نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
على عكس الفقاريات، يُعتقد على نطاق واسع أن الحشرات تفتقر إلى الهرمونات الجنسية الستيرويدية التي تُهيمن على الذكور. في بعوضة الأنوفيلس الغامبية، يبدو أن هرمون الإكديسون الستيرويدي 20-هيدروكسي إكديسون (20E) قد تطور للتحكم في نمو البيض عند تصنيعه من قبل الإناث، ولتحفيز فترة مقاومة للتزاوج عند نقله جنسيًا من قبل الذكور. ولأن نمو البيض والتزاوج من السمات التناسلية الأساسية، فإن فهم كيفية دمج إناث بعوض الأنوفيلس لهذه الإشارات الهرمونية قد يُسهل تصميم برامج جديدة لمكافحة الملاريا. هنا، نكشف أن هذه الوظائف التناسلية تُنظم بواسطة هرمونات جنسية ستيرويدية متميزة من خلال شبكة معقدة من الإنزيمات المنشطة/المثبطة للإكديستيرويد. حددنا إكديسونًا مؤكسدًا خاصًا بالذكور، وهو 3-ديهيدرو-20E (3D20E)، الذي يحمي الأبوة عن طريق إيقاف الاستجابة الجنسية للإناث بعد النقل الجنسي والتنشيط عن طريق إزالة الفسفرة. والجدير بالذكر أن نقل 3D20E حث أيضًا على التعبير عن الجينات التناسلية تحافظ هذه الهرمونات على نمو البيض أثناء الإصابة بالبلازموديوم، مما يضمن صحة الإناث المصابة. لا يُثير هرمون 20E المُفرز من الإناث استجابة جنسية، ولكنه يسمح للأفراد المتزاوجة بوضع البيض بعد تثبيط الكينازات المُثبطة له. يُشير تحديد هذا الهرمون الستيرويدي الحشري الخاص بالذكور ودوره في تنظيم الاستجابة الجنسية للإناث وخصوبتها وتفاعلها مع البلازموديوم إلى إمكانية الحد من نجاح تكاثر البعوض الناقل للملاريا.
تتزايد حالات الإصابة بالملاريا والوفيات الناجمة عنها مجدداً⁴ بسبب انتشار مقاومة المبيدات الحشرية لدى بعوض الأنوفيلس، الناقل الوحيد لطفيليات الملاريا التي تصيب الإنسان. وتُعدّ بيولوجيا التزاوج لدى هذا البعوض هدفاً جذاباً بشكل خاص لتدخلات مكافحة الملاريا الجديدة، لأن الإناث تتزاوج مرة واحدة فقط⁵؛ وجعل عملية التزاوج هذه عقيمة من شأنه أن يقلل بشكل كبير من أعداد البعوض في البيئة.
تُصاب النساء بعجز جنسي بعد تلقيهن جرعات عالية من الهرمونات الستيرويدية من الرجال. وقد أظهرت الدراسات أن مُحفز صعوبة التزاوج هو هرمون 20-هيدروكسي إيكديسون (20E)، وهو هرمون ستيرويدي معروف بدوره في تنظيم دورة الانسلاخ في المرحلة اليرقية. وقد تطورت قدرة الذكور على تصنيع ونقل هرمون 20E تحديدًا في أنواع البعوض الأنوفيلي التي تنتمي إلى الجنس الفرعي Cellia7، والمنتشرة في أفريقيا والتي تضم أخطر نواقل الملاريا، بما في ذلك بعوضة الأنوفيلي الغامبية. ويُعد هذا الأمر جديرًا بالملاحظة بشكل خاص لأن إناث هذه الأنواع تُنتج أيضًا هرمون 20E بعد كل وجبة دم، وهو الهرمون الذي يُحفز دورة تكوين البويضات (انظر المرجع 8). ومع ذلك، لا يُعرف الكثير عن كيفية دمج الإناث للإشارات من مصدرين مختلفين للإيكديسون (نقله من الذكور وتحفيزه بالتغذية على الدم) دون المساس بقدرتهن على التزاوج. في الواقع، إذا كان هرمون 20E الذي تُنتجه الإناث يُحفز الرغبة الجنسية، فإن هرمون 20E الذي تُنتجه الإناث يُحفز الرغبة الجنسية عدم التسامح، وهذا سيؤدي إلى العقم لدى الأفراد الذين يتغذون على العذارى، وهو سلوك شائع جدًا في هذه البعوضة.
أحد التفسيرات المحتملة هو أن ذكور بعوضة الأنوفيل الغامبية تنقل هرمون الإكديسون المعدل الخاص بالذكور، والذي ينشط سلسلة من الإشارات في الجهاز التناسلي الأنثوي، مما يؤدي إلى عدم استقرار التزاوج. ومع ذلك، على الرغم من أن الفقاريات لديها العديد من الهرمونات الستيرويدية، مثل الإستروجين والأندروجين (راجع المرجع 9)، فإنه على حد علمنا، لم يتم تحديد الستيرويدات ذات التأثير الأندروجيني في الحشرات.
شرعنا في تحديد مجموعة الهرمونات الستيرويدية في الغدة الملحقة الذكرية (MAG) للبعوضة الأنوفيلية الغامبية الناضجة جنسيًا، بحثًا عن ستيرويدات مُعدِّلة محتملة. باستخدام تقنية كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء المقترنة بقياس الطيف الكتلي الترادفي (HPLC-MS/MS) بدلًا من الطريقة الأقل دقة المستخدمة سابقًا، كشفنا عن وجود الإكديسون (E) و20E في هذا النسيج، مؤكدين بذلك النتائج السابقة. مع ذلك، هيمنت على العينة الستيرويدات المؤكسدة المفسفرة، بما يتوافق مع الصيغة 3-ديهيدرو-20E-22-فوسفات (3D20E22P)12 (الشكل 1). تشمل الأشكال الأخرى 3-ديهيدرو-20E (3D20E) و20E-22-فوسفات (20E22P). كانت شدة إشارة HPLC-MS/MS لـ 3D20E22P أعلى بمقدار رتبتين من حيث الحجم من شكله غير المفسفر، 3D20E، وأعلى بمقدار ثلاث رتب من حيث الحجم من ذلك الخاص بهرموني E و20E (الشكل 1). على الرغم من وجودها في أجزاء أخرى من الجسم والجهاز التناسلي السفلي (الشكل 1أ من البيانات الإضافية). قمنا أيضًا بتحليل الإكديستيرويدات في الذكور والإناث حديثي الفقس (أقل من يوم واحد) واكتشفنا 3D20E و3D20E22P فقط في الغدد التناسلية الذكرية؛ بينما وُجدت هرمونات E و20E و20E22P في كلا الجنسين (الشكل 1ب من البيانات الإضافية). تشير هذه البيانات إلى أن ذكور بعوضة الأنوفيلة الغامبية البالغة تُنتج مستويات عالية من الهرمونات المعدلة في غددها التناسلية الذكرية، وهي مستويات لا تُنتجها الإناث.
تم تشريح الغدد التناسلية الأنثوية (MAG) والجهاز التناسلي الأنثوي (LRT) (بما في ذلك الأذينين والحويصلات المنوية والمبيض المجاور) من ذكور عذارى عمرها 4 أيام (عمر 4 أيام) وإناث عذارى ومتزاوجة (0.5 و3 و12 ساعة بعد التزاوج). تم تحليل الإكديسون في هذه الأنسجة باستخدام تقنية HPLC-MS/MS (المتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط؛ اختبار t غير المقترن، ثنائي الجانب، مصحح لمعدل الاكتشاف الخاطئ (FDR)؛ NS، غير دال إحصائيًا؛ *P < 0.05، **P < 0.01. 3D20E: 3 ساعات مقابل 0.5 ساعة، P = 0.035؛ 12 ساعة مقابل 3 ساعات، P = 0.0015؛ 12 ساعة مقابل 0.5 ساعة، P = 0.030. 3D20E22P: 3 ساعات مقابل 0.5 ساعة، P = 0.25؛ 12 ساعة (مقارنةً بـ 3 ساعات، P = 0.0032؛ و12 ساعة مقابل 0.5 ساعة، P = 0.015). البيانات مأخوذة من ثلاث عينات بيولوجية متكررة. تم حساب مساحة الذروة لكل إيكديسون محل اهتمام، وتمت معايرتها وفقًا لعدد البعوض. يُرمز للإيكديسون بالألوان كما يلي: E، أخضر؛ 20E، برتقالي؛ 20E22P، بنفسجي؛ 3D20E، أزرق؛ 3D20E22P، وردي. يُظهر الشكل المُدرج زيادة في مقياس المحور الصادي لإظهار مستويات الإيكديسون المنخفضة.
للتحقق مما إذا كان هرمونا 3D20E22P و3D20E ينتقلان أثناء التزاوج، قمنا بتشريح الجهاز التناسلي الأنثوي في أوقات مختلفة بعد التزاوج. على الرغم من عدم وجود الإكديسون في الإناث العذارى، لاحظنا وجود كميات كبيرة من 3D20E22P في الجهاز التناسلي مباشرة بعد التزاوج (0.5 ساعة بعد التزاوج)، والتي انخفضت بمرور الوقت، بينما ارتفعت مستويات 3D20E بشكل ملحوظ (الشكل 1). باستخدام 3D20E المُصنّع كيميائيًا كمعيار، حددنا أن مستويات هذا الهرمون الستيرويدي في الجهاز التناسلي أثناء التزاوج كانت أعلى بمئة ضعف على الأقل من 20E (جدول البيانات الإضافية 1). بالتالي، يُعد 3D20E22P هو الإكديسون الذكري الرئيسي الذي ينتقل إلى الجهاز التناسلي الأنثوي أثناء التزاوج، ويصبح شكله غير المُفسفر، 3D20E، وفيرًا جدًا بعد التزاوج بفترة وجيزة. يشير هذا إلى دور مهم للإكديسون الأخير في الإناث. بيولوجيا ما بعد التزاوج.
بعد إنشاء مجموعة بيانات جديدة لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) (الشكل 2أ)، باستخدام مسار معلوماتي حيوي مُصمم خصيصًا، بحثنا عن كيناز الإكديسون (EcK)، وأكسيداز الإكديسون (EO)، وجين فوسفاتاز الإكديسون المُعدَّل 20E. يُعبَّر عن EPP في الأنسجة التناسلية. حددنا جينًا مرشحًا واحدًا لـ EPP وجينين محتملين لـ EcK (EcK1 وEcK2)، لكننا لم نتمكن من العثور على جين مرشح جيد لـ EO. والجدير بالذكر أن جينات EPP الفردية كانت تُعبَّر عنها بمستويات عالية (النسبة المئوية 98.9) في MAGs الغامبية ولكن ليس في LRTs الأنثوية (الشكل 2ب)، على عكس توقعاتنا نظرًا لحدوث إزالة الفسفرة لـ 3D20E22P في هذا النسيج الأنثوي. لذلك، نعتقد أن EPP الذكري قد ينتقل أثناء التزاوج. في الواقع، استخدمنا وسم النظائر المستقرة في الجسم الحي لإخفاء البروتين الأنثوي بعد تم تحديد إنزيم التزاوج بواسطة مطياف الكتلة في الأذين الأنثوي (الشكل 2ج والجدول التكميلي 1). كما تم تأكيد وجود EPP في MAG و LRT الأنثوي المتزاوج (وليس العذراء) باستخدام أجسام مضادة محددة (الشكل 2د).
أ- مسار معلوماتي حيوي مُصمم خصيصًا للبحث في الأنسجة التناسلية لكل جنس عن الجينات التي تُشفّر إنزيمات EcKs وEOs وEPPs. تشير الأرقام بجوار الأسهم إلى عدد المرشحين من الذكور والإناث في كل خطوة. حدد هذا التحليل جين EPP واحدًا (EPP) وجين EcK واحدًا (EcK1) يُعبَّر عنهما في الذكور، وجين EcK واحدًا (EcK2) يُعبَّر عنه في كلا الجنسين ولكنه لا يُنتج جين EO مرشحًا. ب- خريطة حرارية تُقارن التعبير الجيني للجينات المرشحة في أنسجة بعوضة الأنوفيلة الغامبية (Anopheles gambiae) والأنوفيلة البيضاء (Anopheles albicans) في مرحلة العذرية (V) والتزاوج (M). Spca: الإخصاب؛ MAGs: الغدد الملحقة في الذكور. أجزاء أخرى من الجسم، بما في ذلك الثديين والأجنحة والأرجل والأجسام الدهنية والأعضاء الداخلية لدى كلا الجنسين، والمبايض لدى الإناث. يُعبر عن EcK2 بكثافة في كل من الغدد الليمفاوية التناسلية الذكرية والأذينات لدى ذبابة غامبيا، بينما يوجد EPP فقط في الغدد الليمفاوية التناسلية الذكرية. ج- تحليل البروتينات لانتقال مجموعة السائل المنوي الذكري إلى أذينات الإناث عند 3 و12 و24 ساعة بعد القذف، يُظهر البروتينات الـ 67 الأكثر وفرة. رُبّيت الإناث على نظام غذائي يحتوي على 15N لوسم (وإخفاء) جميع البروتينات. زُوجت الذكور غير الموسومة مع إناث موسومة، وشُرِّحت الأنابيب التنفسية السفلية للإناث عند 3 و12 و24 ساعة بعد القذف لتحليل البروتينات (انظر الجدول التكميلي 1 للاطلاع على قائمة كاملة ببروتينات القذف). في الشكل المُدرج، تم الكشف عن EPP وEck1 وEcK2 في الغدد الليمفاوية التناسلية الذكرية للذكور العذارى من خلال تحليل البروتينات لهذه الأنسجة. د- تم الكشف عن EPP بواسطة لطخة ويسترن في الغدد الليمفاوية التناسلية الذكرية والأنابيب التنفسية السفلية للإناث الملقحة، ولكن لا يوجد في الإناث العذارى أو الذكور أو باقي جسم الأنثى. تم فحص الأغشية في وقت واحد باستخدام أجسام مضادة للأكتين (كعنصر تحكم في التحميل) وأجسام مضادة لـ EPP. جميع الذكور عذارى. انظر الشكل التكميلي 1 لبيانات مصدر الجل. تم إجراء لطخات ويسترن مرتين بنتائج مماثلة.
تم التحقق من نشاط فوسفاتاز الإكديستيرويد EPP بعد حضانته بتقنية HPLC-MS/MS مع 3D20E22P المعزول من MAG (الشكل 2أ من البيانات الإضافية). علاوة على ذلك، عند تثبيط EPP باستخدام التداخل بوساطة الحمض النووي الريبوزي (RNAi)، لاحظنا انخفاضًا ملحوظًا في نشاط الفوسفاتاز في الأنسجة التناسلية لهذه الذكور (الشكل 3أ)، وأظهرت الإناث التي تزاوجت مع ذكور مُثبَّط فيها EPP انخفاضًا ملحوظًا في نسبة 3D20E غير المُفسفر (الشكل 3ب) على الرغم من التثبيط الجزئي للجين (الشكل 2ب، ج من البيانات الإضافية). في المقابل، لم نرصد تغيرات ملحوظة في نسبة 20E22P/20E في نفس البعوض، مما قد يشير إلى أن الإنزيم متخصص في 3D20E22P (الشكل 3ب).
أ- انخفاض نشاط الفوسفاتاز في MAG الناتج عن إسكات EPP باستخدام RNA مزدوج السلسلة EPP (dsEPP) أو RNA مزدوج السلسلة GFP (dsGFP) كضوابط. تم استخدام 20 مجموعة MAG في كل تكرار (P = 0.0046، اختبار t مزدوج، ثنائي الاتجاه)، ممثلة بنقاط منفصلة. ب- الإناث التي تزاوجت مع ذكور تم إسكات EPP لديها نسبة أقل بكثير من 3D20E غير المفسفر عند 3 ساعات بعد التزاوج (P = 0.0043، اختبار t غير مزدوج، ثنائي الاتجاه)، بينما لم تتأثر مستويات 20E (P = 0.063، غير مزدوج). اختبار t، ثنائي الاتجاه). تُعرض البيانات كمتوسط ​​± خطأ معياري للمتوسط ​​من ثلاث مجموعات من 13 و16 و19 أنثى لكل منها. ج، الإناث التي تزاوجت مع ذكور مثبطة لـ EPP كان لديها معدلات إعادة تزاوج أعلى بشكل ملحوظ (P = 0.0002، اختبار فيشر الدقيق، ثنائي الاتجاه). أُجبرت الإناث أولاً على التزاوج لضمان حالة التزاوج الخاصة بها؛ بعد يومين، تم التواصل مع ذكور أخرى تحمل حيوانات منوية معدلة وراثيًا لتقييم معدلات التزاوج المتكرر عن طريق الكشف الكمي عن الجين المعدل باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أظهرت الإناث التي تغذت على الدم وتزاوجت مع ذكور مثبطة لجين EPP انخفاضًا ملحوظًا في الخصوبة (P < 0.0001؛ اختبار مان-ويتني، ثنائي الاتجاه) وانخفاضًا طفيفًا في عدد البيض (P = 0.088، اختبار مان-ويتني، ثنائي الاتجاه)، بينما لم يتأثر معدل التبويض (P = 0.94، اختبار فيشر الدقيق، ثنائي الاتجاه). في جميع اللوحات، يمثل n عدد عينات البعوض المستقلة بيولوجيًا. NS، غير دال إحصائيًا. *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، ****P < 0.001.
بعد ذلك، قمنا بتقييم ما إذا كان نزع الفوسفات من الإكديسون مهمًا لتحفيز مقاومة التزاوج لدى الإناث. والجدير بالذكر أن الإناث التي تزاوجت مع ذكور مستنفدة من EPP تزاوجت مرة أخرى بتردد أعلى بكثير (44.9%) من الإناث الضابطة (10.4%) عند تعرضها لذكور إضافية (معدلة وراثيًا) (الشكل 3ج). كما لاحظنا انخفاضًا ملحوظًا في الخصوبة (الشكل 3د، يسار) وانخفاضًا طفيفًا في عدد البيض الذي تضعه هذه الإناث (الشكل 3د، وسط)، بينما لم تتأثر النسبة المئوية للبيض الذي تضعه الإناث (استجابة أخرى تحدث لدى الإناث نتيجة التزاوج) (الشكل 3د، يمين). بالنظر إلى الخصوصية الملحوظة لـ EPP تجاه 3D20E22P، تشير هذه النتائج إلى أن تنشيط 3D20E بواسطة EPP المنتقل أثناء التزاوج قد يكون له دور مهم في إيقاف تقبل الإناث لمزيد من التزاوج، وهو سلوك نُسب سابقًا إلى الانتقال الجنسي لـ 20E. لذلك، فإن هذا يؤثر الهرمون الخاص بالذكور أيضاً بشكل كبير على خصوبة الإناث.
بعد ذلك، قارنا أنشطة 20E و3D20E في تجارب الحقن في إناث عذارى ناضجة جنسياً باستخدام 3D20E المصنّع كيميائياً (الشكل 4أ-ج) و20E المتوفر تجارياً. لاحظنا أن 3D20E كان أكثر فعالية بشكل ملحوظ من 20E في إيقاف حساسية الإناث للتزاوج عند كلا التركيزين (الشكل 4د). والجدير بالذكر أن نصف المستوى الفسيولوجي لـ 3D20E في الجهاز التناسلي الأنثوي (1066 بيكوغرام بعد الحقن مقابل 2022 بيكوغرام بعد التزاوج) أدى إلى نسبة من الإناث المقاومة أعلى بعشرين ضعفاً من المستوى الفسيولوجي لـ 20E (361 بيكوغرام بعد الحقن) بعد 24 ساعة من الحقن عند أعلى تركيز 18 بيكوغرام بعد التزاوج؛ (انظر الجدول 1 من البيانات الموسعة). تتفق هذه النتيجة مع فكرة أن الانتقال الجنسي لهرمون 20E لا يُسبب فترات مقاومة للتزاوج، وتشير كذلك إلى أن 3D20E عامل رئيسي في ضمان العلاقة بين الأبوين والطفل. كما كان 3D20E أكثر نشاطًا بشكل ملحوظ من 20E في اختبارات وضع البيض لدى الإناث العذارى (الشكل 4هـ)، مما يوحي بأن معدل وضع البيض الطبيعي الذي لاحظناه بعد التثبيط الجزئي لـ EPP كان بسبب وجود نشاط متبقٍ لـ 3D20E لا يزال ناتجًا عن عوامل أنثوية مُحفزة بالتزاوج.
(أ، ب) تم تصنيع 3D20E كيميائيًا من 20E (أ) بكفاءة تحويل عالية جدًا (البيانات معروضة كمتوسط ​​± خطأ معياري للمتوسط ​​من ثلاث تفاعلات تصنيع مستقلة) (ب). ج، يتطابق طيف الكتلة (النصف السفلي) تمامًا مع الإكديسون الموجود في الجهاز التناسلي الأنثوي الملقح (النصف العلوي). د، بالمقارنة مع 20E (0.63 ميكروغرام، P = 0.02؛ 0.21 ميكروغرام، P < 0.0001؛ اختبار فيشر الدقيق، ثنائي الاتجاه) و10% إيثانول (0.63 ميكروغرام، P < 0.0001؛ 0.21 ميكروغرام، P < 0.0001؛ اختبار فيشر الدقيق، ثنائي الاتجاه)، بينما كان تركيز 20E أعلى بشكل ملحوظ من المجموعة الضابطة فقط عند الجرعات العالية (0.63 ميكروغرام، P = 0.0002؛ 0.21 ميكروغرام، P < 0.0001؛ اختبار فيشر الدقيق، ثنائي الاتجاه). (P = 0.54؛ اختبار فيشر الدقيق، ثنائي الاتجاه). هـ، أدى حقن 3D20E إلى معدلات تبويض أعلى بشكل ملحوظ في الإناث العذارى مقارنةً بمجموعة التحكم التي تحتوي على 10% إيثانول (0.21 ميكروغرام، P < 0.0001؛ 0.13 ميكروغرام، P = 0.0003؛ اختبار فيشر الدقيق، ثنائي الاتجاه)، بينما أدى حقن 20E مقارنةً بمجموعة التحكم فقط عند الجرعات العالية (0.21 ميكروغرام، P = 0.022؛ 0.13 ميكروغرام، P = 0.0823؛ اختبار فيشر الدقيق، ثنائي الاتجاه). كما أدى حقن 3D20E إلى معدلات تبويض أعلى بشكل ملحوظ من حقن 20E عند الجرعات العالية (0.21 ميكروغرام، P = 0.0019؛ 0.13 ميكروغرام، P = 0.075؛ اختبار فيشر الدقيق، ثنائي الاتجاه). في جميع اللوحات، يمثل n عدد عينات بعوض مستقلة بيولوجيًا. NS، غير دال إحصائيًا. *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، ****P < 0.001. البيانات مأخوذة من ثلاث عينات مكررة.
في دراسات سابقة، حددنا أن انتقال الهرمونات الستيرويدية جنسيًا يحفز التعبير عن جين MISO (محفز تكوين البويضات الناتج عن التزاوج 11)، وهو جين تناسلي أنثوي يحمي إناث بعوضة الأنوفيلس الغامبية من عدوى المتصورة المنجلية 13، وهي أخطر طفيليات الملاريا التي تصيب الإنسان. ونظرًا لأهمية MISO في اللياقة التناسلية لبعوضة الأنوفيلس في المناطق الموبوءة بالملاريا، قررنا تحديد أي من الهرمونين، 3D20E أو 20E، يحفز التعبير عن هذا الجين. وجدنا أنه في حين أن حقن 20E يحفز بشكل خاص أو أكثر فعالية بعض مستقبلات الهرمونات النووية (HR)، مثل HR3 وHR4، والأهداف الستيرويدية النموذجية اللاحقة، مثل جينات تكوين صفار البيض Vg14 و15 و16، فإن MISO يحفز بشكل أقوى بواسطة 3D20E (الشكل 3 من البيانات الإضافية). وبالتالي، يبدو أن انتقال هذا الهرمون الستيرويدي الأندروجيني جنسيًا يحفز آليات تحمي الإناث من أضرار العدوى الطفيلية. علاوة على ذلك، يؤثر 3D20E بشكلٍ مختلف على كلا شكلي مستقبل الإكديسون EcR، حيث يحفز EcR-A ويكبح EcR-B، كما أنه يحفز بقوة أكبر جينات أخرى محفزة للتزاوج، بما في ذلك HPX15، مما يؤثر على خصوبة الإناث. قد يفسر هذا العقم الملحوظ لدى الإناث المتزاوجة مع ذكور مثبطة لجين EPP (الشكل 3 من البيانات الإضافية). تشير هذه البيانات إلى وجود مسارات لاحقة يتم تنشيطها بشكل تفضيلي بواسطة هرموني الإكديسون، والتي قد تكون أساس الوظيفة الخاصة بكل جنس.
بعد ذلك، اختبرنا وظيفة جيني EcK اللذين تم تحديدهما في برنامجنا المعلوماتي الحيوي. أدى تثبيط EcK1 أو EcK2 إلى معدل وفيات مرتفع لدى الذكور (الشكل 4أ من البيانات الإضافية)، مما يشير إلى أن فسفرة الإكديسون، وبالتالي تعطيله، أمر بالغ الأهمية للبقاء على قيد الحياة. ولأن EcK2 كان يُعبَّر عنه بمستويات أعلى من EcK1، وتم الكشف عنه في MAGs بواسطة البروتينات (الشكل 2ب، ج والجدول التكميلي 2)، فقد تحققنا من نشاط كيناز الإكديستيرويد الخاص به عن طريق حضنه مع 20E، مما أدى إلى فسفرة 20E22P (الشكل 2ب من البيانات الإضافية). عند استخدام 3D20E كركيزة، لم نتمكن من الكشف عن الناتج المفسفر 3D20E22P (الشكل 4ج من البيانات الإضافية)، مما يشير إلى أن 20E، وليس 3D20E، قد يكون الهدف المفضل لـ EcK2.
وفقًا لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)، كان إنزيم EcK2 مُعبرًا عنه بكثرة في الجهاز التناسلي الأنثوي الأيسر لدى الإناث العذارى، حيث توقف تعبيره بعد التزاوج (الشكل 2ب). وقد أكدنا هذه البيانات، وتوصلنا إلى أن تعبير EcK2 لم يتأثر بالتغذية على الدم (الشكل 5أ من البيانات الإضافية). وبتوسيع نطاق تجاربنا الأولية باستخدام مطياف الكتلة، وجدنا أن ذروة 20E22P كانت مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بذروة 20E (بعد 22-26 ساعة من التغذية على الدم؛ الشكل 5ب من البيانات الإضافية). وأدى تثبيط EcK2 لدى الإناث العذارى إلى زيادة ثلاثة أضعاف في النسبة النسبية لـ 20E إلى 20E22P بعد 26 ساعة من التغذية على الدم (الشكلان 2ج و5ج من البيانات الإضافية)، مما يؤكد أن EcK2 يُفسفر 20E أيضًا لدى الإناث. والجدير بالذكر أن الإناث العذارى اللاتي تم استنفاد EcK2 لديهن حافظن على كامل استعدادهن الجنسي (الشكلان 5د و5هـ من البيانات الإضافية). تشير النتائج إلى أن إنتاج الإناث لهرمون 20E لا يُحفز فترات مقاومة للتزاوج. ومع ذلك، فقد لوحظ ارتفاع ملحوظ في معدلات وضع البيض لدى هذه الإناث مقارنةً بالمجموعة الضابطة، حيث وضعت أكثر من 30% من الإناث العذارى بيضًا (الشكل 5f من البيانات الإضافية). عند حقن الحمض النووي الريبوزي المزدوج السلسلة Eck2 (dsEcK2) بعد التغذية على الدم، لم يحدث التبويض، حيث انخفضت ذروة هرمون 20E الناتجة عن امتصاص الدم. بشكل عام، تدعم هذه النتائج نموذجًا مفاده أن هرمون 20E المُنتج بعد امتصاص الدم يُمكن أن يُحفز التبويض، ولكن فقط عندما يتم إيقاف تثبيط التبويض (EcK2 وربما عوامل أخرى) عن طريق التزاوج. لم تُثبط حقن هرمون 20E أو 3D20E التعبير عن EcK2 في الإناث العذارى (الشكل 5g من البيانات الإضافية)، مما يُشير إلى أن عوامل أخرى تتوسط تثبيط هذا الكيناز. ومع ذلك، لم تكن مستويات هرمون 20E بعد التغذية على الدم كافية لإحداث انزعاج أثناء التزاوج، ولكنها كانت فعالة يتم تحفيزها بواسطة مستويات عالية من فيروس 3D20E المنقول جنسياً.
تُقدّم نتائجنا رؤىً مهمة حول الآليات التي تُنظّم النجاح التناسلي لبعوضة الأنوفيلة الغامبية. وقد ظهر نموذجٌ يُشير إلى أن الذكور قد تطورت لتخليق مستويات عالية من 3D20E، وهو إيكديسون مُعدّل خاص بالذكور، يضمن الأبوة عن طريق تقليل حساسية الإناث للتزاوج. في الوقت نفسه، طوّرت هذه النواقل للملاريا نظامًا فعالًا لتنشيط 3D20E في الإناث استجابةً للانتقال الجنسي لببتيدات الجنس الخاصة بالذكور. على حد علمنا، يُعدّ هذا المثال الأول لنظام هرموني ستيرويدي يهيمن عليه الذكور والإناث، ويؤدي وظيفة فريدة وحاسمة في الحشرات. وقد تم افتراض وظيفة الإيكديسون الخاصة بالذكور، ولكن لم يتم إثباتها بشكل قاطع. على سبيل المثال، هناك فرضية تم دحضها إلى حد كبير، وهي أن هذه الوظائف قد يؤديها طليعة 20E، وهي E1. من المعروف جيدًا أنه في ذبابة الفاكهة، يتم تحفيز أحادية الذكر عن طريق الانتقال الجنسي لببتيدات جنسية صغيرة تتفاعل مع الخلايا العصبية. عصب الجهاز التناسلي الأنثوي من خلال مستقبلات الببتيد الجنسي المحددة 21،22. هناك حاجة إلى مزيد من العمل لتحديد مسارات الإشارات اللاحقة التي يتحكم فيها 3D20E في إناث A. gambiae وتحديد ما إذا كان من الممكن الحفاظ على هذه المسارات بين البعوض وذبابة الفاكهة.
بالنظر إلى الدور المهم الذي يلعبه هرمون 3D20E في خصوبة الإناث وسلوكها، والذي تم تحديده في دراستنا، فإن المسارات المؤدية إلى تخليق وتفعيل هذا الهرمون توفر فرصًا جديدة لاستراتيجيات مكافحة البعوض المستقبلية، مثل إنتاج ذكور عقيمة قادرة على المنافسة في استراتيجيات تقنية الحشرات العقيمة، أو استخدامها في إطلاقها في البرية، أو لمحاكاة دور هرمون 3D20E في سلوك التزاوج لدى الإناث. وقد تكون الوظيفة الخاصة بالذكور لهرمون 3D20E قد تطورت عندما اكتسبت بعوضة الأنوفيلة الغامبية وأنواع أخرى من جنس Cellia القدرة على تخثر سائلها المنوي في سدادات التزاوج، حيث يسمح ذلك بنقل أعداد كبيرة من الهرمونات والإنزيمات المنشطة للهرمونات بكفاءة. وبدورها، يوفر تطور هرمون 3D20E الذي يُفعّل نظام التزاوج الأحادي آلية للإناث (من خلال التعبير العالي عن جين MISO) لتعزيز لياقتهن الإنجابية في المناطق ذات الانتشار العالي للملاريا، مما يساهم بشكل غير مباشر في انتقال طفيل البلازموديوم. وبالنظر إلى أن هرمون 20E الأنثوي قد ثبت أن له تأثيرات عميقة على بقاء ونمو طفيل المتصورة المنجلية في إناث بعوض الأنوفيلة،²⁴ أصبحت مسارات الهرمونات الستيرويدية لدى كل من الذكور والإناث الآن من الجوانب الرئيسية للتفاعلات بين البعوض والطفيليات.
تمت تربية سلالات البعوضة الأنوفيلية الغامبية G3 في ظروف قياسية للحشرات (26-28 درجة مئوية، رطوبة نسبية 65-80%، دورة ضوئية 12:12 ساعة ضوء/ظلام). غُذيت اليرقات بمسحوق طعام الأسماك (رقائق تترا مين الاستوائية، وحبيبات كوي، وأعواد تترا بوند بنسبة 7:7:2). غُذيت البعوضات البالغة بمحلول دكستروز 10% حسب الحاجة، بالإضافة إلى عينات دم بشري أسبوعيًا (مكونات دم الدراسة). تم الحصول على البعوضات العذراء بفصل الجنسين في مرحلة العذراء بعد فحص الأطراف بالمجهر. وقد وُصفت الذكور الحاملة لجين DsRed سابقًا.
أُجريت تجارب التزاوج القسري وفقًا للبروتوكولات الموصوفة سابقًا. أما بالنسبة للتزاوج الطبيعي، فقد تم الاحتفاظ بالإناث العذارى البالغة من العمر 4 أيام بنسبة 1:3 مع الذكور العذارى الناضجة جنسيًا لمدة ليلتين. بالنسبة للتجارب التي تم فيها حقن الذكور بـ dsEPP، تزامن وضع الإناث في أقفاص مشتركة مع اليومين 3-4 بعد الحقن، عندما تم تثبيط نشاط الفوسفاتاز إلى أقصى حد (الشكل 2ب من البيانات الموسعة).
تم تشريح أنسجة البعوض، أو بقايا الجثث (باقي الجسم)، أو الجسم كاملاً، ووضعها في ميثانول نقي بنسبة 100%، ثم تم تجنيسها باستخدام جهاز التجنيس (خرز زجاجي 2 مم، 2400 دورة في الدقيقة، 90 ثانية). وكانت كميات الأنسجة وأحجام الميثانول كما يلي: باقي الجسم، 50 ميكرولتر في 1000 ميكرولتر؛ الغدد التناسلية الذكرية، 50-100 ميكرولتر في 80 ميكرولتر؛ الجهاز التناسلي الأنثوي السفلي، 25-50 ميكرولتر في 80 ميكرولتر. خضع الراسب لعملية استخلاص ثانية بالميثانول بنفس الحجم. تم إزالة بقايا الخلايا بالطرد المركزي. جُمع الميثانول من عمليتي الاستخلاص وجُفف تحت تيار من النيتروجين، ثم أُعيد تعليقه في الأحجام التالية من محلول ميثانول 80% في الماء: باقي الجسم، 50 ميكرولتر؛ الغدد التناسلية الذكرية والجهاز التناسلي الأنثوي السفلي، 30 ميكرولتر.
تم تحليل العينات باستخدام مطياف الكتلة (ID-X، Thermo Fisher) الموصول بجهاز كروماتوغرافيا سائلة (Vanquish، Thermo Fisher). حُقن 5 ميكرولتر من العينة في عمود كروماتوغرافي (Inspire C8، Dikma) بحجم حبيبات 3 ميكرومتر وأبعاد 100 × 4.6 مم، مع الحفاظ على درجة حرارة 25 درجة مئوية. كانت الأطوار المتحركة المستخدمة في الكروماتوغرافيا السائلة هي A (ماء، 0.1% حمض الفورميك) وB (أسيتونيتريل، 0.1% حمض الفورميك). كان تدرج الكروماتوغرافيا السائلة كما يلي: 5% من B لمدة دقيقة واحدة، ثم زيادة تدريجية إلى 100% من B خلال 11 دقيقة. بعد 8 دقائق عند 100%، أُعيدت معايرة العمود عند 5% من B لمدة 4 دقائق. كان معدل التدفق 0.3 مل/دقيقة. يتم التأين في مصدر مطياف الكتلة بواسطة التأين بالرذاذ الكهربائي الساخن في الوضعين الموجب والسالب.
يقيس مطياف الكتلة البيانات في نطاق m/z من 350 إلى 680 بدقة 60,000 في وضع MS الكامل. تم الحصول على بيانات MS/MS على [M + H]+ (جميع الأهداف)، و[M - H2O + H]+ (جميع الأهداف)، و[M - H]- (الأهداف المفسفرة). استُخدمت بيانات MS/MS لتأكيد خصائص الإكديسون للأهداف التي لم يتوفر لها معيار. لتحديد الإكديستيرويدات غير المستهدفة، تم تحليل بيانات MS/MS لجميع قمم HPLC التي تزيد وفرتها النسبية عن 15%. تم تحديد الكمية باستخدام منحنيات قياسية مُنشأة من معايير نقية (20E، 3D20E) لحساب الكميات المطلقة أو تخفيفات عينة محددة واحدة (جميع الأهداف الأخرى) لحساب مكافئتها للكميات الموجودة في ذكر واحد. بالنسبة لـ 3D20E، تم إجراء التحديد الكمي باستخدام مجموع النواتج الإضافية التالية: [M + TFA]-، و[M + COOH]-، و[M + Na]+، و[M [Cl]-، [M + NO3]-. تم استخلاص البيانات وتحديد كميتها باستخدام برنامج Tracefinder (الإصدار 4.1). تم تحليل بيانات MS/MS باستخدام برنامج Xcalibur (الإصدار 4.4). تمت مقارنة أطياف MS للمركبات E و20E و3D20E بالمعايير الخاصة بها. تم تحليل المركب 3D20E22P عن طريق الاشتقاق باستخدام كاشف جيرارد. تم تحليل المركب 20E22P عن طريق نسبة m/z.
تم تنقية المركب 3D20E22P من MAG. أُجريت عملية التنقية على نطاق تحليلي باستخدام جهاز كروماتوغرافيا سائلة فائق الأداء (Acquity، Waters) مزود بكاشف رباعي الأقطاب قائم على الكتلة (QDa، Acquity، Waters) في ظل نفس ظروف الكروماتوغرافيا السائلة المستخدمة في تحليل HPLC-MS/MS. تم بدء عملية جمع الكسور عند الكشف عن نسبة الكتلة إلى الشحنة (m/z) الموافقة للمركب 3D20E22P عند نفس زمن الاحتفاظ المحدد مسبقًا. ثم تم التحقق من نقاء المركبات المستخلصة باستخدام HPLC-MS/MS كما هو موضح أعلاه.
تم استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي من 10-12 نسيجًا تناسليًا أو أجزاء أخرى من الجسم (بدون رأس) باستخدام كاشف TRI (Thermo Fisher) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. عولج الحمض النووي الريبوزي بإنزيم TURBO DNase (Thermo Fisher). تم تصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام إنزيم النسخ العكسي لفيروس لوكيميا الفئران مولوني (M-MLV RT؛ Thermo Fisher) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. نُشرت البادئات الخاصة بتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR؛ جدول البيانات الموسع 2) سابقًا²⁴ أو صُممت باستخدام Primer-BLAST²⁶، مع إعطاء الأفضلية للمنتجات التي يتراوح حجمها بين 70 و150 زوجًا قاعديًا والتي تغطي وصلات الإكسونات أو تفصل أزواج البادئات بين الإكسونات. خُففت عينات الحمض النووي التكميلي من ثلاث إلى أربع نسخ بيولوجية أربع مرات في الماء لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي. أُجريت عملية التحديد الكمي في تفاعلات متكررة بحجم 15 ميكرولتر تحتوي على 1× من مزيج PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher). تم استخدام بادئات (Fisher) و5 ميكرولتر من الحمض النووي المكمل المخفف. أُجريت التفاعلات على نظام QuantStudio 6 Pro للتفاعل المتسلسل للبوليميراز في الوقت الحقيقي (Thermo Fisher)، وجُمعت البيانات وحُللت باستخدام برنامج Design and Analysis (الإصدار 2.4.3). كما هو موضح في هذه الدراسة، تم توحيد الكميات النسبية بالنسبة لجين الريبوسوم RpL19 (AGAP004422)، الذي لم يتغير تعبيره بشكل ملحوظ مع التغذية بالدم 27 أو التزاوج 3.
تم فحص جودة الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام جهاز Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). تم تحضير مكتبات Illumina ذات النهايات المزدوجة وتشغيلها في معهد برود التابع لمعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وجامعة هارفارد. تمت محاذاة قراءات التسلسل مع جينوم البعوضة الأنوفيلية الغامبية (سلالة PEST، الإصدار 4.12) باستخدام برنامج HISAT2 (الإصدار 2.0.5) مع المعلمات الافتراضية. تم استبعاد القراءات ذات درجات جودة المحاذاة (MAPQ) الأقل من 30 باستخدام برنامج Samtools (الإصدار 1.3.1). تم حساب عدد القراءات المُحاذية للجينات باستخدام برنامج htseq-count (الإصدار 0.9.1) مع المعلمات الافتراضية. تم حساب عدد القراءات المُعَيَّر وتحليل التعبير الجيني التفاضلي باستخدام حزمة DESeq2 (الإصدار 1.28.1) في بيئة R (الإصدار 4.0.3).
تم تحديد الجينات المرشحة لتعديل الإكديسون من خلال البحث أولاً في جينوم البعوضة الأنوفيلية الغامبية باستخدام خوارزمية PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/)، باستخدام القيم الافتراضية للمعلمات مع تسلسلات البروتين الاستعلامية التالية: من دودة القز (رقم الوصول NP_001038956.1)، والذبابة المنزلية (رقم الوصول XP_005182020.1، XP_005175332.1، وXP_011294434.1)، وذبابة الميكروبليتس (رقم الوصول XP_008552646.1 وXP_008552645.1). كما تم تحديد جين EcK من دودة القز (رقم الوصول NP_001036900)، وذبابة الفاكهة. ذبابة الفاكهة (رقم الوصول NP_651202)، ونحل العسل (رقم الوصول XP_394838)، ونبات البازلاء (رقم الوصول XP_001947166)؛ وEPP من دودة القز (رقم الوصول XP_001947166) وNP_001177919.1 وNP_001243996.1) وEO من ذبابة الفاكهة (رقم الوصول NP_572986.1) (الخطوة 1). بعد ذلك، يتم ترشيح النتائج بناءً على التعبير العالي للـmRNA (>100 جزء/كيلوبايت إكسون لكل مليون قراءة مُرتبطة (FPKM) أو >85%) في الأنسجة التناسلية (LRT الأنثوية أو MAG) في غامبيا (الخطوة 2). لتحسين الدقة، اخترنا إنزيمات مرشحة تُعبر عنها أيضًا الأنسجة التناسلية لبعوضة الأنوفيلس ألبيمانوس، وهي نوع من الأنوفيلس لا يُصنّع أو ينقل الإيكديسون أثناء التزاوج. تم ترشيح الجينات المرشحة بناءً على انخفاض التعبير (<100 FPKM أو <النسبة المئوية 85) في الأنسجة التناسلية لبعوضة الأنوفيلس ألبيمانوس (الخطوة 3). كخطوة ترشيح نهائية (الخطوة 4)، يجب أن تستوفي الجينات المرشحة شرطًا واحدًا على الأقل مما يلي: (1) زيادة التعبير بشكل ملحوظ بعد التزاوج (P < 0.05) وفقًا لتحليل الجينات المُعبر عنها بشكل تفاضلي، و(2) في الأنسجة غير التناسلية (< 85% أو <100 FPKM).
قمنا بتعديل الطرق الموصوفة سابقًا 28،29،30 لتحقيق وضع علامات نظائرية على الكائن الحي بأكمله. باختصار، تم اختبار النوع البري من الخميرة Saccharomyces cerevisiae من النوع الثاني (YSC2، Sigma) في قاعدة نيتروجين الخميرة (BD Difco، DF0335) التي تحتوي على (وزن/حجم) 2% جلوكوز (G7528، Sigma)، 1.7% خالي من الأحماض الأمينية وكبريتات الأمونيوم. تم استخدام وسط زراعة) وكبريتات الأمونيوم 15N بنسبة 5% (NLM-713، >99%، مختبرات كامبريدج للنظائر) كمصدر وحيد للنيتروجين. تم استخلاص الخميرة بالطرد المركزي، وتم تغذية يرقات البعوض بحرية حتى مرحلة التعذر. تم إضافة مسحوق السمك (0.5 ملغ لكل 300 يرقة) لمنع نفوق اليرقات في الطور الرابع. بعد ذلك، تم استخدام الإناث فقط في تجارب التزاوج مع ذكور غير موسومة لتحليل البروتينات الذكرية المنقولة أثناء التزاوج.
أُجبرت إناث عذارى موسومة بالنظير 15N، تتراوح أعمارها بين 4 و6 أيام، على التزاوج مع ذكور عذارى غير موسومة من نفس العمر. تم التحقق من نجاح التزاوج عن طريق الكشف عن سدادات التزاوج باستخدام مجهر التألق الضوئي. عند 3 و12 و24 ساعة بعد التزاوج، تم تشريح أذينات 45-55 أنثى متزاوجة ووضعها في 50 ميكرولتر من محلول بيكربونات الأمونيوم (الأس الهيدروجيني 7.8) ثم تم تجنيسها باستخدام مدقة. تم طرد المتجانس مركزيًا، ثم خلط الراشح مع 50 ميكرولتر من محلول رابيجيست 0.1% (186001860، ووترز) في 50 ملي مولار من بيكربونات الأمونيوم. تم تجميد الراشح والراسب من كل عينة تجميدًا سريعًا باستخدام الثلج الجاف، ثم تم شحنها في نفس الليلة إلى مختبر ماكوس في جامعة واشنطن، حيث تم استكمال تحضير العينات لتحليل LC-MS/MS. أعد تعليق الراسب في 50 تم إضافة ميكرولتر من محلول رابيجيست بتركيز 0.1% في بيكربونات الأمونيوم بتركيز 50 ملي مولار، ثم تم تعريض العينات للموجات فوق الصوتية في حمام مائي. تم قياس تركيز البروتين في الراسب والمحلول الطافي باستخدام اختبار BCA. تم اختزال العينات باستخدام دايثيوثريتول (DTT؛ سيجما) بتركيز 5 ملي مولار، ثم ألكلتها باستخدام يودوأسيتاميد (سيجما) بتركيز 15 ملي مولار، وحُضنت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية (بنسبة 1:0:50) لمدة ساعة واحدة (مع نسبة التربسين: التربسين: الركيزة). تم تحليل رابيجيست بإضافة حمض الهيدروكلوريك بتركيز 200 ملي مولار، ثم حُضنت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، ثم تم طردها مركزيًا عند 14000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لإزالة الشوائب. تم غسل العينات باستخدام استخلاص الطور الصلب ثنائي الوضع (خراطيش Oasis MCX، ووترز) ثم إعادة تعليقها في حمض الفورميك بتركيز 0.1%. للحصول على تركيز بروتين نهائي قدره 0.33 ميكروغرام/ميكرولتر. تم تحليل بروتينات MAG غير الموسومة من ذكور عذارى بنفس الطريقة. تم تحليل عينتين متطابقتين لكل عينة. بعد ذلك، تم تحليل 1 ميكروغرام من كل عينة باستخدام عمود من السيليكا المنصهرة بطول 25 سم وقطر 75 ميكرومتر مع مصيدة سيليكا منصهرة Kasil1 (PQ) بطول 4 سم معبأة براتنج الطور العكسي Jupiter C12 (Phenomenex) وتقنية كروماتوغرافيا سائلة لمدة 180 دقيقة. تم إجراء تحليل MS/MS لعينات الهضم باستخدام مطياف الكتلة Q-Exactive HF (Thermo Fisher) مع نظام nanoACQUITY UPLC (Waters). حُوّلت بيانات الاستحواذ المتعلقة بكل عملية تشغيل إلى صيغة mzML باستخدام برنامج Proteowizard (الإصدار 3.0.20287) وبرنامج Comet31 (الإصدار 3.2) مقابل قاعدة بيانات FASTA التي تحتوي على تسلسلات بروتينية من بعوضة الأنوفيلة الغامبية (VectorBase الإصدار 54)، وبعوضة الأنوفيلة الكولوزية. أُجري بحث في قاعدة بيانات Mali-NIH (VectorBase الإصدار 54)، وخميرة Saccharomyces cerevisiae (Uniprot، مارس 2021)، وتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) لبعوضة الأنوفيلة الغامبية، وترجمات الإطار الثلاثي لملوثات بشرية معروفة. حُددت معدلات الاكتشاف الخاطئ (FDR) المطابقة لخريطة الببتيد باستخدام برنامج Percolator32 (الإصدار 3.05) بعتبة 0.01، وجُمعت الببتيدات لتكوين تعريفات بروتينية. باستخدام مبدأ اقتصاد البروتين في برنامج Limelight33 (الإصدار 2.2.0)، تم تقدير وفرة البروتين النسبية باستخدام عامل الوفرة الطيفية المعياري (NSAF) المحسوب لكل بروتين في كل تشغيل كما هو موضح سابقًا. تم حساب متوسط ​​NSAF لكل بروتين عبر عينات من نسختين بيولوجيتين مختلفتين. نجح وسم 15N في إخفاء بروتينات الإناث، على الرغم من إمكانية الكشف عن كمية صغيرة من البروتين غير الموسوم من الإناث العذارى الموسومة. سجلنا الكشف عن انخفاض بروتين الذكور (1-5 أطياف) في عينات الإناث الخام فقط في التشغيلات التقنية، حيث تم تشغيل العينات الخام بعد عينات الذكور/التزاوج، نتيجة لـ "التأثير المتبقي" في HPLC. ترد البروتينات العرضية التي تم العثور عليها كـ "ملوثات" من الإناث العذارى الموسومة في الجدول التكميلي 1.
تم استخدام ببتيدين مستضديين، هما QTTDRVAPAPDQQQ (ضمن النمط المصلي PA) وMESDGTTPSGDSEQ (ضمن النمط المصلي PA وPB) في جينسكريبت. جُمع الببتيدان، ثم رُبطا بالبروتين الحامل KLH وحُقنا في أرانب نيوزيلندية. تم تضحية الأرانب بعد الحقنة الرابعة، وعُزل الغلوبولين المناعي IgG الكلي بواسطة تنقية التقارب. استُخدم الغلوبولين المناعي IgG من الأرنب الأكثر تخصصًا بـ EPP في تحليل ويسترن بلوت.
في تجارب التلطيخ الغربي، أُضيف كل من بروتين MAG (عدد العينات = 10، حيث يمثل n عدد عينات البعوض المستقلة بيولوجيًا) وبروتين LRT الأنثوي (عدد العينات = 30) من ذكور عذارى عمرها 4 أيام وإناث عذارى أو مُجبرة على التزاوج (أقل من 10 بعد التزاوج) بشكل منفصل. تم تجنيس العينات مباشرة بعد التشريح باستخدام جهاز التجنيس (خرز زجاجي 2 مم، 2400 دورة في الدقيقة، 90 ثانية). أُزيلت البقايا غير الذائبة بالطرد المركزي عند 20000 جم عند 4 درجات مئوية. تم تقدير كمية البروتينات باستخدام اختبار برادفورد (بيو-راد). بعد ذلك، أُضيف 20 ميكروغرام من بروتين MAG، و40 ميكروغرام من تمت معالجة بروتين LRT و20 ميكروغرام من البروتين المتبقي بفصل البروتينات باستخدام تقنية NuPAGE بنسبة 10% مع محلول منظم MOPS. نُقلت البروتينات إلى أغشية فلوريد البولي فينيليدين باستخدام نظام النقل iBlot2 (Thermo Fisher). غُسلت الأغشية مرتين بمحلول PBS-T بتركيز 1× (0.1% توين-20 في محلول PBS)، ثم حُجبت باستخدام محلول حجب Odyssey (Li-Cor) لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 22 درجة مئوية. رُجّت الأغشية طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية متعددة النسائل المُخصصة من الأرانب ضد EPP (1:700 في محلول الحجب) والأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة MAC237 (Abeam؛ 1:4000) المُخصصة من الفئران ضد الأكتين. غُسلت الأغشية بمحلول PBS-T، ثم حُضنت مع الأجسام المضادة الثانوية (800CW من الحمير ضد الأرانب و800CW من الماعز ضد الفئران) تمت معالجة أغشية 680LT (Li-Cor، كلاهما بنسبة 1:20000) في محلول حجب يحتوي على 0.01% من كبريتات دوديسيل الصوديوم و0.2% من توين-20 لمدة ساعة واحدة عند 22 درجة مئوية. غُسلت الأغشية بمحلول فوسفات الصوديوم المخفف (PBS-T) وصُوّرت باستخدام ماسح ضوئي Odyssey CLx. جُمعت الصور وعُولجت في برنامج Image Studio (الإصدار 5.2). لم يُرصد وجود حزمة محددة تتوافق مع نظير EPP-RA (82 كيلو دالتون).
تم استنساخ المناطق المشفرة لـ EPP (كشكل متماثل AGAP002463-RB يحتوي على مجال فوسفاتاز الهيستيدين، بحث المجال المحفوظ NCBI 34) و EcK2 (AGAP002181) في بلازميد pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma)؛ تم إدراج البادئات في جدول البيانات الموسعة رقم 2. أُدخلت ثمانية روابط GS4 (متتالية) قبل علامة 6xHis الطرفية C لبنية pET-21a(+)-EcK2. أُنتجت البروتينات المؤتلفة باستخدام تفاعل تخليق البروتين الخالي من الخلايا NEBExpress من الإشريكية القولونية (New England BioLabs). نُقّيت البروتينات المؤتلفة باستخدام أعمدة الطرد المركزي NEBExpress Ni (New England BioLabs). أُنتج بروتين التحكم لإنزيم ثنائي هيدروفولات ريدوكتاز (DHFR) باستخدام قالب DNA من مجموعة تخليق البروتين الخالي من الخلايا NEBExpress من الإشريكية القولونية. حُفظت البروتينات في 50% جلسرين في محلول ملحي فوسفاتي عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
تم قياس نشاط الفوسفاتاز لإنزيم EPP ومستخلصات الأنسجة باستخدام فوسفات 4-نيتروفينيل (pNPP؛ من شركة سيجما-ألدريتش). احتوى محلول التفاعل على 25 ملي مولار من التريس، و50 ملي مولار من حمض الخليك، و25 ملي مولار من بيس-تريس، و150 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، و0.1 ملي مولار من EDTA، و1 ملي مولار من DTT. تم تجنيس الأنسجة في محلول التفاعل، وأُزيلت بقايا الخلايا بالطرد المركزي. بدأ التفاعل بإضافة الإنزيم أو مستخلص الأنسجة إلى محلول التفاعل الذي يحتوي على 2.5 ملجم/مل من pNPP. حُضن مزيج التفاعل في درجة حرارة الغرفة في الظلام، وتم تحديد كمية pNP المتحولة من pNPP بقياس الامتصاص عند 405 نانومتر في أوقات مختلفة.
لتقييم نشاط EcK في المختبر، تم تحضين البروتين مع 0.2 ملغ من 20E أو 3D20E في 200 ميكرولتر من محلول منظم (الأس الهيدروجيني 7.5) يحتوي على 10 ملي مولار من HEPES-NaOH، و0.1% من BSA، و2 ملي مولار من ATP، و10 ملي مولار من MgCl2 لمدة ساعتين عند 27 درجة مئوية. أُوقف التفاعل بإضافة 800 ميكرولتر من الميثانول، ثم بُرِّد عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة، ثم خُضِعَ للطرد المركزي عند 20000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك، حُلِّلَ الراشح باستخدام HPLC-MS/MS. لتعطيل البروتينات المستخدمة في مجموعة التحكم بالحرارة، حُضِّنَت البروتينات في 50% من الجلسرين في محلول ملحي فوسفاتي لمدة 20 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
لتقييم نشاط EPP في المختبر، تم تحضين البروتين مع 3D20E22P (ما يعادل الكمية الموجودة في 18 زوجًا من MAG، تم تنقيته بواسطة HPLC-MS/MS) في 100 ميكرولتر من محلول منظم (pH 7.5) يحتوي على 25 ملي مولار من Tris، و50 ملي مولار من حمض الخليك، و25 ملي مولار من Bis-Tris، و150 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، و0.1 ملي مولار من EDTA، و1 ملي مولار من DTT لمدة 3 ساعات عند 27 درجة مئوية. تم إيقاف التفاعل بإضافة 400 ميكرولتر من الميثانول وتبريده عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، ثم طرده مركزيًا عند 20000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم تحليل الراشح بواسطة HPLC-MS/MS.
تم تضخيم أجزاء PCR لـ EPP (362 bp) و EcK1 (AGAP004574، 365 bp) و EcK2 (556 bp) من cDNA المحضر من جثث البعوض منزوعة الرأس من الجنسين. تم تضخيم جزء PCR الخاص بعنصر التحكم eGFP (495 bp) من pCR2.1-eGFP الموصوف سابقًا؛ تم إدراج بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في جدول البيانات الإضافية 2. أُدخلت قطعة PCR بين محفزات T7 المعكوسة على بلازميد pL4440. استُخلصت تركيبات البلازميد من بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 5-α المؤهلة (شركة نيو إنجلاند بيولابس) وجرى التحقق منها بواسطة تسلسل الحمض النووي قبل الاستخدام (انظر البيانات التكميلية 1 لتسلسل الإدخال). استُخدمت البادئات المطابقة لمحفز T7 (جدول البيانات الإضافية 2) لتضخيم الإدخال من البلازميد القائم على pL4440. تم تأكيد حجم ناتج PCR بواسطة الترحيل الكهربائي على هلام الأغاروز. نُسخ الحمض النووي الريبوزي المزدوج السلسلة (dsRNA) من قوالب PCR باستخدام مجموعة Megascript T7 Transcription Kit (شركة Thermo Fisher) ونُقي وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة مع التعديلات الموضحة سابقًا.
لحقن الحمض النووي الريبوزي المزدوج السلسلة (dsRNA)، تم حقن 1380 نانوغرام من dsRNA (dsGFP، dsEcK1، dsEcK2، dsEPP) بتركيز 10 نانوغرام/نانولتر في صدر ذكور أو إناث بالغة (Nanoject III، Drummond) خلال يوم واحد من الفقس. تم تحديد مستويات تثبيط الجينات في ثلاث عينات بيولوجية على الأقل عن طريق استخلاص الحمض النووي الريبوزي، وتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA)، والتفاعل التسلسلي الكمي للبوليميراز العكسي (RT-qPCR). لحقن الإيكديسون، تم حقن إناث عذراء عمرها 4 أيام أو إناث عذراء عمرها 6 أيام تغذت على الدم بـ 0.13، أو 0.21، أو 0.63 ميكروغرام من 20E أو 3D20E (Nanoject III، Drummond) بتراكيز 1.3، أو 2.1 على التوالي، حسب تصميم التجربة، أو 6.3 نانوغرام/نانولتر. 100 نانولتر من محلول إيثانول بنسبة 10% (حجم/حجم) في الماء؛ 100 نانولتر من 3D20E22P في محلول إيثانول بنسبة 10% (ما يعادل 75% من الكمية الموجودة في زوج من MAGs). تم توزيع البعوض عشوائياً على مجموعة الحقن.
في تجارب التكاثر، تم تغذية إناث البعوض البالغة من العمر ثلاثة أيام بكميات غير محدودة من دم الإنسان. تم إزالة البعوض الذي لم يتغذَّ بشكل كامل أو لم يتغذَّ على الإطلاق. وبحسب نوع المعالجة، وُضعت الإناث في أكواب تكاثر منفصلة لمدة أربع ليالٍ على الأقل بعد 48 ساعة من تناول وجبة الدم. تم عدّ البيض باستخدام مجهر ستيريو (Stemi 508، Zeiss)؛ وبالنسبة للإناث الملقحة، اعتُبر البيض الذي فقس إلى يرقات بيضًا مخصبًا.
في تجارب التزاوج، مُنحت الإناث يومين على الأقل، حسب نوع المعالجة، لتطوير مقاومة للتزاوج، ثم أُدخل ذكور من نفس العمر من النوع البري إلى القفص نفسه. بعد ليلتين، فُصلت الحويصلات المخصبة للإناث، واستُخلص الحمض النووي الجينومي بالتجميد والذوبان والمعالجة بالموجات فوق الصوتية في محلول منظم يحتوي على 10 ملي مولار من Tris-HCl، و1 ملي مولار من EDTA، و25 ملي مولار من NaCl (الأس الهيدروجيني 8.2). حُضنت العينات مع بروتينيز K (0.86 ميكروغرام/ميكرولتر) لمدة 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية، ثم لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية. خُففت مستحضرات الحمض النووي الجينومي الخام عشرة أضعاف، وخضعت للكشف الكمي عن تسلسل الكروموسوم Y بتقنية qPCR؛ وتُدرج البادئات في جدول البيانات الإضافية 2. يشير غياب تسلسل الكروموسوم Y إلى عدم حدوث تزاوج.
في تجارب إعادة التزاوج، تم فحص الإناث التي أُجبرت على التزاوج للتأكد من وجود سدادات التزاوج، ثم تُركت لمدة يومين لتطوير مقاومة للتزاوج في غياب الذكور، كما وُصف سابقًا³⁶. بعد ذلك، تم إدخال ذكور تحمل حيوانات منوية معدلة وراثيًا تحمل جين DsRed إلى أقفاص الإناث. بعد ليلتين، تم تشريح الحويصلات المخصبة من الإناث، وتم تحضير الحمض النووي الجينومي كما هو موضح أعلاه، وخضع للكشف عن جين DsRed المعدل وراثيًا بتقنية qPCR؛ وتُدرج البادئات في جدول البيانات الإضافية 2. يشير غياب جين DsRed المعدل وراثيًا إلى عدم حدوث إعادة تزاوج.
تم تصنيع المركب 3D20E وفقًا للطريقة الموصوفة سابقًا³⁷. باختصار، تم إذابة 10 ملغ من المركب 20E (من شركة سيغما-ألدريتش) في 10 مل من الماء، ثم أُضيف 30 ملغ من مسحوق البلاتين الأسود (من شركة سيغما-ألدريتش). تم تمرير تيار خفيف من الأكسجين بشكل مستمر في مزيج التفاعل مع التحريك عند درجة حرارة الغرفة. بعد 6 ساعات، أُضيف 30 مل من الميثانول لإيقاف التفاعل. تم طرد المزيج مركزيًا لإزالة جزيئات المحفز. تم تبخير السائل الطافي حتى الجفاف تحت فراغ عند درجة حرارة الغرفة. تم إذابة ناتج التفاعل المجفف في محلول من الإيثانول والميثانول بنسبة 10% لحقنه في تحليل HPLC-MS/MS. بلغت نسبة التحويل (من 20E إلى 3D20E) حوالي 97% (الشكل 4ب)، وتطابق طيف الكتلة للمركب 3D20E المُصنّع مع الطيف الموجود في الإناث الملقحة. (الشكل 4ج).
يتضمن مفتاح الرسم البياني تفاصيل محددة للاختبارات الإحصائية التي أُجريت. استُخدم برنامج GraphPad (الإصدار 9.0) لإجراء اختبار فيشر الدقيق، واختبار مانتل-كوكس، واختبار t للطالب. أُجريت اختبارات كوكران-مانتل-هينزل باستخدام برنامج R نصي مُخصص (متوفر على الرابط https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). تم اختبار توزيع البيانات للتأكد من طبيعيته باستخدام اختبار شابيرو-ويلك عند مستوى دلالة 0.05. في حال عدم اجتياز البيانات لاختبار التوزيع الطبيعي، تم إجراء اختبار مان-ويتني. تم تحليل بيانات البقاء باستخدام اختبار مانتل-كوكس. استُخدمت حزمة DESeq2 (الإصدار 1.28.1) لإجراء تحليل التعبير التفاضلي على مستوى الجينات في تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq). يُمثل الشريط الأفقي على الرسم البياني الوسيط. تم استخدام قيمة دلالة P = 0.05 كعتبة لجميع الاختبارات.
للحصول على مزيد من المعلومات حول تصميم الدراسة، راجع ملخص تقرير أبحاث الطبيعة المرتبط بهذه المقالة.
تم إيداع بيانات البروتينات MS في اتحاد ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) من خلال مستودع PRIDE Partner (https://www.ebi.ac.uk/pride/) مع معرف مجموعة البيانات PXD032157.
تم إيداع مجموعة بيانات RNA-seq في مكتبة التعبير الجيني الشاملة (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) تحت السجل التسلسلي GSE198665.
يمكن الحصول على مجموعات البيانات الإضافية التي تم إنشاؤها و/أو تحليلها خلال هذه الدراسة من المؤلفين المعنيين عند تقديم طلب معقول. وتوفر هذه المقالة البيانات المصدرية.
دي لوف، أ. الإكديستيرويدات: هرمونات جنسية مهملة في الحشرات؟ الذكر: الصندوق الأسود. علم الحشرات. 13، 325-338 (2006).
Redfern، CPF 20-hydroxyecdysone وتطور المبيض في Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28، 97-109 (1982).