنا إلى أن العلاج بـ IPA يُقلل من التليف في خلايا LX-2؛ وفي الوقت نفسه، يُحفز البقاء على قيد الحياة عن طريق تحويل النمط الظاهري نحو التثبيط.
يُعدِّل IPA التعبير الجيني للخلايا الليفية، والخلايا الميتة، والخلايا الحية، وجينات ديناميكيات الميتوكوندريا في خلايا LX-2. تُظهر المدرجات التكرارية التعبير عن mRNA نسبةً إلى عنصر التحكم الداخلي (RPLP0 أو PPIA) بعد تحفيز خلايا LX-2 باستخدام TGF-β1 وIPA في وسط خالٍ من المصل لمدة 24 ساعة. يشير الحرف A إلى الخلايا الليفية، والحرف B إلى الخلايا الميتة، والحرف C إلى الخلايا الباقية، والحرف D إلى التعبير الجيني لديناميكيات الميتوكوندريا. تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري (SD)، n = 3 تجارب مستقلة. أُجريت المقارنات الإحصائية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) واختبار بونفيروني اللاحق. *p < 0.05؛ **p < 0.01؛ ***p < 0.001؛ ****p < 0.0001
بعد ذلك، تم تقييم التغيرات في حجم الخلية (FSC-H) وتعقيد السيتوبلازم (SSC-H) باستخدام قياس التدفق الخلوي (الشكل 6أ، ب)، كما تم تقييم التغيرات في مورفولوجيا الخلية بعد المعالجة بـ IPA باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) ومجهر التباين الطوري (الشكل التكميلي 6أ-ب). وكما هو متوقع، ازداد حجم الخلايا في المجموعة المعالجة بـ TGF-β1 مقارنةً بالمجموعة الضابطة (الشكل 6أ، ب)، مما يُظهر التوسع الكلاسيكي للشبكة الإندوبلازمية الخشنة (ER*) والجسيمات البلعمية (P)، مما يشير إلى تنشيط الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) (الشكل التكميلي 6أ). ومع ذلك، بالمقارنة مع المجموعة المعالجة بـ TGF-β1، انخفض حجم الخلية وتعقيد السيتوبلازم (الشكل 6أ، ب) ومحتوى ER* في مجموعة المعالجة المشتركة بـ TGF-β1 وIPA (الشكل التكميلي 6أ). علاوة على ذلك، أدى العلاج بـ IPA إلى انخفاض حجم الخلية، وتعقيد السيتوبلازم (الشكلان 6أ، 6ب)، ومحتوى P وER* (الشكل التكميلي 6أ) مقارنةً بمجموعة التحكم. بالإضافة إلى ذلك، ازداد محتوى الخلايا الميتة بعد 24 ساعة من العلاج بـ IPA مقارنةً بمجموعة التحكم (الأسهم البيضاء، الشكل التكميلي 6ب). تشير هذه النتائج مجتمعةً إلى أن تركيز 1 ملي مولار من IPA يحفز موت الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) ويعكس التغيرات في المعايير المورفولوجية للخلايا الناتجة عن TGF-β1، وبالتالي ينظم حجم الخلية وتعقيدها، وهو ما قد يرتبط بتعطيل الخلايا الجذعية المكونة للدم.
يُغير IPA حجم الخلية وتعقيد السيتوبلازم في خلايا LX-2. صور توضيحية لتحليل التدفق الخلوي. استخدم التحليل استراتيجية تحديد خاصة بخلايا LX-2: SSC-A/FSC-A لتحديد مجموعة الخلايا، وFSC-H/FSC-A لتحديد الخلايا المزدوجة، وSSC-H/FSC-H لتحليل حجم الخلية وتعقيدها. حُضنت الخلايا مع TGF-β1 (5 نانوغرام/مل) و1 ملي مول من IPA في وسط خالٍ من المصل لمدة 24 ساعة. وُزعت خلايا LX-2 في الربع السفلي الأيسر (SSC-H-/FSC-H-)، والربع العلوي الأيسر (SSC-H+/FSC-H-)، والربع السفلي الأيمن (SSC-H-/FSC-H+)، والربع العلوي الأيمن (SSC-H+/FSC-H+) لتحليل حجم الخلية وتعقيد السيتوبلازم. ب. تم تحليل مورفولوجيا الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي، وذلك باستخدام تقنيتي FSC-H (التشتت الأمامي، حجم الخلية) وSSC-H (التشتت الجانبي، تعقيد السيتوبلازم) (30000 حدث). تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري، n = 3 تجارب مستقلة. أُجريت المقارنات الإحصائية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) واختبار بونفيروني اللاحق. *p < 0.05؛ **p < 0.01؛ ***p < 0.001؛ ****p < 0.0001
أصبحت نواتج أيض الأمعاء، مثل IPA، موضوعًا بحثيًا هامًا، مما يشير إلى إمكانية اكتشاف أهداف جديدة في الميكروبات المعوية. ومن المثير للاهتمام أن IPA، وهو ناتج أيضي ربطناه بتليف الكبد لدى البشر [15]، قد ثبت أنه مركب مضاد للتليف محتمل في النماذج الحيوانية [13، 14]. هنا، نُظهر لأول مرة وجود ارتباط بين IPA في مصل الدم والنسخ الجيني للكبد ومثيلة الحمض النووي في الأفراد البدينين غير المصابين بداء السكري من النوع الثاني، مما يُسلط الضوء على موت الخلايا المبرمج، والالتهام الذاتي للميتوكوندريا، وطول العمر، بالإضافة إلى جين مرشح محتمل هو AKT1 الذي يُنظم استتباب الكبد. ومن الجوانب الجديدة الأخرى لدراستنا أننا أظهرنا تفاعل علاج IPA مع موت الخلايا المبرمج، وشكل الخلية، والطاقة الحيوية للميتوكوندريا وديناميكيتها في خلايا LX-2، مما يُشير إلى طيف طاقة منخفض يُحوّل نمط الخلايا النجمية الكبدية نحو التثبيط، مما يجعل IPA مرشحًا محتملاً لتحسين تليف الكبد.
وجدنا أن موت الخلايا المبرمج، والالتهام الذاتي للميتوكوندريا، وطول العمر، هي أهم المسارات الكلاسيكية المُثرية في جينات الكبد المرتبطة ببروتين IPA في مصل الدم. يمكن أن يؤدي اضطراب نظام مراقبة جودة الميتوكوندريا (MQC) إلى خلل في وظائف الميتوكوندريا، والالتهام الذاتي للميتوكوندريا، وموت الخلايا المبرمج، مما يعزز حدوث مرض الكبد المرتبط بالميتوكوندريا [33، 34]. لذلك، يمكننا التكهن بأن بروتين IPA قد يساهم في الحفاظ على ديناميكية الخلية وسلامة الميتوكوندريا من خلال موت الخلايا المبرمج، والالتهام الذاتي للميتوكوندريا، وطول العمر في الكبد. أظهرت بياناتنا أن جينين مشتركين بين الاختبارات الثلاثة: YKT6 وAKT1. تجدر الإشارة إلى أن YKT6 هو بروتين SNARE يشارك في عملية اندماج غشاء الخلية. يؤدي هذا البروتين دورًا في الالتهام الذاتي والالتهام الذاتي للميتوكوندريا من خلال تكوين مُركّب بدء مع STX17 وSNAP29 على الجسيم الذاتي، مما يُعزز اندماج الجسيمات الذاتية مع الليزوزومات[35]. علاوة على ذلك، يؤدي فقدان وظيفة YKT6 إلى خلل في الالتهام الذاتي للميتوكوندريا[36]، بينما يرتبط ارتفاع مستوى YKT6 بتطور سرطان الخلايا الكبدية، مما يُشير إلى زيادة بقاء الخلايا[37]. من ناحية أخرى، يُعد AKT1 الجين الأكثر تفاعلًا، ويلعب دورًا هامًا في أمراض الكبد، بما في ذلك مسار إشارات PI3K/AKT، ودورة الخلية، وهجرة الخلايا، وتكاثرها، والالتصاق البؤري، ووظيفة الميتوكوندريا، وإفراز الكولاجين[38-40]. يمكن لمسار إشارات PI3K/AKT المُنشَّط أن يُفعِّل الخلايا الجذعية المكونة للدم، وهي الخلايا المسؤولة عن إنتاج المادة الخلوية خارج الخلية، وقد يُسهم اختلال تنظيمه في حدوث وتطور تليف الكبد [40]. إضافةً إلى ذلك، يُعد AKT أحد عوامل بقاء الخلية الرئيسية التي تُثبِّط موت الخلايا المبرمج المعتمد على p53، وقد يرتبط تنشيط AKT بتثبيط موت خلايا الكبد المبرمج [41، 42]. تشير النتائج المُتحصَّل عليها إلى أنَّ IPA قد يُشارك في موت خلايا الكبد المبرمج المرتبط بالميتوكوندريا من خلال التأثير على قرار خلايا الكبد بين دخول الموت المبرمج أو البقاء. قد يتم تنظيم هذه التأثيرات بواسطة جينات AKT و/أو YKT6 المرشحة، والتي تُعدُّ بالغة الأهمية لاستتباب الكبد.
أظهرت نتائجنا أن تركيز 1 ملي مول من IPA يحفز موت الخلايا المبرمج ويقلل من التنفس الميتوكوندري في خلايا LX-2، بغض النظر عن المعالجة بـ TGF-β1. ومن الجدير بالذكر أن موت الخلايا المبرمج يُعد مسارًا رئيسيًا لزوال التليف وتنشيط الخلايا الجذعية المكونة للدم، كما أنه حدث محوري في الاستجابة الفسيولوجية العكسية لتليف الكبد [4، 43]. علاوة على ذلك، فإن استعادة BHI في خلايا LX-2 بعد المعالجة المركبة قد وفرت رؤى جديدة حول الدور المحتمل لـ IPA في تنظيم الطاقة الحيوية للميتوكوندريا. في الظروف الطبيعية وغير النشطة، تستخدم خلايا الدم عادةً الفسفرة التأكسدية الميتوكوندرية لإنتاج ATP، وتكون ذات نشاط أيضي منخفض. من ناحية أخرى، يُعزز تنشيط الخلايا الجذعية المكونة للدم التنفس الميتوكوندري والتخليق الحيوي لتعويض متطلبات الطاقة اللازمة للدخول في حالة التحلل السكري [44]. يشير عدم تأثير IPA على القدرة الأيضية ومعدل إنتاج الحمض خارج الخلية (ECAR) إلى أن مسار تحلل الجلوكوز أقل أهمية. وبالمثل، أظهرت دراسة أخرى أن تركيز 1 ملي مولار من IPA قادر على تعديل نشاط سلسلة التنفس الميتوكوندري في خلايا عضلة القلب، وخط خلايا الكبد البشرية (Huh7)، وخلايا بطانة الوريد السري البشري (HUVEC). مع ذلك، لم يُلاحظ أي تأثير لـ IPA على تحلل الجلوكوز في خلايا عضلة القلب، مما يوحي بأن IPA قد يؤثر على الطاقة الحيوية لأنواع أخرى من الخلايا [45]. لذلك، نفترض أن تركيز 1 ملي مولار من IPA قد يعمل كمُفَكِّك كيميائي خفيف، نظرًا لقدرته على تقليل التعبير الجيني المُحفِّز للتليف، وشكل الخلية، والطاقة الحيوية للميتوكوندريا بشكل ملحوظ دون تغيير كمية الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) [46]. يمكن لعوامل فصل الميتوكوندريا أن تثبط التليف الناجم عن الزراعة الخلوية وتنشيط الخلايا الجذعية المكونة للدم [47]، وأن تقلل من إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) في الميتوكوندريا، والذي تنظمه أو تحفزه بروتينات معينة مثل بروتينات الفصل (UCP) أو ناقل نيوكليوتيدات الأدينين (ANT). وبحسب نوع الخلية، قد تحمي هذه الظاهرة الخلايا من الموت المبرمج و/أو تعززه [46]. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتوضيح دور IPA كعامل فصل للميتوكوندريا في تعطيل الخلايا الجذعية المكونة للدم.
ثم بحثنا فيما إذا كانت التغيرات في التنفس الميتوكوندري تنعكس على مورفولوجيا الميتوكوندريا في خلايا LX-2 الحية. ومن المثير للاهتمام أن المعالجة بـ TGF-β1 تُغير نسبة الميتوكوندريا من كروية إلى متوسطة، مع انخفاض في تفرع الميتوكوندريا وزيادة في التعبير عن DRP1، وهو عامل رئيسي في انشطار الميتوكوندريا [48]. علاوة على ذلك، يرتبط تفتت الميتوكوندريا بتعقيد الشبكة بشكل عام، ويُعد الانتقال من الاندماج إلى الانشطار أمرًا بالغ الأهمية لتنشيط الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، في حين أن تثبيط انشطار الميتوكوندريا يؤدي إلى موت الخلايا الجذعية المكونة للدم [49]. وبالتالي، تشير نتائجنا إلى أن المعالجة بـ TGF-β1 قد تُحفز انخفاضًا في تعقيد شبكة الميتوكوندريا مع انخفاض في التفرع، وهو أمر أكثر شيوعًا في انشطار الميتوكوندريا المرتبط بالخلايا الجذعية المكونة للدم المنشطة (HSCs). علاوة على ذلك، أظهرت بياناتنا أن IPA قادر على تغيير نسبة الميتوكوندريا من الشكل الكروي إلى الشكل المتوسط، مما يقلل من التعبير عن OPA1 وMFN2. وقد أظهرت الدراسات أن تثبيط OPA1 قد يؤدي إلى انخفاض جهد غشاء الميتوكوندريا ويحفز موت الخلايا المبرمج [50]. ومن المعروف أن MFN2 يساهم في اندماج الميتوكوندريا وموت الخلايا المبرمج [51]. تشير النتائج التي تم الحصول عليها إلى أن تحفيز خلايا LX-2 بواسطة TGF-β1 و/أو IPA يُعدّل شكل الميتوكوندريا وحجمها، بالإضافة إلى حالة التنشيط وتعقيد الشبكة.
تشير نتائجنا إلى أن العلاج المركب باستخدام TGFβ-1 وIPA قد يُقلل من مستوى mtDNA والمعايير المورفولوجية للخلايا عن طريق تنظيم التعبير الجيني لـ mRNA للجينات المرتبطة بالتليف والاستماتة والبقاء في الخلايا التي تتجنب الاستماتة. في الواقع، خفض IPA مستوى التعبير الجيني لـ AKT1 وجينات التليف المهمة مثل COL1A2 وMMP2، ولكنه زاد من مستوى التعبير الجيني لـ CASP8، المرتبط بالاستماتة. أظهرت نتائجنا أنه بعد العلاج بـ IPA، انخفض التعبير الجيني لـ BAX وزاد التعبير الجيني لوحدات عائلة TIMP1 وBCL-2 وNF-κB، مما يشير إلى أن IPA قد يحفز إشارات البقاء في الخلايا الجذعية المكونة للدم التي تتجنب الاستماتة. قد تعمل هذه الجزيئات كإشارات داعمة للبقاء في الخلايا الجذعية المكونة للدم المنشطة، وهو ما قد يرتبط بزيادة التعبير عن البروتينات المضادة للاستماتة (مثل Bcl-2)، وانخفاض التعبير عن BAX المحفز للاستماتة، وتفاعل معقد بين TIMP وNF-κB [5، 7]. يُمارس IPA تأثيراته عبر PXR، وقد وجدنا أن العلاج المُركب بـ TGF-β1 وIPA يزيد من مستويات التعبير عن mRNA الخاص بـ PXR، مما يشير إلى تثبيط تنشيط الخلايا الجذعية المكونة للدم. من المعروف أن إشارات PXR المنشطة تُثبط تنشيط الخلايا الجذعية المكونة للدم في الجسم الحي وفي المختبر [52، 53]. تشير نتائجنا إلى أن IPA قد يُساهم في إزالة الخلايا الجذعية المكونة للدم المنشطة عن طريق تعزيز الاستماتة، وتقليل التليف واستقلاب الميتوكوندريا، وتعزيز إشارات البقاء، وهي عمليات نموذجية تُحوّل النمط الظاهري للخلايا الجذعية المكونة للدم المنشطة إلى نمط ظاهري غير نشط. ثمة تفسير محتمل آخر لآلية عمل IPA ودوره في موت الخلايا المبرمج، وهو أنه يتخلص من الميتوكوندريا المختلة وظيفيًا بشكل أساسي عبر الالتهام الذاتي للميتوكوندريا (المسار الداخلي) ومسار إشارات TNF الخارجي (الجدول 1)، المرتبط مباشرةً بمسار إشارات NF-κB للبقاء (الشكل التكميلي 7). ومن المثير للاهتمام أن الجينات المرتبطة بـ IPA قادرة على تحفيز إشارات مؤيدة لموت الخلايا المبرمج ومؤيدة للبقاء في مسار موت الخلايا المبرمج [54]، مما يشير إلى أن IPA قد يحفز مسار موت الخلايا المبرمج أو البقاء من خلال التفاعل مع هذه الجينات. ومع ذلك، لا تزال كيفية تحفيز IPA لموت الخلايا المبرمج أو البقاء أثناء تنشيط الخلايا الجذعية المكونة للدم وآليات عمله غير واضحة.
يُعدّ IPA مستقلباً ميكروبياً يتكون من التربتوفان الغذائي عبر الميكروبات المعوية. وقد أظهرت الدراسات أن له خصائص مضادة للالتهابات، ومضادة للأكسدة، ومنظمة للجينات في البيئة المعوية.[55] كما أظهرت الدراسات أن IPA قادر على تعديل وظيفة الحاجز المعوي وتقليل الإجهاد التأكسدي، مما قد يُسهم في تأثيراته الفسيولوجية الموضعية.[56] في الواقع، ينتقل IPA إلى الأعضاء المستهدفة عبر الدورة الدموية، ونظراً لتشابه بنيته الأيضية الرئيسية مع التربتوفان والسيروتونين ومشتقات الإندول، فإنه يُمارس تأثيرات أيضية تُؤدي إلى مسارات أيضية تنافسية.[52] قد يتنافس IPA مع المستقلبات المشتقة من التربتوفان على مواقع الارتباط على الإنزيمات أو المستقبلات، مما قد يُؤدي إلى تعطيل المسارات الأيضية الطبيعية. وهذا يُبرز الحاجة إلى مزيد من الدراسات حول حركيته الدوائية وديناميكيته الدوائية لفهم نطاقه العلاجي بشكل أفضل.[57] ويبقى أن نرى ما إذا كان هذا يحدث أيضاً في الخلايا الجذعية المكونة للدم.
نُقرّ بأن دراستنا لها بعض القيود. وللتحقق تحديدًا من الارتباطات المتعلقة بـ IPA، استبعدنا مرضى السكري من النوع الثاني. ونُقرّ بأن هذا يُحدّ من إمكانية تطبيق نتائجنا على نطاق واسع على مرضى السكري من النوع الثاني المصابين بأمراض الكبد المتقدمة. على الرغم من أن التركيز الفسيولوجي لـ IPA في مصل الدم البشري يتراوح بين 1 و10 ميكرومولار [11، 20]، فقد تم اختيار تركيز 1 ملي مولار من IPA بناءً على أعلى تركيز غير سام [15] وأعلى معدل للاستماتة الخلوية، دون أي اختلاف في نسبة الخلايا الميتة. مع أن مستويات IPA المستخدمة في هذه الدراسة كانت أعلى من المستويات الفسيولوجية، إلا أنه لا يوجد إجماع حاليًا بشأن الجرعة الفعالة لـ IPA [52]. على الرغم من أهمية نتائجنا، إلا أن المسار الأيضي الأوسع لـ IPA لا يزال مجالًا نشطًا للبحث. علاوة على ذلك، فإن نتائجنا المتعلقة بالارتباط بين مستويات IPA في المصل ومثيلة الحمض النووي في نسخ الكبد لم تُستخلص فقط من الخلايا الجذعية المكونة للدم، بل أيضًا من أنسجة الكبد. اخترنا استخدام خلايا LX-2 البشرية استنادًا إلى نتائجنا السابقة من تحليل النسخ الجيني التي تُشير إلى ارتباط IPA بتنشيط الخلايا الجذعية المكونة للدم [15]، وهذه الخلايا هي الخلايا الرئيسية المُشاركة في تطور تليف الكبد. يتكون الكبد من أنواع متعددة من الخلايا، لذا ينبغي النظر في نماذج خلوية أخرى، مثل نظام الزراعة المشتركة للخلايا الكبدية والخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا المناعية، بالإضافة إلى تنشيط الكاسبيز وتفتت الحمض النووي، وآلية العمل على مستوى البروتين، لدراسة دور IPA وتفاعله مع أنواع خلايا الكبد الأخرى.