يُعدّ فرز البروتينات في المسار الإفرازي ضروريًا للحفاظ على تنظيم الخلية وتوازنها. وبالإضافة إلى الفرز الذي تتوسطه الأغلفة، فإن دور الدهون في فرز الكينيسين خلال عملية النقل الإفرازي يُمثّل سؤالًا أساسيًا مطروحًا منذ زمن طويل ولم تتم الإجابة عليه بعد. في هذه الدراسة، أجرينا تصويرًا ثلاثي الأبعاد متزامنًا متعدد الألوان عالي الدقة في الوقت الحقيقي لإثبات أن البروتينات المُصنّعة حديثًا والمثبتة على غليكوزيل فوسفاتيديل إينوزيتول، والتي تحتوي على جزيئات سيراميد دهنية طويلة جدًا، تتجمع وتُصنّف في مواقع خروج متخصصة في الشبكة الإندوبلازمية، تختلف عن تلك التي تستخدمها البروتينات الغشائية. علاوة على ذلك، أظهرنا أن طول سلسلة السيراميد في غشاء الشبكة الإندوبلازمية يُعدّ عاملًا حاسمًا في انتقائية هذا الفرز. تُقدّم دراستنا أول دليل مباشر في الجسم الحي لتصنيف شحنات البروتينات بناءً على طول سلسلة الدهون إلى مواقع تصدير انتقائية في المسار الإفرازي.
في الخلايا حقيقية النواة، تُفرز البروتينات المُصنّعة في الشبكة الإندوبلازمية أثناء نقلها عبر المسار الإفرازي لتوصيلها إلى وجهتها الخلوية المناسبة (1). بالإضافة إلى الفرز بواسطة الغلاف، كان يُعتقد منذ زمن طويل أن بعض الدهون يمكن أن تعمل أيضًا كنقاط خروج انتقائية من خلال تجميعها في نطاقات غشائية محددة لبروتينات معينة (2-5). ومع ذلك، لا يزال هناك نقص في الأدلة الحية المباشرة لإثبات هذه الآلية المحتملة القائمة على الدهون. لحل هذه المشكلة الأساسية، درسنا في الخميرة كيفية تصدير البروتينات المرتبطة بالجليكوزيل فوسفاتيديل إينوزيتول (GPI-APs) بشكل تفاضلي من الشبكة الإندوبلازمية. تُعد GPI-APs مجموعة متنوعة من بروتينات سطح الخلية المرتبطة بالدهون (6، 7). GPI-AP هو بروتين مُفرز يرتبط بالطبقات الخارجية للغشاء البلازمي من خلال جزء الجليكوليبيد (مرساة GPI). تقبل هذه البروتينات روابط GPI كتعديلات محافظة بعد الترجمة في تجويف الشبكة الإندوبلازمية (8). بعد الارتباط، يمر بروتين GPI-AP عبر جهاز جولجي (5، 9) من الشبكة الإندوبلازمية إلى الغشاء البلازمي. يؤدي وجود روابط GPI إلى نقل بروتين GPI-AP بشكل منفصل عن البروتينات المفرزة عبر الغشاء (بما في ذلك بروتينات الغشاء البلازمي الأخرى) على طول المسار الإفرازي (5، 9، 10). في خلايا الخميرة، يتم فصل بروتينات GPI-AP عن البروتينات المفرزة الأخرى في الشبكة الإندوبلازمية، ثم تُعبأ في حويصلات فريدة مغلفة بمركب البروتين الغلافي II (COPII) (6، 7). لا تزال محددات عملية التصنيف هذه في عملية تصدير الشبكة الإندوبلازمية غير واضحة، ولكن يُعتقد أن هذه الآلية قد تتطلب وجود الدهون، وخاصة إعادة تشكيل الجزء الدهني من رابط GPI (5، 8). في الخميرة، تبدأ عملية إعادة تشكيل دهون GPI فور ارتباطها، وفي كثير من الحالات، تؤدي إلى ارتباط السيراميد بالحمض الدهني المشبع ذي السلسلة الطويلة المكونة من 26 ذرة كربون (C26:0) (11، 12). يُعد سيراميد C26 السيراميد الرئيسي الذي تنتجه خلايا الخميرة حتى الآن. يُصنّع في الشبكة الإندوبلازمية، ويُصدّر معظمه إلى جهاز جولجي عبر حويصلات COPII (13). يتطلب تصدير GPI-AP من الشبكة الإندوبلازمية على وجه التحديد استمرار تخليق السيراميد (14، 15)، وبدوره، يعتمد تحويل السيراميد إلى سيراميد فوسفات الإينوزيتول (IPC) في جهاز جولجي على تخليق مرساة GPI (16). أظهرت الدراسات الفيزيائية الحيوية باستخدام أغشية اصطناعية أن السيراميدات ذات السلاسل الأسيلية الطويلة جدًا يمكن أن تتحد لتكوين نطاقات منظمة ذات خصائص فيزيائية فريدة (17، 18). تُشير هذه البيانات إلى فرضية مفادها أن سيراميد C26 وGPI-AP المرتبط به يستخدمان خصائصهما الفيزيائية للتجمع في مناطق مُنتظمة أو مناطق ضمن بيئة دهون غشاء الشبكة الإندوبلازمية غير المُنتظمة نسبيًا. ويتكون هذا الغشاء بشكل أساسي من جليسروليبيدات قصيرة وغير مُشبعة (C16:1 وC18:1) (19، 20). وتتركز هذه المناطق بشكل انتقائي على مواقع خروج مُحددة من الشبكة الإندوبلازمية (ERES)، حيث يُمكن نقل السيراميد وGPI-AP المُعتمد على السيراميد معًا إلى جهاز جولجي في نفس الحويصلة COPII المُخصصة (5).
في هذه الدراسة، قمنا باختبار هذه الآلية القائمة على الدهون بشكل مباشر باستخدام مجهر التصوير البؤري فائق الدقة في الوقت الحقيقي (SCLIM)، وهي تقنية مجهرية متطورة يمكنها مراقبة البروتينات الموسومة بالفلورة في وقت واحد. تتميز الصور ثلاثية الألوان وثلاثية الأبعاد (3D) بدقة وسرعة عاليتين للغاية في الخلايا الحية (21، 22).
استخدمنا في البداية تقنية SCLIM لتحديد كيفية تمييز بروتين GPI-AP الطبيعي ذي مجموعة سيراميد C26 عن البروتينات المُفرزة عبر الغشاء بعد خروجها من الشبكة الإندوبلازمية في الخميرة S. cerevisiae. وللتحقق من تصنيف الشبكة الإندوبلازمية، استخدمنا نظامًا وراثيًا يُتيح رؤية الحمولة المُصنّعة حديثًا وهي تدخل إلى مواقع خروج الشبكة الإندوبلازمية (ERES) داخل الخلية الحية (7، 23). اخترنا كحمولة بروتين GPI-AP Gas1 المُعتمد على سيراميد C26 والموسوم ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)، وبروتين Mid2 المُفرز عبر الغشاء والموسوم ببروتين الفلورسنت القريب من الأشعة تحت الحمراء (iRFP)، وكلاهما يستهدف الغشاء البلازمي (24-26). في الطفرة الحساسة للحرارة sec31-1، يتم التعبير عن هاتين الحمولتين تحت مُحفز قابل للتحريض بالجلاكتوز وعلامة ERES ثابتة. عند درجة الحرارة القصوى (37 درجة مئوية)، ونظرًا لتأثير طفرة sec31-1 على وظيفة مكون غلاف COPII، Sec31، في تثبيط إنبات COPII وتصدير البروتينات من الشبكة الإندوبلازمية، تتراكم الحمولة المُصنّعة حديثًا في الشبكة الإندوبلازمية (23). بعد التبريد إلى درجة حرارة منخفضة (24 درجة مئوية)، تعافت خلايا الطفرة sec31-1 من منطقة الإفراز، وبدأت الحمولة المُصنّعة حديثًا المتراكمة في الخروج من الشبكة الإندوبلازمية. أظهر التصوير بتقنية CLIM أن معظم بروتيني Gas1-GFP وMid2-iRFP المُصنّعين حديثًا ما زالا يتراكمان في الشبكة الإندوبلازمية لخلايا الطفرة sec31-1 بعد حضانتهما عند 37 درجة مئوية ثم إطلاقهما عند 24 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (الشكل 1). ولأن Mid2-iRFP مُوزّع على كامل غشاء الشبكة الإندوبلازمية، بينما يتركز Gas1-GFP ويتجمع في منطقة غشاء الشبكة الإندوبلازمية غير المتصلة، فإن توزيعهما يختلف تمامًا (الشكل 1، من A إلى C والفيديو S1). بالإضافة إلى ذلك، وكما هو موضح في الشكل 1D، لا تحتوي مجموعة Gas1-GFP على Mid2-iRFP. تشير هذه النتائج إلى أن بروتينات GPI-AP والبروتينات الغشائية قد انفصلت إلى مناطق غشائية مختلفة في الشبكة الإندوبلازمية في وقت مبكر. تقع مجموعة Gas1-GFP بجوار موقع خروج محدد من الشبكة الإندوبلازمية (ERES) مُوسَم ببروتين الغلاف Sec13 الخاص ببروتين COPII الخاص بـ mCherry (الشكل 1، E وF، والفيديو S1) (23).
تُعبّر خلايا sec31-1 عن إفرازات مُحفّزة بالجالاكتوز، وهي سيراميد GPI-AP Gas1-GFP ذو سلسلة أسيل طويلة (C26) (GPI-AP، أخضر) والبروتين الغشائي Mid2-iRFP (TMP، أزرق). تم تحضين هذه الخلايا المُوسومة بـ ERES البنّاء Sec13-mCherry (ERES، أرجواني) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم نُقلت إلى 24 درجة مئوية، وصُوّرت بتقنية SCLIM بعد 5 دقائق. تُظهر الصور (من A إلى C) صورة ثنائية الأبعاد مُدمجة أو مُفردة لمستوى (A)، أو صورة إسقاط ثنائية الأبعاد لعشرة مقاطع z (B)، أو صورة ثلاثية الأبعاد لنصف كرة الخلية تُظهر الحمولة وعلامات ERES (C). مقياس الرسم 1 ميكرومتر (A وB). وحدة القياس 0.551 ميكرومتر (C). تم الكشف عن بروتين Gas1-GFP في مناطق أو تجمعات منفصلة من الشبكة الإندوبلازمية، بينما تم الكشف عن بروتين Mid2-iRFP وتوزيعه في جميع أنحاء غشاء الشبكة الإندوبلازمية (C). (D) يوضح الرسم البياني شدة التألق النسبي لبروتين Gas1-GFP وبروتين Mid2-iRFP في تجمع بروتين Gas1-GFP على طول خط السهم الأبيض (يسار). وحدة قياس اعتباطية (AU). (E وF) يمثلان الصورة ثلاثية الأبعاد التي تجمع بين بروتين Gas1-GFP وعلامة ERES. تم الكشف عن تجمعات بروتين Gas1-GFP بالقرب من علامة ERES المحددة. وحدة القياس هي 0.551 ميكرومتر. (F) يشير السهم الأبيض المتصل إلى تجمع بروتين Gas1-GFP المرتبط بعلامة ERES. تُظهر اللوحتان الوسطى واليمنى الصورة ثلاثية الأبعاد المكبرة المدمجة وعرضًا مُدارًا لتجمع بروتين Gas1-GFP المحدد.
تشير العلاقة المكانية الوثيقة بين مجموعة Gas1-GFP ومنطقة ERES محددة إلى قدرة Gas1-GFP على دخول مناطق ERES انتقائية، وهو ما يختلف عن الانتقائية التي يستخدمها Mid2-iRFP للخروج من الشبكة الإندوبلازمية. وللتحقق من هذه الإمكانية، قمنا بقياس نسبة مناطق ERES التي تحتوي على نوع واحد أو نوعين فقط من الحمولة (الشكل 2، من A إلى C). ووجدنا أن معظم مناطق ERES (70%) تحتوي على نوع واحد فقط من الحمولة. تُظهر الصورة السفلية من الشكل 2C مثالين نموذجيين لمناطق ERES تحتوي إما على Gas1-GFP فقط (الشكل 1) أو على Mid2-iRFP فقط (الشكل 2). في المقابل، يحتوي ما يقرب من 20% من مناطق ERES على نوعين من الحمولة يتداخلان في نفس المنطقة. ووجدنا أن بعض مناطق ERES (10%) تحتوي على نوعين من الحمولة، لكنهما معزولان في مناطق مختلفة بوضوح. لذلك، يُظهر هذا التحليل الإحصائي أنه بعد خروج البروتين من الشبكة الإندوبلازمية، يتم تقسيم بروتين Gas1-GFP المرتبط ببروتين GPI-AP والبروتين الغشائي Mid2-iRFP إلى مناطق ERES مختلفة (الشكل 2D). تتوافق كفاءة الفرز هذه بشكل كبير مع التحليل البيوكيميائي السابق (6) والتحديد المورفولوجي (7). كما يمكننا ملاحظة سلوك الشحنة المعزولة الداخلة إلى حويصلات الإفراز الشبكية (ERES) (الشكل 2E والفيديو S2). يُظهر الشكل 2E أن جزءًا صغيرًا فقط من Gas1-GFP (اللوحة 3) أو Mid2-iRFP (اللوحة 4) يدخل حويصلات الإفراز الشبكية من جانب واحد ويبقى محصورًا في منطقة محددة. تُظهر اللوحة 5 من الشكل 2E أن Gas1-GFP وMid2-iRFP يُوجدان أحيانًا في نفس حويصلات الإفراز الشبكية، لكنهما يدخلان من جانبين مختلفين ويتركزان في مناطق منفصلة قد تُمثل حويصلات COPII مختلفة. كما أكدنا أن الفصل والتصنيف الملحوظين لبروتين Gas1 المرتبط بـ GPI-AP والمُعتمد على سيراميد C26 كحويصلات إفراز شبكية انتقائية هو تصنيف دقيق، وذلك لأن شحنة إفراز غشائية أخرى، وهي بروتين غشاء البلازما Axl2 المُوسوم بـ GFP (27)، تُظهر سلوكًا مشابهًا لـ Mid2-iRFP (الصورة S1 والفيديو S3). يتوزع بروتين Axl2-GFP المُصنّع حديثًا عبر غشاء الشبكة الإندوبلازمية، كما هو الحال مع بروتين Mid2-iRFP (الشكل S1، A وB)، ويتواجد معه في معظم مواقع خروج البروتينات من الشبكة الإندوبلازمية (الشكل S1، من B إلى D). تُظهر اللوحتان 1 و2 من الشكل 1. S1C مثالين نموذجيين لمواقع خروج البروتينات من الشبكة الإندوبلازمية حيث تتداخل حمولتان غشائيتان. في هذه الحالات، تدخل كلتا الحمولتين إلى مواقع خروج البروتينات من الشبكة الإندوبلازمية معًا (الشكل S1E، اللوحة 3 والفيديو S3).
وُضعت خلايا sec31-1 المُعبِّرة عن إفرازات مُحفَّزة بالجالاكتوز، Gas1-GFP (GPI-AP، أخضر) وMid2-iRFP (TMP، أزرق)، بالإضافة إلى خلايا ERES المُوسومة بشكلٍ دائم Sec13-mCherry (ERES، أرجواني)، عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد حضانة لمدة 30 دقيقة عند هذه الدرجة، نُقلت الخلايا إلى درجة حرارة 24 درجة مئوية لإزالة تثبيط الإفراز، ثم صُوِّرت باستخدام تقنية SCLIM بعد 20 دقيقة. (من A إلى C) صور إسقاط ثنائية الأبعاد نموذجية (A؛ مقياس الرسم 1 ميكرومتر) أو صور نصف كروية ثلاثية الأبعاد للخلايا (B وC؛ وحدة القياس 0.456 ميكرومتر) للحمولة و10 مقاطع z مُحدَّدة بواسطة ERES. يعرض الجزء السفلي من (B) والجزء في (C) صورًا مُعالَجة لعرض المواد الموجودة فقط في ERES (أرجواني) [Gas1-GFP (رمادي) وMid2-iRFP (أزرق فاتح)]. (ج) سهم مفتوح: يحمل ERES حمولة واحدة فقط (من 1 إلى 4). سهم رمادي: يحتوي ERES على حمولة منفصلة (5). سهم أبيض مغلق: يحتوي ERES على حمولة مشتركة. في الأسفل: يحتوي ERES المحدد على Gas1-GFP (1) أو Mid2-iRFP (2) فقط. مقياس الرسم: 100 نانومتر. (د) قياس كمي للصورة المجهرية الموضحة في (ج). متوسط ​​النسبة المئوية لـ ERES التي تحتوي على حمولة واحدة فقط (Gas1-GFP أو Mid2-iRFP)، والحمولة المنفصلة، ​​والحمولة المتداخلة. في ثلاث تجارب مستقلة، ن = 432 في 54 خلية. شريط الخطأ = الانحراف المعياري. اختبار t ثنائي الطرف غير مقترن. *** قيمة P = 0.0002. (هـ) صورة ثلاثية الأبعاد لـ ERES محدد من حمولة معزولة مُشار إليها بـ (ج). يدخل بروتين Gas1-GFP (أخضر) (3) أو بروتين Mid2-iRFP (أزرق) (4) إلى منطقة ERES (أرجواني) من جانب واحد، ويقتصر وجودهما على مساحة صغيرة داخلها. في بعض الأحيان، يدخل كلا النوعين من الحمولة إلى منطقة ERES نفسها (5) من الجانب نفسه، ويقتصر وجودهما على منطقة معزولة داخلها. مقياس الرسم: 100 نانومتر.
بعد ذلك، اختبرنا فرضية مفادها أن السيراميد ذو السلسلة الأسيلية الطويلة (C26) الموجود في غشاء الشبكة الإندوبلازمية يحفز التجمع والفرز النوعيين لبروتين Gas1 في مواقع ERES الانتقائية. ولتحقيق هذه الغاية، استخدمنا سلالة خميرة معدلة GhLag1، حيث استُبدل فيها إنزيما تخليق السيراميد الداخليان Lag1 وLac1 بإنزيم GhLag1 (المماثل لإنزيم Lag1 في القطن)، مما أدى إلى سلالة خميرة ذات غشاء خلوي أقصر من النوع البري (الشكل 3أ) (28). وأظهر تحليل مطياف الكتلة (MS) أن 95% من السيراميد في السلالات البرية هو سيراميد ذو سلسلة طويلة جدًا (C26)، بينما في سلالة GhLag1، 85% من السيراميد ذو سلسلة طويلة جدًا (C18 وC16). على الرغم من أن سيراميدات C18 وC16 هي السيراميدات الرئيسية التي تم الكشف عنها في غشاء GhLag1 حتى الآن، فقد أكد تحليل مطياف الكتلة أيضًا أن مرساة GPI لبروتين Gas1-GFP المُعبَّر عنه في سلالة GhLag1 تحتوي على سيراميد C26، وهو ما يُضاهي جودة السيراميدات الموجودة في النوع البري (الشكل 3أ) (26). وبالتالي، فهذا يعني أن إنزيم إعادة تشكيل السيراميد Cwh43 يتميز بانتقائية عالية لسيراميد C26، كما هو موضح في الشكل 26، حيث يُدمج مرساة GPI بشكل تفضيلي من كمية صغيرة من سيراميد C26 في سلالة GhLag1. S2 (29). ومع ذلك، فإن غشاء خلية GhLag1 يحتوي بشكل أساسي على سيراميد C18-C16 فقط، بينما يحتوي Gas1-GFP أيضًا على سيراميد C26. هذه الحقيقة تجعل هذه السلالة أداة مثالية لحل مشكلة طول سلسلة الأسيل في سيراميد الغشاء في الشبكة الإندوبلازمية بشكل خاص. الدور الافتراضي للتصنيف والفرز. ثم، درسنا أولًا قدرة بروتين Gas1-GFP من النوع C26 على التراكم في تجمعات في خلايا GhLag1 الحاملة لطفرة حساسة للحرارة من النوع sec31-1، وذلك باستخدام المجهر الفلوري التقليدي، حيث توجد السلسلة الطويلة (C18-C16) فقط في غشاء الشبكة الإندوبلازمية (الشكل 3). لاحظنا أنه في sec31-1، تركز معظم بروتين Gas1-GFP في تجمعات، بينما في خلايا GhLag1 الحاملة لطفرة sec31-1 ذات غشاء الشبكة الإندوبلازمية الطويل (C18-C16)، لم يكن بروتين Gas1-GFP متجمعًا في الغالب، بل كان موزعًا في كامل غشاء الشبكة الإندوبلازمية. وللتوضيح، نظرًا لأن التجمع القائم على سيراميد C26 يرتبط ارتباطًا وثيقًا بمواقع خروج محددة من الشبكة الإندوبلازمية (الشكل 1)، فقد بحثنا لاحقًا فيما إذا كانت هذه العملية قد تتضمن أيضًا وظيفة آلية بروتينات التصدير من الشبكة الإندوبلازمية. يستخدم GPI-AP نظام COPII خاصًا لتصدير البروتينات من الشبكة الإندوبلازمية، والذي يُنظَّم بنشاط عن طريق إعادة تشكيل Ted1 لبنية جزء الغليكان من مرساة GPI (30، 31). ثم يتعرف معقد مستقبل الحمولة عبر الغشاء p24 على غليكان GPI المُعاد تركيبه، والذي بدوره يستقطب بشكل انتقائي Lst1، وهو نظير محدد للوحدة الفرعية الرئيسية الرابطة لحمولة COPII، Sec24، مما يُشكل حويصلات COPII غنية بـ GPI-AP (31-33). لذلك، قمنا بإنشاء طفرة مزدوجة تجمع بين حذف هذه البروتينات المفردة (مكون معقد p24، Emp24، وإنزيم إعادة تشكيل غليكان GPI، Ted1، والوحدة الفرعية المحددة لـ COPII، Lst1) مع سلالة الطفرة sec31-1، ودرسنا إمكانية تكوين مجموعة Gas1-cluster GFP (الشكل 3). لاحظنا أنه في الطفرتين sec31-1emp24Δ و sec31-1ted1Δ، يكون بروتين Gas1-GFP غير متجمع في الغالب وموزعًا في جميع أنحاء غشاء الشبكة الإندوبلازمية، كما لوحظ سابقًا في الطفرة sec31-1 GhLag1، بينما في الطفرة sec31-1lst1Δ، يكون بروتين Gas1-GFP مشابهًا للطفرة sec31-1. تشير هذه النتائج إلى أنه بالإضافة إلى وجود سيراميد C26 في غشاء الشبكة الإندوبلازمية، فإن تجمع بروتين Gas1-GFP يتطلب أيضًا الارتباط بمركب p24، ولا يتطلب استقطابًا محددًا لبروتين Lst1. بعد ذلك، بحثنا في إمكانية أن يؤثر طول سلسلة السيراميد في غشاء الشبكة الإندوبلازمية على ارتباط بروتين Gas1-GFP ببروتين p24. مع ذلك، وجدنا أن وجود سيراميد C18-C16 في الغشاء لا يؤثر على جزيئات GPI-glycans المُعاد بناؤها بواسطة مُركب p24 (الشكلان S3 وS4، A وB) أو على ارتباطه بـ GPI-AP وقدرته على تصدير GPI-AP. كما أنه لا يؤثر على قدرة تجنيد النوع الفرعي Lst1 من COPII (الشكل S4C). لذا، فإن التجميع المعتمد على سيراميد C26 لا يتطلب تفاعلات بروتينية مع آليات بروتينات التصدير المختلفة من الشبكة الإندوبلازمية، بل يدعم آلية فرز بديلة تعتمد على طول الليبيد. بعد ذلك، حللنا ما إذا كان طول سلسلة أسيل السيراميد في غشاء الشبكة الإندوبلازمية مهمًا للتصنيف الفعال لـ Gas1-GFP كـERES انتقائي. بما أن Gas1 في سلالة GhLag1 ذات السيراميد قصير السلسلة يغادر الشبكة الإندوبلازمية ويدخل غشاء البلازما (الشكل S5)، نعتقد أنه إذا كان الفرز يعتمد على طول سلسلة أسيل السيراميد، فإنه يمكن إعادة توجيه Gas1 في سلالة GhLag1 وتجاوزه. منتجات ERES ذات الغشاء نفسه.
(أ) يحتوي غشاء خلية GhLag1 بشكل أساسي على سيراميدات أقصر C18-C16، بينما يحتفظ مرساة GPI لـ Gas1-GFP بنفس طول سلسلة IPC C26 الموجودة في الخلايا البرية. أعلاه: تحليل طول سلسلة الأسيل للسيراميد في غشاء خلية السلالة البرية (Wt) وسلالة GhLag1p باستخدام مطياف الكتلة (MS). تمثل البيانات النسبة المئوية للسيراميد الكلي. متوسط ​​ثلاث تجارب مستقلة. شريط الخطأ = الانحراف المعياري. اختبار t ثنائي الطرف غير مقترن. **** P < 0.0001. اللوحة السفلية: تحليل MS لطول سلسلة الأسيل لـ IPC الموجود في مرساة GPI لـ Gas1-GFP (GPI-IPC) المعبر عنها في السلالة البرية وسلالة GhLag1p. تمثل البيانات النسبة المئوية لإشارة IPC الكلية. متوسط ​​خمس تجارب مستقلة. شريط الخطأ = الانحراف المعياري. اختبار t ثنائي الطرف غير مقترن. ns، غير مهم. P = 0.9134. (ب) تم تحضين صور مجهرية فلورية لخلايا sec31-1، وsec31-1 GhLag1، وsec31-1emp24Δ، وsec31-1ted1Δ، وsec31-1lst1Δ، التي تُعبر عن بروتين Gas1-GFP المُحفز بالجالاكتوز، عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم تم تبريدها إلى 24 درجة مئوية لإجراء الفحص المجهري الفلوري الروتيني. السهم الأبيض: تجمع بروتين Gas1-GFP في الشبكة الإندوبلازمية. السهم المفتوح: بروتين Gas1-GFP غير المتجمع مُوزع على كامل غشاء الشبكة الإندوبلازمية، مما يُظهر التلوين الحلقي النووي المميز للشبكة الإندوبلازمية. مقياس الرسم: 5 ميكرومتر. (ج) قياس كمي للصورة المجهرية الموضحة في (ب). متوسط ​​النسبة المئوية للخلايا ذات بنية Gas1-GFP النقطية. في ثلاث تجارب مستقلة، n ≥ 300 خلية. شريط الخطأ = الانحراف المعياري. اختبار t ثنائي الطرف غير المقترن. **** P <0.0001.
لحل هذه المشكلة مباشرةً، أجرينا تصويرًا بتقنية SCLIM لبروتيني Gas1-GFP وMid2-iRFP في خلايا GhLag1 الحاملة للأليل الطافر sec31-1 الحساس للحرارة (الشكل 4 والفيديو S4). بعد تثبيت الشبكة الإندوبلازمية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ثم إطلاقها عند 24 درجة مئوية، لم يتجمع معظم بروتين Gas1-GFP المُصنّع حديثًا، بل توزع في جميع أنحاء غشاء الشبكة الإندوبلازمية، كما لوحظ بالمجاهر التقليدية (الشكل 4، A وB). إضافةً إلى ذلك، احتوت نسبة كبيرة من مواقع خروج الشبكة الإندوبلازمية (67%) على نوعين من الحمولة متجاورين فيها (الشكل 4D). يُظهر الشكل 4C، اللوحتان 1 و2، مثالين نموذجيين لمواقع خروج الشبكة الإندوبلازمية مع تداخل بروتيني Gas1-GFP وMid2-GFP. علاوةً على ذلك، تم استقطاب كلا النوعين من الحمولة إلى نفس موقع خروج الشبكة الإندوبلازمية (الشكل 4E، اللوحة 3 والفيديو S4). لذلك، تشير نتائجنا إلى أن طول سلسلة أسيل السيراميد في غشاء الشبكة الإندوبلازمية هو عامل مهم في تحديد تجميع وتصنيف بروتينات الشبكة الإندوبلازمية.
خلايا Sec31-1 GhLag1 التي تُعبّر عن إفرازات مُحفّزة بالجالاكتوز، Gas1-GFP (GPI-AP، أخضر) وMid2-iRFP (TMP، أزرق)، وSec13-mCherry المُوسوم بشكل دائم بـERES (ERES، أرجواني). تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم تُخفض درجة الحرارة إلى 24 درجة مئوية لإطلاق الإفرازات، وتُصوّر باستخدام تقنية SCLIM بعد 20 دقيقة. (من A إلى C) صور إسقاط ثنائية الأبعاد نموذجية (A؛ مقياس الرسم 1 ميكرومتر) أو صور نصف كرة خلوية ثلاثية الأبعاد (B وC؛ وحدة المقياس 0.45 ميكرومتر) للمقاطع العشرة z المُحددة بالحمولة وERES. يعرض الجزء السفلي في (B) والجزء في (C) صورًا مُعالجة لعرض المواد الموجودة فقط في ERES (أرجواني) [Gas1-GFP (رمادي) وMid2-iRFP (أزرق فاتح)]. (ج) سهم أبيض مُعبأ: منطقة ERES، تداخل البضائع. سهم مفتوح: منطقة ERES تحتوي على عنصر واحد فقط. اللوحة السفلية: منطقة ERES المُحددة تحتوي على بضائع متداخلة (1 و2) مُشار إليها في (ج). مقياس الرسم: 100 نانومتر. (د) قياس كمي للصورة المجهرية الموصوفة في (ج). في وحدتي sec31-1 وsec31-1 GhLag1، تم تضمين شحنة واحدة فقط (Gas1-GFP أو Mid2-iRFP)، ومتوسط ​​النسبة المئوية لمنطقة ERES للشحنات المعزولة والمتداخلة. في ثلاث تجارب مستقلة، n = 432 في 54 خلية (sec31-1) و n = 430 في 47 خلية (sec31-1 GhLag1). شريط الخطأ = الانحراف المعياري. اختبار t ثنائي الطرف غير مُقترن. *** P = 0.0002 (sec31-1) و ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (هـ) صورة ثلاثية الأبعاد لمنطقة ERES مختارة مع حمولة متداخلة (3) موضحة في (ج). يقترب كل من Gas1-GFP (أخضر) وMid2-iRFP (أزرق) من منطقة ERES (أرجواني) من نفس الجانب ويبقيان في نفس المنطقة المحددة لـ ERES. مقياس الرسم: 100 نانومتر.
تقدم هذه الدراسة دليلاً مباشراً في الجسم الحي على أن البروتينات الدهنية تُصنف إلى مواقع تصدير انتقائية في المسار الإفرازي، وتكشف عن أهمية طول سلسلة الأسيل في انتقائية التصنيف. باستخدام تقنية مجهرية متطورة وقوية تُسمى SCLIM، أظهرنا بروتين Gas1-GFP المُصنّع حديثاً (وهو بروتين رئيسي من عائلة GPI-AP في غشاء البلازما، يحتوي على جزء دهني من السيراميد ذي سلسلة أسيل طويلة جداً (C26)) في الخميرة. ترتبط المناطق المتجمعة في شبكات إندوبلازمية منفصلة بمواقع تصدير محددة، بينما تتوزع البروتينات المُفرزة عبر الغشاء في جميع أنحاء غشاء الشبكة الإندوبلازمية (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، يدخل هذان النوعان من البروتينات إلى مواقع تصدير مختلفة بشكل انتقائي (الشكل 2). يتم تقليل طول سلسلة الأسيل للسيراميد الخلوي في الغشاء من C26 إلى C18-C16، ويتم تعطيل مجموعة Gas1-GFP في منطقة الشبكة الإندوبلازمية المنفصلة، ​​ويتم إعادة توجيه Gas1-GFP لمغادرة الشبكة الإندوبلازمية مع البروتين عبر الغشاء من خلال نفس ERES (الشكل 3 والشكل 3). 4).
على الرغم من أن GPI-AP يستخدم آلية بروتينية متخصصة للخروج من الشبكة الإندوبلازمية، فقد وجدنا أن الفصل المعتمد على سيراميد C26 لا يعتمد على تفاعلات بروتينية تفاضلية قد تؤدي إلى تخصص مواقع خروج الشبكة الإندوبلازمية (الشكلان S4 وS5). بدلاً من ذلك، تدعم نتائجنا آلية تصنيف بديلة مدفوعة بتكتل البروتينات القائم على الدهون والاستبعاد اللاحق للشحنات الأخرى. تشير ملاحظاتنا إلى أن منطقة أو مجموعة Gas1-GFP المرتبطة بموقع خروج شبكة إندوبلازمية محدد تفتقر إلى البروتين المفرز عبر الغشاء Mid2-iRFP، مما يشير إلى أن مجموعة GPI-AP المعتمدة على سيراميد C26 ستسهل دخولها إلى موقع خروج الشبكة الإندوبلازمية ذي الصلة، وفي الوقت نفسه، تستبعد الإفرازات عبر الغشاء. تدخل الإفرازات إلى موقع خروج الشبكة الإندوبلازمية المحدد هذا (الشكلان 1 و2). في المقابل، لا يتسبب وجود سيراميدات C18-C16 في غشاء الشبكة الإندوبلازمية في تكوين مناطق أو مجموعات من GPI-AP، لذلك فهي لا تستبعد أو تستبدل البروتينات المفرزة عبر الغشاء في موقع خروج الشبكة الإندوبلازمية نفسه (الشكلان 3 و4). لذلك، نقترح أن السيراميد C26 يقود عملية الفصل والتصنيف من خلال تسهيل تجميع البروتينات المرتبطة بمواقع ERES محددة.
كيف يُمكن تحقيق هذا التجمع المعتمد على سيراميد C26 في منطقة محددة من الشبكة الإندوبلازمية؟ قد يؤدي ميل سيراميد الغشاء إلى الانفصال الجانبي إلى تكوين جزيئات دهنية صغيرة ومنظمة بشكل فوري مع سيراميد C26 وبروتين GPI-AP في بيئة دهنية غير منتظمة لغشاء الشبكة الإندوبلازمية، والتي تحتوي على جزيئات جليسروليبيدات أقصر وغير مشبعة. تُعرف هذه التجمعات باسم تجمعات عالية الجودة (17، 18). يمكن دمج هذه التجمعات الصغيرة المؤقتة لتكوين تجمعات أكبر وأكثر استقرارًا بعد ارتباطها بمركب p24 (34). وتماشيًا مع ذلك، أظهرنا أن بروتين Gas1-GFP-C26 يحتاج إلى التفاعل مع مركب p24 لتكوين تجمعات مرئية أكبر (الشكل 3). مركب p24 هو عبارة عن قليل الوحدات غير المتجانس، يتكون من أربعة بروتينات غشائية مختلفة من نوع p24 في الخميرة (35)، مما يوفر ارتباطًا متعدد التكافؤ، والذي يمكن أن يؤدي إلى ربط تجمعات GPI-AP الصغيرة، وبالتالي تكوين تجمعات مستقرة أكبر (34). قد يُساهم التفاعل بين النطاقات الخارجية لبروتينات GPI-APs في تجمّعها، كما هو موضح أثناء نقلها عبر جهاز غولجي في الخلايا الظهارية المستقطبة للثدييات (36). مع ذلك، عند وجود سيراميد C18-C16 في غشاء الشبكة الإندوبلازمية، وعندما يرتبط معقد p24 بـ Gas1-GFP، لن تتشكل تجمعات كبيرة منفصلة. قد تعتمد الآلية الكامنة وراء ذلك على الخصائص الفيزيائية والكيميائية المحددة لسيراميد السلسلة الأسيلية الطويلة. تُظهر الدراسات الفيزيائية الحيوية للأغشية الاصطناعية أنه على الرغم من أن كلاً من سيراميدات السلسلة الأسيلية الطويلة (C24) والقصيرة (C18-C16) يمكن أن تُسبب انفصالًا طوريًا، إلا أن سيراميدات السلسلة الأسيلية الطويلة (C24) فقط هي التي تُعزز الانحناء العالي وانحناء الغشاء لإعادة تشكيله. من خلال المراجع المتبادلة (17، 37، 38). لقد ثبت أن اللولب الغشائي لبروتين TMED2، وهو النظير البشري لبروتين Emp24، يتفاعل بشكل انتقائي مع السفينغوميلين القائم على سيراميد C18 في الفصيصات السيتوبلازمية (39). وباستخدام محاكاة الديناميكا الجزيئية، وجدنا أن كلاً من سيراميد C18 وسيراميد C26 يتراكمان حول الفصيصات السيتوبلازمية للولب الغشائي لبروتين Emp24، ولهما تفضيلات متشابهة (الشكل S6). ومن الجدير بالذكر أن هذا يشير إلى أن اللولب الغشائي لبروتين Emp24 قد يؤدي إلى توزيع غير متماثل للدهون في الغشاء. وهذه نتيجة حديثة مبنية على خلايا الثدييات. كما تُظهر محاكاة الديناميكا الجزيئية المماثلة وجود دهون الإيثر (40). لذلك، نفترض أن سيراميد C26 في فصيصي ER26 مُركّز موضعيًا. عندما يرتبط بروتين GPI-AP في الفصيصات اللمعية مباشرةً ببروتين p24 متعدد التكافؤ، ويتراكم سيراميد C26 حول p24 في الفصيصات السيتوبلازمية، فإنه يُحفز تكتل البروتينات المصاحب وانحناء الغشاء عبر الزوائد (41)، مما يؤدي إلى انفصال GPI-AP إلى مناطق منفصلة مجاورة لمواقع خروج الشبكة الإندوبلازمية (ERES)، وهو ما يُفضل أيضًا المناطق شديدة الانحناء في غشاء الشبكة الإندوبلازمية (42). وقد دعمت تقارير سابقة الآلية المقترحة (43، 44). يُحفز الارتباط متعدد التكافؤ للأوليغولكتينات أو مسببات الأمراض أو الأجسام المضادة بالجليكوسفينجوليبيدات (GSL) القائمة على السيراميد على غشاء البلازما تكتلًا كبيرًا من GSL، ويعزز انفصال الطور، ويُسبب تشوه الغشاء ودخوله إلى الخلية (44). إيوابوتشي وآخرون (43) وجد أنه في وجود سلاسل أسيل طويلة (C24) ولكن ليس قصيرة (C16)، فإن الرابط متعدد التكافؤ المرتبط بـ GSL لاكتوسيل سيراميد يحفز تكوين تجمعات كبيرة وانغماد الغشاء، ويتم تداخل نقل الإشارة بوساطة Lyn في السيتوبلازم على الصفائح بواسطة سلاسل الأسيل في العدلات المقترنة.
في الخلايا الظهارية المستقطبة لدى الثدييات، يتحكم تركيز شبكة غولجي المضادة (TGN) عند مستوى الغشاء البلازمي القمي في فصل وفرز بروتين GPI-AP (10، 45). ويُعزى هذا التجمع إلى تكوين قليل الوحدات من بروتين GPI-AP (36)، ولكنه قد يعتمد أيضًا على طول سلسلة السيراميد الموجودة في الخميرة. وعلى الرغم من أن بروتين GPI-AP لدى الثدييات يحتوي على مرساة من دهون الإيثر، وأن تركيبه الكيميائي يختلف اختلافًا كبيرًا عن السيراميد ذي السلسلة الأسيلية الطويلة جدًا، فقد وجدت دراسة حديثة أن كلا النوعين من الدهون لهما خصائص فيزيائية وكيميائية ووظائف متشابهة تطوريًا (40). لذا، قد يكون جزء دهون الإيثر في خلايا الثدييات مشابهًا لسيراميد C26 في الخميرة، ويتمثل دوره في الارتباط بسيراميد السلسلة الطويلة في الغشاء لتعزيز تجمع وفرز بروتين GPI-AP. على الرغم من أن هذه الإمكانية لا تزال بحاجة إلى اختبار مباشر، إلا أن النتائج السابقة تدعم أن نقل سيراميد ذي السلسلة الأسيلية الطويلة إلى جهاز جولجي لا يتم بواسطة بروتينات النقل السيتوبلازمية، بل يعتمد على تخليق روابط GPI كما في الخميرة. ولذلك، يبدو أن الآلية المحافظة تطوريًا قادرة على النقل المشترك الانتقائي لسيراميد ذي السلسلة الأسيلية الطويلة جدًا وGPI-AP (13، 16، 20، 46، 47) في نفس الحويصلة الناقلة.
في الخميرة وأنظمة الخلايا الظهارية المستقطبة في الثدييات، يحدث تجمع بروتينات GPI-AP وانفصالها عن بروتينات غشاء البلازما الأخرى قبل وصولها إلى سطح الخلية. وقد وجد بالادينو وآخرون (48) أن تجمع بروتينات GPI-AP على شبكة جولجي عبرية (TGN) في الخلايا الظهارية المستقطبة في الثدييات ليس ضروريًا فقط للتصنيف الانتقائي لهذه البروتينات إلى غشاء البلازما القمي، بل ينظم أيضًا تنظيم تجمعاتها ونشاطها البيولوجي على سطح الخلية. وفي الخميرة، أظهرت هذه الدراسة أن تجمع بروتينات GPI-AP المعتمد على سيراميد C26 على الشبكة الإندوبلازمية يمكنه تنظيم تنظيم التجمعات والنشاط الوظيفي لبروتينات GPI-AP على غشاء البلازما (24، 49). تماشياً مع هذا النموذج، تُظهر خلايا GhLag1 حساسيةً تجاه مثبطات GPI أو الأدوية التي تؤثر على سلامة جدار الخلية (28)، ويشير احتياج خلايا الخميرة إلى تجمعات Gas1-GFP وظيفية (49) في قمة السيراميد المُسقطة أثناء التزاوج إلى وجود خطأ في GPI-AP. مع ذلك، سيُركز بحثنا المستقبلي على اختبار ما إذا كان التنظيم الوظيفي لسطح الخلية قد بُرمج من الشبكة الإندوبلازمية بواسطة طريقة فرز تعتمد على طول الليبيد.
تم إدراج سلالات الخميرة Saccharomyces cerevisiae المستخدمة في هذا العمل في الجدول S1. تم إنشاء سلالتي MMY1583 وMMY1635 من SCLIM لتصوير الخلايا الحية على خلفية W303. تم إنشاء هاتين السلالتين اللتين تعبران عن Sec13-mCherry مع علامة بروتين فلوري باستخدام طريقة تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع بلازميد pFA6a كقالب (23). تم إنشاء السلالة التي تعبر عن Mid2-iRFP الموسوم ببروتين فلوري تحت سيطرة محفز GAL1 على النحو التالي: تضخيم تسلسل iRFP-KanMx من ناقل pKTiRFP-KAN (هدية من E. O'Shea، رقم بلازميد Addgene 64687؛ http://n2t.net/addgene: 64687؛ معرف مورد البحث (RRID): Addgene_64687) وإدخاله في الطرف الكربوكسيلي لـ Mid2 الداخلي. بعد تضخيم تسلسل جينوم Mid2-iRFP واستنساخه في محفز GAL1، تم دمجه في موقع Not I-Sac I للبلازميد التكاملي pRS306. تم تليين البلازميد الناتج pRGS7 باستخدام Pst I لدمجه في موقع URA3.
يُعبَّر عن جين الاندماج Gas1-GFP تحت سيطرة مُحفِّز GAL1 في بلازميد السنترومير (CEN)، الذي تم بناؤه كما يلي. تم تضخيم تسلسل Gas1-GFP بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من بلازميد pRS416-GAS1-GFP (24) (هدية من L. Popolo) واستُنسخ في موقع Xma I–Xho I لبلازميد السنترومير pBEVY-GL LEU2 (هدية من C. Miller؛ رقم بلازميد Addgene هو 51225؛ http://n2t.net/addgene: 51225؛ RRID: Addgene_51225). سُمِّي البلازميد الناتج pRGS6. كما يُعبَّر عن جين الاندماج Axl2-GFP تحت سيطرة مُحفِّز GAL1 في ناقل pBEVY-GL LEU2، ويتم بناؤه كما يلي. تم تضخيم تسلسل Axl2-GFP من البلازميد pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ثم تم استنساخه في موقع Bam HI-Pst I من ناقل pBEVY-GL LEU2. سُمي البلازميد الناتج pRGS12. يرد تسلسل النيوكليوتيدات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول S2.
تمت إضافة 0.2% أدينين و2% جلوكوز [YP-دكستروز (YPD)]، أو 2% رافينوز [YP-رافينوز]، أو وسط بروتين مستخلص الخميرة الغني بالبروتين (YP) (1% مستخلص خميرة و2% بروتين ept) (YPR)]، أو 2% جالاكتوز [YP-جالاكتوز (YPG)] كمصدر للكربون، أو في وسط اصطناعي بسيط (0.15% قاعدة نيتروجين الخميرة و0.5% كبريتات الأمونيوم) لتوفير الأحماض الأمينية والقواعد المناسبة اللازمة للتغذية، ويحتوي على 2% جلوكوز (وسط جلوكوز اصطناعي بسيط) أو 2% جالاكتوز (وسط جالاكتوز اصطناعي بسيط) كمصدر للكربون.
للتصوير في الوقت الحقيقي، زُرعت خلايا طافرة حساسة للحرارة من نوع sec31-1، تُعبر عن البنية تحت سيطرة محفز GAL1، في وسط YPR عند درجة حرارة 24 درجة مئوية طوال الليل حتى منتصف المرحلة اللوغاريتمية. بعد التحفيز في وسط YPG عند درجة حرارة 24 درجة مئوية لمدة ساعة، حُضنت الخلايا في وسط SG عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم نُقلت إلى درجة حرارة 24 درجة مئوية لتحريرها من تثبيط الإفراز. استُخدم الكونكانافالين أ لتثبيت الخلايا على شريحة زجاجية، وصُوّرت باستخدام تقنية SCLIM. يجمع نظام SCLIM بين مجهر التألق المقلوب Olympus IX-71 وعدسة الزيت UPlanSApo ذات الفتحة العددية 100×1.4 (Olympus)، وماسح ضوئي متحد البؤر ذي قرص دوار عالي السرعة ونسبة إشارة إلى ضوضاء عالية (Yokogawa Electric)، ومطياف مصمم خصيصًا، ونظام تبريد مصمم خصيصًا. يوفر مكثف الصورة في النظام (Hamamatsu Photonics) نظام عدسة مكبرة بتكبير نهائي يصل إلى 266.7 ضعفًا، وكاميرا CCD تضاعف الإلكترونات (Hamamatsu Photonics) (21). يتم الحصول على الصور بواسطة برنامج مصمم خصيصًا (Yokogawa Electric). وللحصول على صور ثلاثية الأبعاد، استخدمنا مشغلًا كهرضغطياً مصممًا خصيصًا لتحريك العدسة الشيئية عموديًا، وجمعنا الأجزاء البصرية على مسافة 100 نانومتر في طبقات متراصة. تُحوّل صورة التكديس Z إلى بيانات فوكسل ثلاثية الأبعاد، وتُستخدم دالة انتشار النقطة النظرية المستخدمة في المجهر متحد البؤر ذي القرص الدوار في معالجة إزالة التشويش بواسطة برنامج Volocity (بيركن إلمر). وباستخدام برنامج Volocity لضبط العتبة تلقائيًا لتحليل التموضع المشترك، تم قياس ERES بما في ذلك الحمولة. أُجري تحليل المسح الخطي باستخدام برنامج MetaMorph (موليكولار ديفايسز).
استخدم برنامج GraphPad Prism لتحديد الدلالة الإحصائية. في اختبار t للطالب ذي الطرفين واختبار تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA)، تُعتبر الفروق بين المجموعات ذات تأثير دال إحصائيًا عند قيمة P < 0.05 (*).
لإجراء الفحص المجهري الفلوري لبروتين Gas1-GFP، زُرعت الخلايا في طور النمو اللوغاريتمي طوال الليل في وسط YPD، ثم جُمعت بالطرد المركزي، وغُسلت مرتين بمحلول ملحي مُخفف بالفوسفات، وحُضنت على الجليد لمدة 15 دقيقة على الأقل، ثم فُحصت تحت المجهر كما وُصف سابقًا (انظر المرجع 24). استُخدم مجهر Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) المُجهز بعدسة موضوعية، وفلتر L5 (GFP)، وكاميرا Hamamatsu، وبرنامج Application Suite X (LAS X) لالتقاط الصور.
تمت معالجة العينات بمحلول SDS عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم فُصلت باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد SDS (SDS-PAGE). ولتحليل التلطيخ المناعي، تم تحميل 10 ميكرولتر من العينة في كل حارة. الأجسام المضادة الأولية: استُخدمت أجسام مضادة متعددة النسائل من الأرانب ضد Gas1 بتخفيف 1:3000، وأجسام مضادة متعددة النسائل من الأرانب ضد Emp24 بتخفيف 1:500، وأجسام مضادة متعددة النسائل من الأرانب ضد GFP (هدية من هـ. ريزمان) بتخفيف 1:3000. كما استُخدم الجسم المضاد أحادي النسيلة من الفئران ضد Pgk1 بتخفيف 1:5000 (هدية من ج. دي لا كروز). الأجسام المضادة الثانوية: استُخدم الغلوبولين المناعي G (IgG) من الماعز المُقترن بإنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP) والمُضاد للأرانب بتخفيف 1:3000 (بيرس). استُخدم جسم مضاد IgG مضاد للفأر مُقترن بإنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP) بتخفيف 1:3000 (Pierce). وتمت ملاحظة منطقة الاستجابة المناعية باستخدام طريقة التلألؤ الكيميائي لكاشف SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
كما هو موضح في (31)، أُجريت تجربة ترسيب مناعي طبيعي على جزء الشبكة الإندوبلازمية المُخصب. باختصار، غُسلت خلايا الخميرة بمحلول TNE [50 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد (الأس الهيدروجيني 7.5)، 150 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 5 ملي مولار إيدتا، 1 ملي مولار فينيل ميثيل سلفونيل فلورايد، ومزيج مثبطات البروتياز] مرتين عند 600 نانومتر (OD600) وكثافة ضوئية 100. ثم كُسرت الخلايا باستخدام خرز زجاجي، وأُزيلت بقايا الخلايا والخرز الزجاجي بالطرد المركزي. بعد ذلك، خُضعت الطبقة السائلة للطرد المركزي عند 17000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أُعيد تعليق الراسب في محلول TNE، وأُضيف إليه سابونين الديجيتاليس بتركيز نهائي 1%. تم تحضين المعلق لمدة ساعة واحدة مع التقليب عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، ثم أُزيلت المكونات غير الذائبة بالطرد المركزي عند 13000 دورة في الدقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة. لترسيب بروتين Gas1-GFP المناعي، تم تحضين العينة مسبقًا مع خرزات الأغاروز الفارغة (ChromoTek) عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة، ثم تم تحضينها مع GFP-Trap_A (ChromoTek) عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات. غُسلت الخرزات المترسبة مناعيًا خمس مرات بمحلول TNE يحتوي على 0.2% ديجوكسيجينين، ثم تم استخلاصها باستخدام محلول عازل SDS، وفصلها على هلام SDS-PAGE، وتحليلها باستخدام تقنية التلطيخ المناعي.
كما هو موضح في (31)، تم تحديد درجة التشابك على جزء الشبكة الإندوبلازمية المُخصب. باختصار، تم تحضين جزء الشبكة الإندوبلازمية المُخصب مع 0.5 ملي مول من ثنائي ثيو ثنائي (بروبيونات السكسينيميديل) (Pierce، Thermo Fisher Scientific، روكفورد، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية؛ 20 درجة مئوية، 20 دقيقة). تم إيقاف تفاعل التشابك بإضافة الجليسين (بتركيز نهائي 50 ملي مول، 5 دقائق، 20 درجة مئوية).
كما سبق وصفه (50)، أُجري تحليل طيفي للكتلة للسيراميد في السلالات البرية وسلالات GhLag1. باختصار، زُرعت الخلايا حتى وصلت إلى الطور الأسي (3 إلى 4 وحدات امتصاص ضوئي عند 600 نانومتر/مل) في وسط YPD عند 30 درجة مئوية، ثم حُصد 25 × 10⁷ خلية. أُوقف استقلابها باستخدام حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك. استُخدم مذيب الاستخلاص [الإيثانول، الماء، الإيثر، البيريدين، وهيدروكسيد الأمونيوم 4.2 مولار (15:15:5:1:0.018 حجم/حجم)] و1.2 نانومول من معيار السيراميد C17 الداخلي (860517، Avanti polar lipid). استُخدم كاشف أحادي ميثيل أمين [الميثانول، الماء، ن-بيوتانول، ومحلول ميثيل أمين (4:3:1:5 حجم/حجم)] لإجراء تحلل قلوي خفيف للمستخلص، ثم استُخدم ن-بيوتانول مشبع بالماء لإزالة الأملاح. أُعيد تعليق المستخلص في مذيب ذي وضع موجب [كلوروفورم/ميثانول/ماء (2:7:1) + 5 ملي مول من أسيتات الأمونيوم] وحُقن في مطياف الكتلة. أُجريت عملية رصد التفاعلات المتعددة (MRM) لتحديد وقياس كمية جزيئات السفينجوليبيد. طُوّر مطياف الكتلة TSQ Vantage رباعي الأقطاب الثلاثي (Thermo Fisher Scientific) بمصدر أيونات نانوية التدفق آلي Nanomate HD (Advion Biosciences، إيثاكا، نيويورك) لتحليل الدهون. جرى تحسين طاقة التصادم لكل فئة من السيراميدات. حُصل على بيانات مطياف الكتلة في الوضع الموجب. لكل عينة بيولوجية مكررة، تمثل إشارة الدهون متوسط ​​ثلاث قياسات مستقلة.
كما هو موضح في (31)، خضعت الخلايا (800×10⁷) المُعبرة عن بروتين Gas1-GFP لعملية الترسيب المناعي الطبيعي. تم فصل بروتين Gas1-GFP المُنقّى باستخدام تقنية SDS-PAGE، ثم نُقل إلى غشاء من فلوريد البولي فينيليدين (PVDF). تم إظهار البروتين بتلوين غشاء PVDF باستخدام صبغة الأميد الأسود. تم استخلاص شريط بروتين Gas1-GFP من غشاء PVDF وغسله خمس مرات بالميثانول ومرة ​​واحدة بماء عالي النقاوة مناسب لتحليل الكروماتوغرافيا السائلة-مطياف الكتلة (LC-MS). بحضانة شريط الغشاء مع 500 ميكرولتر من محلول منظم NaOAc بتركيز 0.3 مولار (الأس الهيدروجيني 4.0) و500 ميكرولتر من محلول نتريت الصوديوم بتركيز 1 مولار مُذاب حديثًا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات، يتم تحرير الجزء الدهني من بروتين Gas1-GFP وتحلله. إطلاق سيراميد فوسفات الإينوزين بين الجلوكوزامين والإينوزيتول (51). بعد ذلك، غُسلت شريحة الغشاء أربع مرات بماء مُنقّى بتقنية LC-MS، وجُففت في درجة حرارة الغرفة، وحُفظت في جو من النيتروجين عند -80 درجة مئوية حتى وقت التحليل. وللمقارنة، استُخدمت عينة فارغة من غشاء PVDF في كل تجربة. ثم حُلل الليبيد المُستخلص من Gas1-GFP باستخدام مطياف الكتلة كما هو موضح في المرجع (50). باختصار، عُلقت شرائح PVDF الحاوية على ليبيد GPI في 75 ميكرولتر من مذيب القالب السالب [الكلوروفورم/الميثانول (1:2) + 5 ملي مولار من أسيتات الأمونيوم]، ثم خضعت لتحليل أنواع السفينجوليبيد باستخدام التأين بالرذاذ الإلكتروني (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). في هذه الحالة، حُصل على بيانات مطياف الكتلة في وضع الأيون السالب.
كما ذُكر سابقاً، تم فصل الجزء الدهني من مرساة GPI عن GPI-AP الموسوم بـ[3H]-إينوزيتول (16). فُصلت الدهون باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة باستخدام نظام مذيب (55:45:10 كلوروفورم-ميثانول-0.25% كلوريد البوتاسيوم) وتم تصويرها باستخدام جهاز FLA-7000 (فوجي فيلم).
غُسلت الخلايا المُعبرة عن بروتين Gas1-GFP (600×10⁷) مرتين بمحلول TNE، ثم حُطمت باستخدام خرز زجاجي، ثم خُضعت للطرد المركزي لإزالة حطام الخلايا والخرز الزجاجي. بعد ذلك، خُضع الراسب للطرد المركزي عند 17000 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. غُسل الراسب بمحلول TNE وحُضن مع وحدة واحدة من إنزيم PI-PLC (Invitrogen) في محلول TNE يحتوي على 0.2% من صابونين الديجيتال لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد المعالجة بالإنزيم، أُزيل الغشاء بالطرد المركزي عند 17000 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. لترسيب بروتين Gas1-GFP مناعيًا، حُضن الراسب مع GFP-Trap_A (ChromoTek) عند 4 درجات مئوية طوال الليل. صُبغ بروتين Gas1-GFP المُنقى، المفصول بواسطة SDS-PAGE، بصبغة كوماسي الزرقاء اللامعة. تم فصل شريط التلوين Gas1-GFP عن المنطقة الرمادية المحيطة بالقناة المائية، ثم بعد الألكلة باستخدام يودوأسيتاميد والاختزال باستخدام دايثيوثريتول، تم إجراء الهضم داخل الهلام باستخدام التربسين. استُخلصت الببتيدات التربسينية والببتيدات المرتبطة بـ GPI-جليكان وجُففت. أُذيب الببتيد المجفف في 20 ميكرولتر من الماء. حُقن جزء منه (8 ميكرولتر) في جهاز كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (LC). استُخدم عمود أوكتاديسيل سيلان (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5؛ القطر الداخلي 150 مم × 1.0 مم؛ شركة نومورا كيميكال، محافظة آيتشي، اليابان) لفصل الببتيدات في ظل ظروف تدرج محددة. يتكون الطور المتحرك من المذيب A (0.08% حمض الفورميك) والمذيب B (0.15% حمض الفورميك في 80% أسيتونيتريل). استُخدم نظام Accela HPLC (شركة Thermo Fisher Scientific، بوسطن، ماساتشوستس) لفصل المركبات من العمود باستخدام المذيب A خلال 55 دقيقة بمعدل تدفق 50 ميكرولتر/دقيقة لمدة 5 دقائق، ثم رُفع تركيز المذيب B إلى 40%. (الولايات المتحدة). أُدخل الناتج باستمرار إلى مصدر تأين ESI، وحُللت الببتيدات التريبسينية والببتيدات المرتبطة بـ GPI-glycans باستخدام مطياف الكتلة LTQ Orbitrap XL (مطياف الكتلة الهجين ذو مصيدة الأيونات الخطية-أوربيتراب؛ شركة Thermo Fisher Scientific). في إعداد مطياف الكتلة، ضُبط جهد مصدر الشعيرة على 4.5 كيلوفولت، وحُفظت درجة حرارة الشعيرة الناقلة عند 300 درجة مئوية. وضُبط جهد الشعيرة وجهد عدسة الأنبوب على 15 فولت و50 فولت على التوالي. تم الحصول على بيانات MS في وضع الأيون الموجب (دقة 60000؛ دقة كتلة 10 أجزاء في المليون) في نطاق كتلة 300/m/z نسبة الكتلة/الشحنة (m/z) 3000. يتم الحصول على بيانات MS/MS من خلال مصيدة الأيونات في LTQ Orbitrap XL [الأرقام الثلاثة الأولى التي تعتمد عليها البيانات، التفكك الناتج عن التصادم (CID)].
أُجريت محاكاة الديناميكا الجزيئية باستخدام برنامج GROMACS (52) ومجال القوة MARTINI 2 (53-55). ثم استُخدمت أداة بناء الأغشية CHARMM GUI (56، 57) لإنشاء طبقة ثنائية تحتوي على ثنائي أوليويل فوسفاتيديل كولين (DOPC) وسيرامين C18 أو DOPC وسيرامين C26. استُخلصت بنية وإحداثيات سيراميد C26 من DXCE بإزالة الخرزات الزائدة من ذيل السفينجوزين. استخدم العملية الموضحة أدناه لموازنة الطبقة المزدوجة وتشغيلها، ثم استخدم الإحداثيات الأخيرة للنظام لإنشاء نظام يحتوي على Emp24. تم بناء نطاق الغشاء العابر لبروتين Emp24 في الخميرة (بقايا الأحماض الأمينية من 173 إلى 193) على شكل حلزون ألفا باستخدام أداة البنية الجزيئية في برنامج VMD (58). بعد إزالة الدهون المتداخلة، تم تحبيب البروتين بشكل خشن وإدخاله في الطبقة الثنائية باستخدام برنامج CHARMM GUI. يحتوي النظام النهائي على 1202 جزيء من DOPC و302 جزيء من Cer C26، أو 1197 جزيء من DOPC و295 جزيء من Cer C18 وEmp24. تم تأيين النظام إلى تركيز 0.150 مولار. أُجريت أربع تجارب مستقلة لكل تركيبة من تركيبتي الطبقة الثنائية.
تتم موازنة الطبقة الدهنية الثنائية باستخدام عملية واجهة المستخدم الرسومية لبرنامج CHARMM، والتي تتضمن تقليل الطاقة ثم موازنتها في 405,000 خطوة، حيث يتم تقليل قيود الموضع تدريجيًا وإزالتها، وتزداد خطوة الزمن من 0.005 بيكو ثانية إلى 0.02 بيكو ثانية. بعد الوصول إلى حالة التوازن، ينتج البرنامج 6 ميكرو ثانية بخطوة زمنية قدرها 0.02 بيكو ثانية. بعد إدخال Emp24، استخدم نفس عملية واجهة المستخدم الرسومية لبرنامج CHARMM لتقليل الطاقة وموازنة النظام، ثم قم بتشغيله لمدة 8 ثوانٍ في وضع الإنتاج.
في جميع الأنظمة، يُتحكم بالضغط أثناء عملية الموازنة بواسطة منظم الضغط بيريندسن (59)، بينما يُتحكم به أثناء عملية الإنتاج بواسطة منظم الضغط بارينيلو-رحمن (60). في جميع الحالات، يبلغ متوسط ​​الضغط 1 بار، ويُستخدم نظام اقتران ضغط شبه متساوي الخواص. في عمليتي الموازنة والإنتاج، يُستخدم منظم حرارة (61) مع إعادة معايرة السرعة لربط درجة حرارة جزيئات البروتين والدهون والمذيب على التوالي. خلال العملية بأكملها، تبلغ درجة الحرارة المستهدفة 310 كلفن. يُحسب التفاعل غير الرابط من خلال إنشاء قائمة اقتران باستخدام مخطط فيرليه مع هامش خطأ 0.005. يُحسب حد كولوم باستخدام مجال التفاعل ومسافة قطع 1.1 نانومتر. يستخدم حد فان دير فالس مخطط قطع بمسافة قطع 1.1 نانومتر، ويُستخدم مخطط قطع فيرليه للانحراف المحتمل (62).
باستخدام برنامج VMD، يبلغ طول الموجة الفاصلة بين حبيبات فوسفات DOPC أو حبيبات سيراميد AM1 والبروتين 0.7 نانومتر، ويتم حساب عدد الليبيدات المتفاعلة مع البروتين. وفقًا للصيغة التالية، يتم حساب عامل الاستنزاف-الإثراء (DE) كما في (63): عامل DE = (كمية الليبيدات الكلية في البروتين 0.7) / (كمية السيراميد في الليبيدات الكلية).
تُحسب القيمة المُبلغ عنها كمتوسط، وتمثل أشرطة الخطأ أربع نسخ مستقلة من الخطأ المعياري. تُحسب الدلالة الإحصائية لعامل DE باستخدام اختبار t [(متوسط ​​عامل DE - 1) / الخطأ المعياري]. احسب قيمة P من التوزيع أحادي الطرف.
استُخدمت أداة GROMACS لحساب خريطة الكثافة الجانبية ثنائية الأبعاد للنظام الذي يحتوي على Emp24 خلال آخر 250 نانوثانية من التتبع. وللحصول على خريطة إثراء/استنزاف السيراميد، قُسّمت خريطة كثافة السيراميد على مجموع خريطتي السيراميد وDOPC، ثم قُسّمت على تركيز السيراميد في الجسم. واستُخدم نفس مقياس خريطة الألوان.
للاطلاع على المواد التكميلية لهذه المقالة، يرجى زيارة الرابط التالي: http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
هذه مقالة متاحة للجميع بموجب شروط رخصة المشاع الإبداعي نَسب المُؤَلِّف - غير تجاري، والتي تسمح باستخدامها وتوزيعها وإعادة إنتاجها بأي وسيلة، شريطة ألا يكون الاستخدام النهائي لأغراض تجارية وأن يكون العمل الأصلي صحيحًا. مرجع.
ملاحظة: نطلب منك فقط تزويدنا بعنوان بريدك الإلكتروني لكي يعلم الشخص الذي توصي به للصفحة أنك ترغب في أن يرى الرسالة وأنها ليست رسالة مزعجة. لن نقوم بتسجيل أي عناوين بريد إلكتروني.
يُستخدم هذا السؤال لاختبار ما إذا كنت زائرًا ولمنع إرسال الرسائل غير المرغوب فيها تلقائيًا.
صوفيا رودريجيز جالاردو، كازو كوروكاوا، سوزانا سابيدو بوزو، أليخاندرو كورتيز · جوميز (أليخاندرو كورتيس جوميز)، أتسوكو إيكيدا (أتسوكو إيكيدا)، فاليريا زوني (فاليريا زوني)، أوكسيليادورا أجيليرا روميرو، آنا ماريا بيريز لينيرو)، سيرجيو لوبيز (سيرجيو لوبيز)، ميهو واجا. (ميهو واجا)، ميساكو أرمان (ميساكو أرمان)، مياكو ريمان (مياكو ريمان)، برو أكيرا، ستيفانو فاني، أكيهيكو ناكانو، مانويل مونيز
يكشف التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة في الوقت الحقيقي عن أهمية طول سلسلة السيراميد لفرز البروتين في مواقع الإخراج الانتقائية.
صوفيا رودريجيز جالاردو، كازو كوروكاوا، سوزانا سابيدو بوزو، أليخاندرو كورتيز · جوميز (أليخاندرو كورتيس جوميز)، أتسوكو إيكيدا (أتسوكو إيكيدا)، فاليريا زوني (فاليريا زوني)، أوكسيليادورا أجيليرا روميرو، آنا ماريا بيريز لينيرو)، سيرجيو لوبيز (سيرجيو لوبيز)، ميهو واجا. (ميهو واجا)، ميساكو أرمان (ميساكو أرمان)، مياكو ريمان (مياكو ريمان)، برو أكيرا، ستيفانو فاني، أكيهيكو ناكانو، مانويل مونيز
يكشف التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة في الوقت الحقيقي عن أهمية طول سلسلة السيراميد لفرز البروتين في مواقع الإخراج الانتقائية.
©2020 الجمعية الأمريكية لتقدم العلوم. جميع الحقوق محفوظة. AAAS هي شريك لـ HINARI، وAGORA، وOARE، وCHORUS، وCLOCKSS، وCrossRef، وCOUNTER. تقدم العلوم ISSN 2375-2548.