نشكركم على زيارة موقع nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام أحدث إصدار من المتصفح (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). بالإضافة إلى ذلك، ولضمان استمرار الدعم، لن يتضمن هذا الموقع أنماط CSS أو JavaScript.
يُسبب كبريتيد الهيدروجين (H2S) العديد من التأثيرات الفسيولوجية والمرضية على جسم الإنسان. ويُستخدم هيدروسلفيد الصوديوم (NaHS) على نطاق واسع كأداة دوائية لتقييم تأثيرات H2S في التجارب البيولوجية. على الرغم من أن فقدان H2S من محاليل NaHS لا يستغرق سوى بضع دقائق، فقد استُخدمت هذه المحاليل كمواد مانحة لـ H2S في مياه الشرب في بعض الدراسات على الحيوانات. هدفت هذه الدراسة إلى التحقق مما إذا كان ماء الشرب المُحضر في زجاجات فئران/جرذان بتركيز 30 ميكرومول من NaHS يمكن أن يبقى مستقرًا لمدة 12-24 ساعة على الأقل، كما اقترح بعض الباحثين. تم تحضير محلول NaHS (30 ميكرومول) في ماء الشرب، ثم صُبَّ مباشرةً في زجاجات مياه الفئران/الجرذان. جُمعت عينات من طرف الزجاجة وداخلها عند 0، 1، 2، 3، 4، 5، 6، 12، و24 ساعة لقياس محتوى الكبريتيد باستخدام طريقة الميثيلين الأزرق. بالإضافة إلى ذلك، حُقنت ذكور وإناث الفئران بمحلول كبريتيد الصوديوم (NaHS) بتركيز 30 ميكرومولار لمدة أسبوعين، وقُيست تراكيز الكبريتيد في مصل الدم يومًا بعد يوم خلال الأسبوع الأول وفي نهاية الأسبوع الثاني. كان محلول كبريتيد الصوديوم في العينة المأخوذة من فوهة زجاجة الماء غير مستقر، حيث انخفض بنسبة 72% و75% بعد 12 و24 ساعة على التوالي. أما في العينات المأخوذة من داخل زجاجات الماء، فلم يكن انخفاض كبريتيد الصوديوم ملحوظًا خلال ساعتين، ولكنه انخفض بنسبة 47% و72% بعد 12 و24 ساعة على التوالي. لم يؤثر حقن كبريتيد الصوديوم على مستوى الكبريتيد في مصل دم ذكور وإناث الفئران. في الختام، لا ينبغي استخدام محاليل كبريتيد الصوديوم المُحضّرة من مياه الشرب للتبرع بكبريتيد الهيدروجين (H2S) نظرًا لعدم استقرار المحلول. ستؤدي هذه الطريقة في الإعطاء إلى تعريض الحيوانات لكميات غير منتظمة وأقل من المتوقع من كبريتيد الصوديوم.
استُخدم كبريتيد الهيدروجين (H2S) كمادة سامة منذ عام 1700؛ ومع ذلك، فقد وصف آبي وكيمورا دوره المحتمل كجزيء إشارة حيوية داخلي المنشأ في عام 1996. وعلى مدى العقود الثلاثة الماضية، تم توضيح العديد من وظائف H2S في مختلف الأنظمة البشرية، مما أدى إلى إدراك أن جزيئات مانحة H2S قد يكون لها تطبيقات سريرية في علاج أو إدارة بعض الأمراض؛ انظر تشيرينو وآخرون للاطلاع على مراجعة حديثة.
يُستخدم هيدروسلفيد الصوديوم (NaHS) على نطاق واسع كأداة دوائية لتقييم تأثيرات كبريتيد الهيدروجين (H2S) في العديد من الدراسات على مزارع الخلايا والحيوانات^5,6,7,8. ومع ذلك، لا يُعد NaHS مانحًا مثاليًا لـ H2S لأنه يتحول بسرعة إلى H2S/HS- في المحلول، ويتلوث بسهولة بالكبريتيدات المتعددة، ويتأكسد ويتطاير بسهولة^4,9. في العديد من التجارب البيولوجية، يُذاب NaHS في الماء، مما يؤدي إلى تطاير سلبي وفقدان H2S^10,11,12، وأكسدة تلقائية لـ H2S^11,12,13، وتحلل ضوئي¹⁴. يُفقد الكبريتيد في المحلول الأصلي بسرعة كبيرة بسبب تطاير H2S¹¹. في وعاء مفتوح، يبلغ نصف عمر H2S (t_1/2) حوالي 5 دقائق، وينخفض ​​تركيزه بنسبة 13% تقريبًا في الدقيقة¹⁰. على الرغم من أن فقدان كبريتيد الهيدروجين من محاليل كبريتيد الصوديوم (NaHS) لا يستغرق سوى بضع دقائق، فقد استخدمت بعض الدراسات على الحيوانات محاليل NaHS كمصدر لكبريتيد الهيدروجين في مياه الشرب لمدة تتراوح بين أسبوع واحد و21 أسبوعًا، مع استبدال المحلول المحتوي على NaHS كل 12-24 ساعة.^{15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26} لا تتوافق هذه الممارسة مع مبادئ البحث العلمي، إذ ينبغي أن تستند جرعات الأدوية إلى استخدامها في أنواع أخرى، وخاصة البشر.²⁷
يهدف البحث ما قبل السريري في الطب الحيوي إلى تحسين جودة رعاية المرضى أو نتائج العلاج. مع ذلك، لم تُترجم نتائج معظم الدراسات على الحيوانات إلى البشر بعد^28،29،30. أحد أسباب هذا القصور في الترجمة هو إهمال الجودة المنهجية للدراسات على الحيوانات³⁰. لذا، هدفت هذه الدراسة إلى التحقق مما إذا كانت محاليل NaHS بتركيز 30 ميكرومولار، المُحضّرة في زجاجات مياه خاصة بالفئران والجرذان، قادرة على البقاء مستقرة في مياه الشرب لمدة تتراوح بين 12 و24 ساعة، كما ورد في بعض الدراسات.
أُجريت جميع التجارب في هذه الدراسة وفقًا للمبادئ التوجيهية المنشورة لرعاية واستخدام حيوانات المختبر في إيران³¹. كما التزمت جميع التقارير التجريبية في هذه الدراسة بمبادئ ARRIVE التوجيهية³². وقد وافقت لجنة الأخلاقيات في معهد علوم الغدد الصماء، جامعة شهيد بهشتي للعلوم الطبية، على جميع الإجراءات التجريبية في هذه الدراسة.
تم شراء أسيتات الزنك ثنائي الهيدرات (CAS: 5970-45-6) وكلوريد الحديديك اللامائي (CAS: 7705-08-0) من شركة Biochem، Chemopahrama (كوسن سور لوار، فرنسا). كما تم شراء هيدرات كبريتيد الصوديوم (CAS: 207683-19-0) وN،N-ثنائي ميثيل-بارا-فينيلين ديامين (DMPD) (CAS: 535-47-0) من شركة Sigma-Aldrich (سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية). أما الإيزوفلوران فقد تم شراؤه من شركة Piramal (بيت لحم، بنسلفانيا، الولايات المتحدة الأمريكية). وتم شراء حمض الهيدروكلوريك (HCl) من شركة Merck (دارمشتات، ألمانيا).
حضّر محلولًا من كبريتيد الصوديوم (NaHS) بتركيز 30 ميكرومولار في ماء الشرب، ثم صبّه فورًا في زجاجات الماء الخاصة بالفئران/الجرذان. تم اختيار هذا التركيز بناءً على العديد من الدراسات المنشورة التي استخدمت كبريتيد الصوديوم كمصدر لكبريتيد الهيدروجين (H₂S)؛ انظر قسم المناقشة. كبريتيد الصوديوم جزيء مائي قد يحتوي على كميات متفاوتة من ماء التبلور (أي NaHS•xH₂O)؛ ووفقًا للشركة المصنعة، كانت نسبة كبريتيد الصوديوم المستخدمة في دراستنا 70.7% (أي NaHS•1.3 H₂O)، وقد أخذنا هذه القيمة في الحسبان في حساباتنا، حيث استخدمنا وزنًا جزيئيًا قدره 56.06 غ/مول، وهو الوزن الجزيئي لكبريتيد الصوديوم اللامائي. ماء التبلور (ويُسمى أيضًا ماء التبلور) هو جزيئات الماء التي تُكوّن البنية البلورية.³³ تتميز المركبات المائية بخصائص فيزيائية وديناميكية حرارية مختلفة عن المركبات اللامائية.³⁴
قبل إضافة كبريتيد الصوديوم (NaHS) إلى ماء الشرب، قِس درجة حموضة المذيب ودرجة حرارته. صبّ محلول كبريتيد الصوديوم مباشرةً في زجاجة الماء المخصصة للفئران/الجرذان داخل قفص الحيوانات. جُمعت عينات من طرف أنبوب الزجاجة ومن داخلها عند 0، 1، 2، 3، 4، 5، 6، 12، و24 ساعة لقياس محتوى الكبريتيد. أُجريت قياسات الكبريتيد مباشرةً بعد كل عملية أخذ عينة. أخذنا العينات من طرف الأنبوب لأن بعض الدراسات أظهرت أن صغر حجم مسام أنبوب الماء يُقلل من تبخر كبريتيد الهيدروجين (H2S)^15،19. يبدو أن هذه المشكلة تنطبق على المحلول الموجود في الزجاجة أيضًا. مع ذلك، لم يكن هذا هو الحال بالنسبة للمحلول الموجود في عنق الزجاجة، حيث كان معدل تبخره أعلى وكان يتأكسد تلقائيًا؛ في الواقع، شربت الحيوانات هذا الماء أولًا.
استُخدمت في هذه الدراسة فئران ويستار من الذكور والإناث. وُضعت الفئران في أقفاص من البولي بروبيلين (2-3 فئران في كل قفص) في ظروف قياسية (درجة حرارة 21-26 درجة مئوية، رطوبة 32-40%) مع 12 ساعة من الضوء (من 7 صباحًا إلى 7 مساءً) و12 ساعة من الظلام (من 7 مساءً إلى 7 صباحًا). أُتيح للفئران الوصول الحر إلى ماء الصنبور، وغُذيت بعلف قياسي (شركة خورك دام بارس، طهران، إيران). قُسّمت فئران ويستار من الإناث (عددها 10، وزن الجسم: 190-230 غرامًا) والذكور (عددها 10، وزن الجسم: 320-370 غرامًا)، المتطابقة في العمر (6 أشهر)، عشوائيًا إلى مجموعتين: مجموعة ضابطة ومجموعة مُعالجة بـ NaHS (30 ميكرومولار) (عددها 5 فئران في كل مجموعة). ولتحديد حجم العينة، استخدمنا منهجية KISS (اجعلها بسيطة قدر الإمكان)، التي تجمع بين الخبرة السابقة وتحليل القدرة الإحصائية. أجرينا أولًا دراسة تجريبية على 3 فئران، وحددنا متوسط ​​مستوى الكبريتيد الكلي في المصل وانحرافه المعياري (8.1 ± 0.81 ميكرومول). ثم، مع الأخذ في الاعتبار قوة إحصائية بنسبة 80% وافتراض مستوى دلالة ثنائي الجانب بنسبة 5%، حددنا حجم عينة أوليًا (n = 5 بناءً على الدراسات السابقة) يتوافق مع حجم تأثير معياري قدره 2.02، وهو القيمة المحددة مسبقًا التي اقترحها فيستينغ لحساب حجم عينة حيوانات التجارب³⁵. بعد ضرب هذه القيمة في الانحراف المعياري (2.02 × 0.81)، كان حجم التأثير القابل للكشف المتوقع (1.6 ميكرومول) 20%، وهو مقبول. هذا يعني أن n = 5/مجموعة كافٍ للكشف عن تغير متوسط ​​بنسبة 20% بين المجموعات. قُسّمت الفئران عشوائيًا إلى مجموعتين: مجموعة ضابطة ومجموعة مُعالجة بـ NaSH، باستخدام دالة التوزيع العشوائي في برنامج Excel³⁶ (الشكل التكميلي 1). تم إجراء عملية التعمية على مستوى النتائج، ولم يكن الباحثون الذين قاموا بإجراء القياسات البيوكيميائية على دراية بتوزيع المجموعات.
عُولجت مجموعات NaHS من كلا الجنسين بمحلول NaHS بتركيز 30 ميكرومولار مُحضر في ماء الشرب لمدة أسبوعين. ووُفر محلول جديد كل 24 ساعة، وخلال هذه الفترة قُيس وزن الجسم. جُمعت عينات دم من أطراف ذيول جميع الفئران تحت التخدير بالإيزوفلوران يومًا بعد يوم في نهاية الأسبوعين الأول والثاني. خُضعت عينات الدم للطرد المركزي بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق، وفُصل المصل وحُفظ عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لقياس اليوريا والكرياتينين (Cr) والكبريتيد الكلي في المصل لاحقًا. حُددت اليوريا في المصل بطريقة اليورياز الإنزيمية، وحُدد الكرياتينين في المصل بطريقة جافي الضوئية باستخدام مجموعات تجارية متوفرة (شركة مان، طهران، إيران) وجهاز تحليل آلي (Selectra E، الرقم التسلسلي 0-2124، هولندا). كانت معاملات التباين داخل وبين الاختبارات لليوريا والكرياتينين أقل من 2.5%.
تُستخدم طريقة الميثيلين الأزرق (MB) لقياس الكبريتيد الكلي في مياه الشرب ومصل الدم المحتوي على كبريتيد الصوديوم (NaHS). وتُعدّ هذه الطريقة الأكثر شيوعًا لقياس الكبريتيد في المحاليل السائبة والعينات البيولوجية^11،37. ويمكن استخدامها لتقدير إجمالي كمية الكبريتيد³⁸ وقياس الكبريتيدات غير العضوية على شكل كبريتيد الهيدروجين (H₂S) وأيون الكبريتيد (HS^-) والكبريتيد (S₂) في الطور المائي³⁹. في هذه الطريقة، يترسب الكبريت على شكل كبريتيد الزنك (ZnS) بوجود أسيتات الزنك^11،38. ويُعدّ ترسيب أسيتات الزنك الطريقة الأكثر استخدامًا لفصل الكبريتيدات عن الكروموفورات الأخرى¹¹. ثم يُعاد إذابة ZnS باستخدام حمض الهيدروكلوريك¹¹ في ظروف حمضية قوية. يتفاعل الكبريتيد مع DMPD بنسبة قياسية 1:2 في تفاعل محفز بواسطة كلوريد الحديديك (يعمل Fe3+ كعامل مؤكسد) لتكوين صبغة MB، والتي يتم الكشف عنها طيفيًا عند 670 نانومتر.^40,41 ويبلغ حد الكشف لطريقة MB حوالي 1 ميكرومول.¹¹
في هذه الدراسة، أُضيف 100 ميكرولتر من كل عينة (محلول أو مصل) إلى أنبوب، ثم أُضيف 200 ميكرولتر من أسيتات الزنك (1% وزن/حجم في الماء المقطر)، و100 ميكرولتر من DMPD (20 ملي مولار في 7.2 مولار حمض الهيدروكلوريك)، و133 ميكرولتر من FeCl3 (30 ملي مولار في 1.2 مولار حمض الهيدروكلوريك). حُضّن المزيج عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة. ثم خُضعت العينة للطرد المركزي عند 10000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق، وقُيس امتصاص الراسب عند 670 نانومتر باستخدام قارئ الميكروبليت (BioTek، MQX2000R2، وينوسكي، فيرمونت، الولايات المتحدة الأمريكية). حُددت تراكيز الكبريتيد باستخدام منحنى معايرة NaHS (0-100 ميكرومولار) في الماء المقطر (الشكل التكميلي 2). تم تحضير جميع المحاليل المستخدمة في القياسات حديثًا. بلغت معاملات التباين داخل الاختبار وبين الاختبارات لقياسات الكبريتيد 2.8% و3.4% على التوالي. كما قمنا بتحديد إجمالي الكبريتيد المستخلص من مياه الشرب المحتوية على ثيوسلفات الصوديوم وعينات المصل باستخدام طريقة العينة المدعمة⁴². بلغت نسب الاستخلاص لمياه الشرب المحتوية على ثيوسلفات الصوديوم وعينات المصل 91 ± 1.1% (ن = 6) و93 ± 2.4% (ن = 6) على التوالي.
أُجري التحليل الإحصائي باستخدام برنامج GraphPad Prism الإصدار 8.0.2 لنظام التشغيل Windows (GraphPad Software، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية، www.graphpad.com). استُخدم اختبار t المزدوج لمقارنة درجة حرارة ودرجة حموضة مياه الشرب قبل وبعد إضافة كبريتيد الصوديوم (NaHS). حُسب فقدان كبريتيد الهيدروجين (H2S) في المحلول المحتوي على NaHS كنسبة مئوية من الانخفاض عن مستوى الامتصاص الأساسي، ولتقييم ما إذا كان هذا الفقدان ذا دلالة إحصائية، أجرينا تحليل التباين أحادي الاتجاه للقياسات المتكررة (ANOVA) متبوعًا باختبار دنِت للمقارنات المتعددة. قورن وزن الجسم، ومستوى اليوريا في الدم، ومستوى الكرياتينين في الدم، ومستوى الكبريتيد الكلي في الدم بمرور الوقت بين فئران المجموعة الضابطة والفئران المعالجة بـ NaHS من الجنسين باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه المختلط (بين المجموعات وداخلها) متبوعًا باختبار بونفيروني اللاحق. اعتُبرت قيم P ذات الطرفين الأقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.
كان الرقم الهيدروجيني لمياه الشرب 7.60 ± 0.01 قبل إضافة كبريتيد الصوديوم (NaHS)، و7.71 ± 0.03 بعد إضافته (عدد العينات = 13، قيمة p = 0.0029). وكانت درجة حرارة مياه الشرب 26.5 ± 0.2 درجة مئوية، وانخفضت إلى 26.2 ± 0.2 درجة مئوية بعد إضافة كبريتيد الصوديوم (عدد العينات = 13، قيمة p = 0.0128). تم تحضير محلول كبريتيد الصوديوم بتركيز 30 ميكرومولار في مياه الشرب، وحُفظ في زجاجة ماء. يُعد محلول كبريتيد الصوديوم غير مستقر، ويتناقص تركيزه بمرور الوقت. عند أخذ عينة من عنق الزجاجة، لوحظ انخفاض ملحوظ (68.0%) خلال الساعة الأولى، وانخفض محتوى كبريتيد الصوديوم في المحلول بنسبة 72% و75% بعد 12 و24 ساعة على التوالي. في العينات المأخوذة من زجاجات المياه، لم يكن انخفاض تركيز كبريتيد الصوديوم (NaHS) ملحوظًا حتى ساعتين، ولكنه انخفض بنسبة 47% و72% بعد 12 و24 ساعة على التوالي. تشير هذه البيانات إلى أن نسبة كبريتيد الصوديوم في محلول تركيزه 30 ميكرومولار مُحضر في مياه الشرب قد انخفضت إلى ما يقارب ربع قيمتها الأولية بعد 24 ساعة، بغض النظر عن موقع أخذ العينة (الشكل 1).
استقرار محلول كبريتيد الصوديوم (30 ميكرومولار) في مياه الشرب في زجاجات مخصصة للفئران والجرذان. بعد تحضير المحلول، أُخذت عينات من طرف الزجاجة وداخلها. تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري (ن = 6/مجموعة). * و#، قيمة P < 0.05 مقارنةً بالوقت صفر. تُظهر صورة الزجاجة طرفها (مع فتحتها) وجسمها. يبلغ حجم الطرف حوالي 740 ميكرولتر.
بلغ تركيز كبريتيد الصوديوم (NaHS) في المحلول المُحضّر حديثًا بتركيز 30 ميكرومولار 30.3 ± 0.4 ميكرومولار (المدى: 28.7-31.9 ميكرومولار، ن = 12). مع ذلك، انخفض تركيز كبريتيد الصوديوم بعد 24 ساعة إلى قيمة أقل (المتوسط: 3.0 ± 0.6 ميكرومولار). وكما هو موضح في الشكل 2، لم تكن تراكيز كبريتيد الصوديوم التي تعرضت لها الفئران ثابتة خلال فترة الدراسة.
ازداد وزن إناث الجرذان بشكل ملحوظ مع مرور الوقت (من 205.2 ± 5.2 غرام إلى 213.8 ± 7.0 غرام في المجموعة الضابطة، ومن 204.0 ± 8.6 غرام إلى 211.8 ± 7.5 غرام في المجموعة المعالجة بـ NaHS)؛ ومع ذلك، لم يكن للمعالجة بـ NaHS أي تأثير على وزن الجسم (الشكل 3). وازداد وزن ذكور الجرذان بشكل ملحوظ مع مرور الوقت (من 338.6 ± 8.3 غرام إلى 352.4 ± 6.0 غرام في المجموعة الضابطة، ومن 352.4 ± 5.9 غرام إلى 363.2 ± 4.3 غرام في المجموعة المعالجة بـ NaHS)؛ ومع ذلك، لم يكن للمعالجة بـ NaHS أي تأثير على وزن الجسم (الشكل 3).
تغيرات وزن الجسم في إناث وذكور الجرذان بعد إعطاء NaHS (30 ميكرومول). تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط، وتمت مقارنتها باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه المختلط (داخل المجموعات وبينها) مع اختبار بونفيروني اللاحق. ن = 5 من كل جنس في كل مجموعة.
كانت تركيزات اليوريا وفوسفات الكرياتين في مصل الدم متقاربة في الفئران الضابطة والفئران المعالجة بـ NaSH طوال فترة الدراسة. علاوة على ذلك، لم يؤثر العلاج بـ NaSH على تركيزات اليوريا والكرياتين كروم في مصل الدم (الجدول 1).
كانت تراكيز الكبريتيد الكلية في مصل الدم الأساسية متقاربة بين ذكور وإناث الفئران المعالجة بـ NaHS (8.1 ± 0.5 ميكرومول مقابل 9.3 ± 0.2 ميكرومول) ومجموعات التحكم (9.1 ± 1.0 ميكرومول مقابل 6.1 ± 1.1 ميكرومول). لم يكن لإعطاء NaHS لمدة 14 يومًا أي تأثير على مستويات الكبريتيد الكلية في مصل الدم لدى ذكور وإناث الفئران (الشكل 4).
تغيرات تركيز الكبريتيد الكلي في مصل ذكور وإناث الجرذان بعد إعطاء كبريتيد الصوديوم (30 ميكرومول). تُعرض البيانات كمتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط، وتمت مقارنتها باستخدام تحليل التباين المختلط ثنائي الاتجاه (داخل المجموعة) مع اختبار بونفيروني اللاحق. لكل جنس، ن = 5/مجموعة.
الاستنتاج الرئيسي لهذه الدراسة هو أن مياه الشرب المحتوية على كبريتيد الصوديوم (NaHS) غير مستقرة: إذ لا يمكن الكشف إلا عن ربع محتوى الكبريتيد الكلي الأولي تقريبًا بعد 24 ساعة من أخذ العينات من طرف وداخل زجاجات مياه الفئران والجرذان. علاوة على ذلك، تعرضت الجرذان لتركيزات غير مستقرة من كبريتيد الصوديوم نتيجة فقدان كبريتيد الهيدروجين (H2S) في محلول كبريتيد الصوديوم، ولم تؤثر إضافة كبريتيد الصوديوم إلى مياه الشرب على وزن الجسم، أو مستوى اليوريا والكرياتين والكروم في الدم، أو مستوى الكبريتيد الكلي في الدم.
في هذه الدراسة، بلغ معدل فقدان كبريتيد الهيدروجين (H2S) من محاليل كبريتيد الصوديوم (NaHS) بتركيز 30 ميكرومولار، المُحضّرة في مياه الشرب، حوالي 3% في الساعة. وفي محلول مُنظّم (100 ميكرومولار من كبريتيد الصوديوم في 10 ملي مولار من محلول فوسفات مُخفّف، درجة حموضة 7.4)، لوحظ انخفاض تركيز الكبريتيد بنسبة 7% خلال 8 ساعات.¹¹ وقد سبق أن دافعنا عن إعطاء كبريتيد الصوديوم عن طريق الحقن داخل الصفاق، حيث ذكرنا أن معدل فقدان الكبريتيد من محلول كبريتيد الصوديوم بتركيز 54 ميكرومولار في مياه الشرب بلغ حوالي 2.3% في الساعة (4% في الساعة خلال الـ 12 ساعة الأولى، و1.4% في الساعة خلال الـ 12 ساعة الأخيرة بعد التحضير).⁸ ووجدت دراسات سابقة⁴³ فقدانًا مستمرًا لكبريتيد الهيدروجين من محاليل كبريتيد الصوديوم، ويعود ذلك أساسًا إلى التبخر والأكسدة. وحتى بدون إضافة فقاعات، يُفقد الكبريتيد في المحلول الأصلي بسرعة نتيجة لتبخر كبريتيد الهيدروجين.¹¹ أظهرت الدراسات أنه خلال عملية التخفيف، التي تستغرق حوالي 30-60 ثانية، يُفقد ما بين 5-10% من كبريتيد الهيدروجين (H2S) بسبب التبخر.⁶ ولمنع تبخر كبريتيد الهيدروجين من المحلول، اتخذ الباحثون عدة تدابير، منها التحريك اللطيف للمحلول،¹² وتغطية المحلول الأصلي بغشاء بلاستيكي،⁶ وتقليل تعرض المحلول للهواء، لأن معدل تبخر كبريتيد الهيدروجين يعتمد على السطح الفاصل بين الهواء والسائل.¹³ ويحدث التأكسد التلقائي لكبريتيد الهيدروجين بشكل رئيسي بسبب أيونات المعادن الانتقالية، وخاصة الحديديك، التي تُعد شوائب في الماء.¹³ ويؤدي تأكسد كبريتيد الهيدروجين إلى تكوين متعددات الكبريتيد (ذرات الكبريت المرتبطة بروابط تساهمية).¹¹ لتجنب أكسدته، تُحضّر محاليل تحتوي على كبريتيد الهيدروجين (H₂S) في مذيبات منزوعة الأكسجين⁴⁴،⁴⁵ ثم تُمرّر فيها غازات الأرجون أو النيتروجين لمدة ٢٠-٣٠ دقيقة لضمان إزالة الأكسجين.¹¹،¹²،³⁷،⁴⁴،⁴⁵،⁴⁶ حمض ثنائي إيثيلين ثلاثي أمين خماسي الأسيتيك (DTPA) هو عامل مخلبي للمعادن (١٠⁻⁴ مولار) يمنع الأكسدة الذاتية لأيون الكبريتيد (HS⁻) في المحاليل الهوائية. في غياب DTPA، يبلغ معدل الأكسدة الذاتية لأيون الكبريتيد حوالي ٥٠٪ خلال ٣ ساعات تقريبًا عند درجة حرارة ٢٥ درجة مئوية³⁷،⁴⁷. علاوة على ذلك، بما أن أكسدة الكبريتيد أحادي الإلكترون تُحفّزها الأشعة فوق البنفسجية، يجب تخزين المحلول على الجليد وحمايته من الضوء¹¹.
كما هو موضح في الشكل 5، يتفكك NaHS إلى Na+ وHS- عند ذوبانه في الماء؛ ويُحدد هذا التفكك بقيمة pK1 للتفاعل، وهي قيمة تعتمد على درجة الحرارة: pK1 = 3.122 + 1132/T، حيث تتراوح T من 5 إلى 30 درجة مئوية وتُقاس بالكلفن (K)، K = °C + 273.1548. يتميز HS- بقيمة pK2 عالية (pK2 = 19)، لذا عند درجة حموضة أقل من 96.49، لا يتكون S2- أو يتكون بكميات ضئيلة جدًا. في المقابل، يعمل HS- كقاعدة ويستقبل H+ من جزيء H2O، ويعمل H2O كحمض ويتحول إلى H2S وOH-.
تكوّن غاز كبريتيد الهيدروجين المذاب في محلول كبريتيد الصوديوم (30 ميكرومول). aq: محلول مائي؛ g: غاز؛ l: سائل. جميع الحسابات تفترض أن الرقم الهيدروجيني للماء يساوي 7.0 ودرجة حرارة الماء 20 درجة مئوية. تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com.
على الرغم من وجود أدلة تشير إلى عدم استقرار محاليل كبريتيد الصوديوم (NaHS)، فقد استخدمت العديد من الدراسات على الحيوانات هذه المحاليل في مياه الشرب كمركب مانح لكبريتيد الهيدروجين (H2S)^{15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26}، حيث تراوحت مدة التدخل من أسبوع إلى 21 أسبوعًا (الجدول 2). خلال هذه الدراسات، تم تجديد محلول NaHS كل 12 ساعة، أو 15، 17، 18، 24، 25 ساعة، أو كل 24 ساعة، أو 19، 20، 21، 22، 23 ساعة. أظهرت نتائجنا أن الفئران تعرضت لتركيزات غير مستقرة من الدواء نتيجة فقدان H2S من محلول NaHS، وأن محتوى NaHS في مياه شرب الفئران تذبذب بشكل ملحوظ على مدار 12 أو 24 ساعة (انظر الشكل 2). أشارت دراستان من هذه الدراسات إلى أن مستويات كبريتيد الهيدروجين (H2S) في الماء ظلت مستقرة على مدار 24 ساعة، أو أن فقدان 2-3% فقط من H2S لوحظ خلال 12 ساعة، لكنهما لم تقدما بيانات داعمة أو تفاصيل قياس. وأظهرت دراستان أن القطر الصغير لزجاجات المياه يمكن أن يقلل من تبخر H2S. ومع ذلك، أظهرت نتائجنا أن هذا قد يؤخر فقدان H2S من زجاجة الماء لمدة ساعتين فقط بدلاً من 12-24 ساعة. وتشير كلتا الدراستين إلى أننا نفترض أن مستوى كبريتيد الصوديوم (NaHS) في مياه الشرب لم يتغير لأننا لم نلاحظ تغيرًا في لون الماء؛ وبالتالي، فإن أكسدة H2S بواسطة الهواء لم تكن ذات أهمية. ومن المثير للدهشة أن هذه الطريقة الذاتية تقيّم استقرار NaHS في الماء بدلاً من قياس التغير في تركيزه بمرور الوقت.
يرتبط فقدان كبريتيد الهيدروجين (H2S) في محلول كبريتيد الصوديوم (NaHS) بدرجة الحموضة ودرجة الحرارة. وكما أشارت دراستنا، فإن إذابة كبريتيد الصوديوم في الماء تُنتج محلولًا قلويًا.⁵⁰ وعند إذابة كبريتيد الصوديوم في الماء، يعتمد تكوّن غاز كبريتيد الهيدروجين المذاب على قيمة درجة الحموضة.⁶ فكلما انخفضت درجة حموضة المحلول، زادت نسبة كبريتيد الصوديوم الموجودة على شكل جزيئات غاز كبريتيد الهيدروجين، وزاد فقدان الكبريتيد من المحلول المائي.¹¹ لم تُشر أي من هذه الدراسات إلى درجة حموضة مياه الشرب المستخدمة كمذيب لكبريتيد الصوديوم. ووفقًا لتوصيات منظمة الصحة العالمية، المعتمدة في معظم البلدان، يجب أن تتراوح درجة حموضة مياه الشرب بين 6.5 و8.5.¹ في هذا النطاق من درجة الحموضة، يزداد معدل الأكسدة التلقائية لكبريتيد الهيدروجين بمقدار عشرة أضعاف تقريبًا.¹³ يؤدي إذابة كبريتيد الصوديوم (NaHS) في الماء ضمن هذا النطاق من الرقم الهيدروجيني إلى تركيز غاز كبريتيد الهيدروجين (H2S) المذاب يتراوح بين 1 و22.5 ميكرومول، مما يؤكد أهمية مراقبة الرقم الهيدروجيني للماء قبل إذابة كبريتيد الصوديوم. إضافةً إلى ذلك، فإن نطاق درجة الحرارة المذكور في الدراسة السابقة (18-26 درجة مئوية) سيؤدي إلى تغيير في تركيز غاز كبريتيد الهيدروجين المذاب في المحلول بنسبة 10% تقريبًا، نظرًا لأن تغيرات درجة الحرارة تؤثر على قيمة pK1، ويمكن أن يكون للتغيرات الطفيفة في قيمة pK1 تأثير كبير على تركيز غاز كبريتيد الهيدروجين المذاب. كما أن طول مدة بعض الدراسات (5 أشهر)، والتي يُتوقع خلالها حدوث تقلبات كبيرة في درجة الحرارة، يزيد من حدة هذه المشكلة.
استخدمت جميع الدراسات، باستثناء دراسة واحدة²¹، محلول NaHS بتركيز 30 ميكرومولار في مياه الشرب. ولتفسير الجرعة المستخدمة (30 ميكرومولار)، أشار بعض الباحثين إلى أن NaHS في الطور المائي يُنتج نفس تركيز غاز H₂S، وأن النطاق الفسيولوجي لـ H₂S يتراوح بين 10 و100 ميكرومولار، وبالتالي فإن هذه الجرعة تقع ضمن النطاق الفسيولوجي^15،16. بينما أوضح آخرون أن 30 ميكرومولار من NaHS يُمكن أن يُحافظ على مستوى H₂S في البلازما ضمن النطاق الفسيولوجي، أي بين 5 و300 ميكرومولار^19،20. نعتمد في هذه الدراسة تركيز NaHS في الماء البالغ 30 ميكرومولار (الأس الهيدروجيني = 7.0، درجة الحرارة = 20 درجة مئوية)، والذي استُخدم في بعض الدراسات لدراسة تأثيرات H₂S. ويمكننا حساب أن تركيز غاز H₂S المذاب يبلغ 14.7 ميكرومولار، أي ما يُعادل 50% تقريبًا من تركيز NaHS الأولي. هذه القيمة مشابهة للقيمة التي حسبها مؤلفون آخرون في ظل نفس الظروف 13،48.
في دراستنا، لم يُحدث إعطاء كبريتيد الصوديوم (NaHS) أي تغيير في وزن الجسم؛ وتتفق هذه النتيجة مع نتائج دراسات أخرى أُجريت على ذكور الفئران^22،23 وذكور الجرذان¹⁸. مع ذلك، أشارت دراستان إلى أن كبريتيد الصوديوم (NaSH) أعاد الوزن المنخفض إلى وزن الجسم لدى الجرذان المستأصلة الكلية^24،26، بينما لم تُشر دراسات أخرى إلى تأثير إعطاء كبريتيد الصوديوم على وزن الجسم^{15،16،17،19،20،21،25}. علاوة على ذلك، لم يؤثر إعطاء كبريتيد الصوديوم في دراستنا على مستويات اليوريا والكرياتين والكروم في الدم، وهو ما يتفق مع نتائج دراسة أخرى²⁵.
أظهرت الدراسة أن إضافة كبريتيد الصوديوم (NaHS) إلى مياه الشرب لمدة أسبوعين لم تؤثر على تركيز الكبريتيد الكلي في مصل دم ذكور وإناث الجرذان. تتوافق هذه النتيجة مع نتائج سين وآخرون (16): حيث لم يؤثر العلاج لمدة 8 أسابيع بتركيز 30 ميكرومول من كبريتيد الصوديوم في مياه الشرب على مستويات الكبريتيد في بلازما فئران المجموعة الضابطة؛ ومع ذلك، فقد أفادوا بأن هذا التدخل أعاد مستويات كبريتيد الهيدروجين (H2S) المنخفضة في بلازما الفئران المستأصلة الكلية إلى وضعها الطبيعي. كما أفاد لي وآخرون (22) أن العلاج بتركيز 30 ميكرومول من كبريتيد الصوديوم في مياه الشرب لمدة 5 أشهر زاد من مستويات الكبريتيد الحر في بلازما الفئران المسنة بنحو 26%. ولم تُبلغ دراسات أخرى عن أي تغييرات في الكبريتيد المتداول بعد إضافة كبريتيد الصوديوم إلى مياه الشرب.
أشارت سبع دراسات إلى استخدام سيجما NaHS^{15،16،19،20،21،22،23}، لكنها لم تُقدّم تفاصيل إضافية حول ماء التميؤ، كما لم تُشر خمس دراسات إلى مصدر NaHS المُستخدم في طرق تحضيرها^{17،18،24،25،26}. يُعدّ NaHS جزيئًا مُميأً، وقد يختلف محتواه من ماء التميؤ، مما يؤثر على كمية NaHS اللازمة لتحضير محلول بتركيز مولاري مُحدد. على سبيل المثال، كان محتوى NaHS في دراستنا NaHS•1.3 H₂O. لذا، قد تكون تراكيز NaHS الفعلية في هذه الدراسات أقل من تلك المُبلغ عنها.
تساءل بوزغاي وزملاؤه²¹: "كيف يمكن لمركب قصير العمر أن يُحدث تأثيرًا طويل الأمد؟" عند تقييمهم لتأثيرات كبريتيد الصوديوم (NaHS) على التهاب القولون لدى الفئران. ويأملون أن تتمكن الدراسات المستقبلية من الإجابة على هذا السؤال، ويتكهنون بأن محاليل كبريتيد الصوديوم قد تحتوي على مركبات متعددة الكبريتيد أكثر استقرارًا، بالإضافة إلى كبريتيد الهيدروجين (H₂) وثنائي الكبريتيد التي تتوسط تأثير كبريتيد الصوديوم²¹. وثمة احتمال آخر، وهو أن التركيزات المنخفضة جدًا من كبريتيد الصوديوم المتبقية في المحلول قد يكون لها تأثير مفيد أيضًا. في الواقع، قدم أولسون وزملاؤه أدلة على أن مستويات كبريتيد الهيدروجين في الدم، التي تبلغ ميكرومولار، ليست فسيولوجية، وينبغي أن تكون في نطاق النانومولار أو غائبة تمامًا¹³. قد يعمل كبريتيد الهيدروجين من خلال كبرتة البروتين، وهي تعديل عكسي بعد الترجمة يؤثر على وظيفة واستقرار وتمركز العديد من البروتينات^52،53،54. في الواقع، في ظل الظروف الفسيولوجية، تتراوح نسبة البروتينات الكبدية المكبرتة بين 10% و25%⁵³. تُقرّ كلتا الدراستين بالتدمير السريع لمركب NaHS19,23، لكنهما تُشيران بشكلٍ مُثير للدهشة إلى أنهما "تحكّما في تركيز NaHS في مياه الشرب عن طريق استبداله يوميًا".23 وقد ذكرت إحدى الدراسات عن طريق الخطأ أن "NaHS هو مُعطي قياسي لـ H2S ويُستخدم عادةً في الممارسة السريرية لاستبدال H2S نفسه".18
تُبين المناقشة السابقة أن كبريتيد الصوديوم (NaHS) يُفقد من المحلول عبر التبخر والأكسدة والتحلل الضوئي، ولذا تُقدم بعض الاقتراحات للحد من فقدان كبريتيد الهيدروجين (H2S) من المحلول. أولًا، يعتمد تبخر H2S على السطح الفاصل بين الغاز والسائل¹³ ودرجة حموضة المحلول¹¹؛ لذا، ولتقليل الفقد بالتبخر، يُمكن تصغير عنق زجاجة الماء قدر الإمكان كما ذُكر سابقًا¹⁵،¹⁹، كما يُمكن ضبط درجة حموضة الماء ضمن حد أعلى مقبول (أي 6.5-8.5)¹¹. ثانيًا، تحدث الأكسدة التلقائية لـ H2S نتيجة لتأثيرات الأكسجين ووجود أيونات المعادن الانتقالية في مياه الشرب¹³، لذا يُمكن إزالة الأكسجين من مياه الشرب باستخدام الأرجون أو النيتروجين⁴⁴،⁴⁵ واستخدام عوامل استخلاب المعادن³⁷،⁴⁷ للحد من أكسدة الكبريتيدات. ثالثًا، لمنع التحلل الضوئي لكبريتيد الهيدروجين، يمكن تغليف زجاجات المياه بورق الألومنيوم؛ وينطبق هذا الإجراء أيضًا على المواد الحساسة للضوء مثل الستربتوزوتوسين⁵⁵. أخيرًا، يمكن إعطاء أملاح الكبريتيد غير العضوية (NaHS، Na2S، وCaS) عن طريق التغذية القسرية بدلًا من إذابتها في مياه الشرب كما ذُكر سابقًا^{56، 57، 58}؛ فقد أظهرت الدراسات أن كبريتيد الصوديوم المشع المُعطى عن طريق التغذية القسرية للفئران يُمتص جيدًا ويتوزع في جميع الأنسجة تقريبًا⁵⁹. حتى الآن، أُجريت معظم الدراسات على إعطاء أملاح الكبريتيد غير العضوية عن طريق الحقن داخل الصفاق؛ ومع ذلك، نادرًا ما يُستخدم هذا المسار في البيئات السريرية⁶⁰. من ناحية أخرى، يُعدّ المسار الفموي هو المسار الأكثر شيوعًا والمفضل للإعطاء لدى البشر⁶¹. لذلك، نوصي بتقييم آثار مانحات كبريتيد الهيدروجين في القوارض عن طريق التغذية القسرية الفموية.
من بين القيود التي واجهناها قياس الكبريتيد في المحلول المائي والمصل باستخدام طريقة الميثيلين الأزرق. تشمل طرق قياس الكبريتيد معايرة اليود، وقياس الطيف الضوئي، والطريقة الكهروكيميائية (قياس الجهد، وقياس التيار، والطريقة الكولومترية، والطريقة الأمبيرومترية)، والكروماتوغرافيا (الكروماتوغرافيا الغازية والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء)، وتُعد طريقة الميثيلين الأزرق الطيفية الأكثر شيوعًا⁶². ومن قيود طريقة الميثيلين الأزرق لقياس كبريتيد الهيدروجين في العينات البيولوجية أنها تقيس جميع المركبات المحتوية على الكبريت وليس كبريتيد الهيدروجين الحر⁶³، وذلك لأنها تُجرى في ظروف حمضية، مما يؤدي إلى استخلاص الكبريت من المصدر البيولوجي⁶⁴. مع ذلك، ووفقًا للجمعية الأمريكية للصحة العامة، تُعد طريقة الميثيلين الأزرق الطريقة القياسية لقياس الكبريتيد في الماء⁶⁵. لذا، لا يؤثر هذا القيد على نتائجنا الرئيسية المتعلقة بعدم استقرار المحاليل المحتوية على كبريتيد الصوديوم. علاوة على ذلك، في دراستنا، بلغت نسبة استرداد قياسات الكبريتيد في عينات الماء والمصل المحتوية على كبريتيد الصوديوم 91% و93% على التوالي. تتوافق هذه القيم مع النطاقات المُبلغ عنها سابقًا (77-92)⁶⁶، مما يدل على دقة تحليلية مقبولة⁴². تجدر الإشارة إلى أننا استخدمنا ذكورًا وإناثًا من الفئران وفقًا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) لتجنب الاعتماد المفرط على الدراسات الحيوانية التي تقتصر على الذكور فقط في الدراسات قبل السريرية⁶⁷، ولإدراج كلا الجنسين من الفئران كلما أمكن⁶⁸. وقد أكد باحثون آخرون على هذه النقطة^69،70،71.
في الختام، تشير نتائج هذه الدراسة إلى أن محاليل كبريتيد الصوديوم المُحضّرة من مياه الشرب لا يمكن استخدامها لتوليد كبريتيد الهيدروجين نظرًا لعدم استقرارها. إذ أن هذه الطريقة في الإعطاء تُعرّض الحيوانات لمستويات غير مستقرة وأقل من المتوقع من كبريتيد الصوديوم؛ لذا، قد لا تنطبق هذه النتائج على البشر.
تتوفر مجموعات البيانات المستخدمة و/أو التي تم تحليلها خلال الدراسة الحالية من المؤلف المسؤول عند الطلب المعقول.
سزابو، ك. التسلسل الزمني لأبحاث كبريتيد الهيدروجين (H2S): من سم بيئي إلى وسيط بيولوجي. الكيمياء الحيوية وعلم الأدوية 149، 5-19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
آبي، ك. وكيمورا، هـ. الدور المحتمل لكبريتيد الهيدروجين كمعدل عصبي داخلي. مجلة علم الأعصاب، 16، 1066-1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
شيرينو، جي.، سزابو، سي.، وبابابتروبولوس، أ. الدور الفسيولوجي لكبريتيد الهيدروجين في خلايا وأنسجة وأعضاء الثدييات. مراجعات في علم وظائف الأعضاء والبيولوجيا الجزيئية 103، 31-276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
ديلون، ك.م.، كارازوني، ر.ج.، ماتسون، ج.ب.، وكاشفي، ك. التطور الواعد لأنظمة توصيل أكسيد النيتريك وكبريتيد الهيدروجين عبر الخلايا: عصر جديد من الطب الشخصي. الكيمياء الحيوية وعلم الأدوية 176، 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
صن، إكس، وآخرون. يمكن للإعطاء طويل الأمد لمُعطي كبريتيد الهيدروجين بطيء الإطلاق أن يمنع إصابة نقص التروية/إعادة التروية في عضلة القلب. التقارير العلمية 7، 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
سيتديكوفا، جي إف، فوكس، آر، كاينز، دبليو، ويجر، تي إم، وهيرمان، إيه. فسفرة قناة BK تنظم حساسية كبريتيد الهيدروجين (H2S). فرونتيرز إن فيزيولوجي 5، 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
سيتديكوفا، جي إف، ويجر، تي إم، وهيرمان، إيه. يعزز كبريتيد الهيدروجين نشاط قنوات البوتاسيوم المنشطة بالكالسيوم (BK) في خلايا ورم الغدة النخامية لدى الفئران. أرشيف بفلوجر. 459، 389-397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
جيدي، س.، وآخرون. يعزز كبريتيد الهيدروجين التأثير الوقائي للنتريت ضد إصابة نقص التروية وإعادة التروية في عضلة القلب لدى فئران مصابة بداء السكري من النوع الثاني. أكسيد النيتريك 124، 15-23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
كورفينو، أ.، وآخرون. اتجاهات كيمياء مانح كبريتيد الهيدروجين وتأثيرها على أمراض القلب والأوعية الدموية. مضادات الأكسدة 10، 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
دي ليون، إي آر، ستوي، جي إف، وأولسون، كيه آر (2012). الفقد السلبي لكبريتيد الهيدروجين في التجارب البيولوجية. الكيمياء الحيوية التحليلية 421، 203-207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
ناجي، ب.، وآخرون. الجوانب الكيميائية لقياسات كبريتيد الهيدروجين في العينات الفيزيولوجية. مجلة بيوشيميكا وبيوفيزيكال أكتا 1840، 876-891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
كلاين، دكتوراه في القانون. التحديد الطيفي لكبريتيد الهيدروجين في المياه الطبيعية. علم البحيرات وعلم المحيطات 14، 454-458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
أولسون، ك. ر. (2012). التدريب العملي في كيمياء وبيولوجيا كبريتيد الهيدروجين. "مضادات الأكسدة". إشارات الأكسدة والاختزال. 17، 32-44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).