أظهرت الدراسات أن حمض البروبيونيك (PPA)، وهو عامل مضاد للفطريات ومضاف غذائي شائع، يُسبب اضطرابات في النمو العصبي لدى الفئران، مصحوبة بخلل في الجهاز الهضمي، والذي قد يكون ناتجًا عن اختلال التوازن الميكروبي في الأمعاء. وقد أشارت بعض الدراسات إلى وجود صلة بين التعرض الغذائي لحمض البروبيونيك واختلال التوازن الميكروبي في الأمعاء، إلا أن هذه الصلة لم تُدرس بشكل مباشر. في هذه الدراسة، بحثنا التغيرات المرتبطة بحمض البروبيونيك في تكوين الميكروبات المعوية والتي قد تؤدي إلى اختلال التوازن الميكروبي. تم تسلسل الميكروبيوم المعوي لفئران تغذت على نظام غذائي غير معالج (ن=9) ونظام غذائي غني بحمض البروبيونيك (ن=13) باستخدام تقنية التسلسل الميتاجينومي طويل المدى لتقييم الاختلافات في التركيب الميكروبي ومسارات التمثيل الغذائي البكتيري. ارتبط تناول حمض البروبيونيك الغذائي بزيادة في وفرة أنواع مهمة، بما في ذلك العديد من أنواع البكتيريا من أجناس Bacteroides وPrevotella وRuminococcus، والتي سبق أن ثبت تورطها في إنتاج حمض البروبيونيك. أظهرت الميكروبيومات لدى الفئران المعرضة لمادة PPA زيادة في المسارات الأيضية المرتبطة باستقلاب الدهون وتخليق الهرمونات الستيرويدية. تشير نتائجنا إلى أن مادة PPA قادرة على تغيير الميكروبات المعوية ومساراتها الأيضية. تُبرز هذه التغيرات الملحوظة أن المواد الحافظة المصنفة على أنها آمنة للاستهلاك قد تؤثر على تكوين الميكروبات المعوية، وبالتالي على صحة الإنسان.
يُشار غالبًا إلى الميكروبيوم البشري باسم "العضو الأخير في الجسم"، ويلعب دورًا حيويًا في صحة الإنسان (باكيرو ونومبيلا، 2012). ويُعرف ميكروبيوم الأمعاء تحديدًا بتأثيره الشامل على الجسم ودوره في العديد من الوظائف الأساسية. وتنتشر البكتيريا المتعايشة بكثرة في الأمعاء، حيث تشغل بيئات بيئية متعددة، وتستهلك العناصر الغذائية، وتتنافس مع مسببات الأمراض المحتملة (جانديالا وآخرون، 2015). وتستطيع مكونات بكتيرية متنوعة من ميكروبات الأمعاء إنتاج عناصر غذائية أساسية مثل الفيتامينات، وتعزيز عملية الهضم (رولاند وآخرون، 2018). كما ثبت أن نواتج أيض البكتيريا تؤثر على نمو الأنسجة، وتعزز مسارات التمثيل الغذائي والمناعة (هيجتز وآخرون، 2011؛ ​​يو وآخرون، 2022). ويتسم تركيب ميكروبيوم الأمعاء البشري بتنوع كبير، ويعتمد على عوامل وراثية وبيئية، مثل النظام الغذائي، والجنس، والأدوية، والحالة الصحية (كومبهاري وآخرون، 2019).
يُعدّ النظام الغذائي للأم عنصرًا أساسيًا في نمو الجنين والرضيع، ومصدرًا محتملاً للمركبات التي قد تؤثر على هذا النمو (بازر وآخرون، 2004؛ إينيس، 2014). ومن هذه المركبات حمض البروبيونيك (PPA)، وهو حمض دهني قصير السلسلة يُستخلص من التخمر البكتيري ويُستخدم كمضاف غذائي (دين بيستن وآخرون، 2013). يتميز حمض البروبيونيك بخصائص مضادة للبكتيريا والفطريات، ولذلك يُستخدم كمادة حافظة للأغذية وفي التطبيقات الصناعية لتثبيط نمو العفن والبكتيريا (ويمنهوف وآخرون، 2016). يُحدث حمض البروبيونيك تأثيرات مختلفة في الأنسجة المختلفة. ففي الكبد، يُظهر تأثيرات مضادة للالتهابات من خلال التأثير على التعبير عن السيتوكينات في البلاعم (كاواسوي وآخرون، 2022). وقد لوحظ هذا التأثير التنظيمي أيضًا في خلايا مناعية أخرى، مما يؤدي إلى تثبيط الالتهاب (هاس وآخرون، 2021). مع ذلك، لوحظ تأثير معاكس في الدماغ. أظهرت دراسات سابقة أن التعرض لمركب PPA يحفز سلوكًا شبيهًا بالتوحد لدى الفئران (الأنصاري وآخرون، 2012). كما أظهرت دراسات أخرى أن PPA قد يحفز التليف الدبقي وينشط مسارات الالتهاب في الدماغ (عبدلي وآخرون، 2019). ولأن PPA حمض ضعيف، فإنه قادر على الانتشار عبر ظهارة الأمعاء إلى مجرى الدم، وبالتالي عبور الحواجز، بما في ذلك الحاجز الدموي الدماغي والمشيمة (ستينسون وآخرون، 2019)، مما يسلط الضوء على أهمية PPA كمستقلب منظم تنتجه البكتيريا. ورغم أن الدور المحتمل لـ PPA كعامل خطر للإصابة بالتوحد لا يزال قيد البحث، إلا أن تأثيراته على الأفراد المصابين بالتوحد قد تتجاوز تحفيز التمايز العصبي.
تُعدّ أعراض الجهاز الهضمي، كالإسهال والإمساك، شائعة لدى مرضى اضطرابات النمو العصبي (كاو وآخرون، 2021). وقد أظهرت دراسات سابقة اختلاف الميكروبيوم لدى مرضى اضطراب طيف التوحد عن الميكروبيوم لدى الأفراد الأصحاء، مما يُشير إلى وجود خلل في التوازن الميكروبي للأمعاء (فاينغولد وآخرون، 2010). وبالمثل، تختلف خصائص الميكروبيوم لدى مرضى أمراض الأمعاء الالتهابية، والسمنة، ومرض الزهايمر، وغيرها، عن خصائص الميكروبيوم لدى الأفراد الأصحاء (ترنباو وآخرون، 2009؛ فوغت وآخرون، 2017؛ هينكه وآخرون، 2019). ومع ذلك، لم يتم حتى الآن إثبات وجود علاقة سببية بين الميكروبيوم المعوي والأمراض أو الأعراض العصبية (ياب وآخرون، 2021)، على الرغم من الاعتقاد بأن العديد من أنواع البكتيريا تلعب دورًا في بعض هذه الحالات المرضية. ●️ ... وبالتالي، فإن البيئة الغنية بـ PFA قد تؤدي إلى تغييرات في الميكروبات المعوية، بما في ذلك مسببات الأمراض المعوية، والتي قد تكون عوامل محتملة تؤدي إلى أعراض الجهاز الهضمي.
يُعدّ أحد الأسئلة المحورية في أبحاث الميكروبيوم هو ما إذا كانت الاختلافات في التركيب الميكروبي سببًا أم عرضًا لأمراض كامنة. وتتمثل الخطوة الأولى نحو توضيح العلاقة المعقدة بين النظام الغذائي، والميكروبيوم المعوي، والأمراض العصبية في تقييم تأثير النظام الغذائي على التركيب الميكروبي. ولتحقيق هذه الغاية، استخدمنا تقنية التسلسل الميتاجينومي طويل القراءة لمقارنة الميكروبيوم المعوي لدى صغار الفئران التي تغذت على نظام غذائي غني بـ PPA أو نظام غذائي فقير به. وقد تغذت الصغار على نفس النظام الغذائي الذي تغذت عليه أمهاتها. افترضنا أن النظام الغذائي الغني بـ PPA سيؤدي إلى تغييرات في التركيب الميكروبي المعوي والمسارات الوظيفية الميكروبية، ولا سيما تلك المتعلقة باستقلاب PPA و/أو إنتاجه.
استخدمت هذه الدراسة فئرانًا معدلة وراثيًا من سلالة FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (مختبرات جاكسون) تُفرط في التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت سيطرة مُحفِّز GFAP الخاص بالخلايا الدبقية، وذلك وفقًا لإرشادات لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة سنترال فلوريدا (UCF-IACUC) (رقم تصريح استخدام الحيوانات: PROTO202000002). بعد الفطام، وُضعت الفئران بشكل فردي في أقفاص، بواقع 1-5 فئران من كل جنس في كل قفص. تم تغذية الفئران حسب الحاجة إما بنظام غذائي نقي (نظام غذائي قياسي مُعدّل مفتوح التسمية، 16 كيلو كالوري/10% دهون) أو بنظام غذائي مُدعّم ببروبيونات الصوديوم (نظام غذائي قياسي مُعدّل مفتوح التسمية، 16 كيلو كالوري/10% دهون، يحتوي على 5000 جزء في المليون من بروبيونات الصوديوم). كانت كمية بروبيونات الصوديوم المستخدمة مُكافئة لـ 5000 ملغ من PFA/كغ من إجمالي وزن الطعام. هذا هو أعلى تركيز لمادة PPA معتمد للاستخدام كمادة حافظة للأغذية. وللتحضير لهذه الدراسة، تم تغذية الفئران الأم بنظامين غذائيين لمدة 4 أسابيع قبل التزاوج، واستمر ذلك طوال فترة حمل الأم. تم فطام الفئران الصغيرة [22 فأراً، 9 منها ضابطة (6 ذكور، 3 إناث) و13 من مجموعة PPA (4 ذكور، 9 إناث)]، ثم استمرت في التغذية على نفس النظام الغذائي للأمهات لمدة 5 أشهر. تم تضحية الفئران الصغيرة عند بلوغها 5 أشهر من العمر، وجُمعت محتويات أمعائها وحُفظت مبدئياً في أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 مل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، ثم نُقلت إلى مجمد عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى استُنفد الحمض النووي للمضيف واستُخلصت الأحماض النووية الميكروبية.
تم استخلاص الحمض النووي للمضيف وفقًا لبروتوكول مُعدَّل (Charalampous et al., 2019). باختصار، نُقلت محتويات البراز إلى 500 ميكرولتر من محلول InhibitEX (Qiagen، رقم المنتج: 19593) وحُفظت مُجمدة. يُعالج ما لا يزيد عن 1-2 من كريات البراز لكل عملية استخلاص. ثم جُنِّست محتويات البراز ميكانيكيًا باستخدام مدقة بلاستيكية داخل الأنبوب لتكوين معلق. تُطرد العينات مركزيًا عند 10000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق أو حتى تترسب العينات، ثم يُشفط السائل الطافي ويُعاد تعليق الراسب في 250 ميكرولتر من محلول الفوسفات الملحي (PBS) بتركيز 1×. يُضاف 250 ميكرولتر من محلول الصابونين بتركيز 4.4% (TCI، رقم المنتج S0019) إلى العينة كمنظف لتفكيك أغشية الخلايا حقيقية النواة. تُخلط العينات برفق حتى تصبح ناعمة وتُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، لتفكيك الخلايا حقيقية النواة، أُضيف 350 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز إلى العينة، وحُضنت لمدة 30 ثانية، ثم أُضيف 12 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم بتركيز 5 مولار. بعد ذلك، خُضعت العينات للطرد المركزي بسرعة 6000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. سُحب السائل الطافي وأُعيد تعليق الراسب في 100 ميكرولتر من محلول الفوسفات الملحي المخفف (PBS) بتركيز 1X. لإزالة الحمض النووي للمضيف، أُضيف 100 ميكرولتر من محلول HL-SAN (12.8568 غرام من كلوريد الصوديوم، 4 مل من كلوريد المغنيسيوم بتركيز 1 مولار، 36 مل من الماء الخالي من النيوكلياز) و10 ميكرولتر من إنزيم HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). خُلطت العينات جيدًا باستخدام الماصة، ثم حُضنت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بسرعة 800 دورة في الدقيقة على جهاز Eppendorf™ ThermoMixer C. بعد التحضين، خُضعت العينات للطرد المركزي بسرعة 6000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق، ثم غُسلت مرتين باستخدام 800 ميكرولتر و1000 ميكرولتر من محلول الفوسفات الملحي (PBS) بتركيز 1X. أخيرًا، أُعيد تعليق الراسب في 100 ميكرولتر من محلول الفوسفات الملحي (PBS) بتركيز 1X.
تم استخلاص الحمض النووي البكتيري الكلي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومي مونارك من نيو إنجلاند بيولابس (نيو إنجلاند بيولابس، إيبسويتش، ماساتشوستس، رقم المنتج T3010L). تم تعديل إجراء التشغيل القياسي المرفق مع المجموعة تعديلًا طفيفًا. قبل البدء بعملية الاستخلاص النهائي، حضّن الماء الخالي من النيوكلياز عند درجة حرارة 60 درجة مئوية مع الحفاظ عليه كذلك. أضف 10 ميكرولتر من بروتينيز K و3 ميكرولتر من RNase A إلى كل عينة. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول تحلل الخلايا واخلط برفق. بعد ذلك، حُضنت العينات في جهاز إيبندورف ثيرموميكسر C عند درجة حرارة 56 درجة مئوية وسرعة 1400 دورة في الدقيقة لمدة ساعة على الأقل وحتى 3 ساعات. خُضعت العينات المحضونة للطرد المركزي عند قوة طرد مركزي نسبية 12000 لمدة 3 دقائق، ونُقل الراسب من كل عينة إلى أنبوب طرد مركزي صغير منفصل سعة 1.5 مل يحتوي على 400 ميكرولتر من محلول الربط. تم خلط الأنابيب باستخدام جهاز الخلط الدوامي النبضي لمدة 5-10 ثوانٍ بفواصل زمنية قدرها ثانية واحدة. نُقل كامل محتوى السائل من كل عينة (حوالي 600-700 ميكرولتر) إلى خرطوشة ترشيح موضوعة في أنبوب تجميع ذي تدفق مستمر. وُضعت الأنابيب في جهاز الطرد المركزي بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق للسماح بالارتباط الأولي للحمض النووي، ثم وُضعت في جهاز الطرد المركزي بسرعة 12000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة لإزالة السائل المتبقي. نُقل عمود العينة إلى أنبوب تجميع جديد، ثم غُسل مرتين. في الغسلة الأولى، أُضيف 500 ميكرولتر من محلول الغسل إلى كل أنبوب. يُقلب الأنبوب 3-5 مرات، ثم يُوضع في جهاز الطرد المركزي بسرعة 12000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. يُتخلص من السائل الموجود في أنبوب التجميع، وتُعاد خرطوشة الترشيح إلى أنبوب التجميع نفسه. في الغسلة الثانية، أُضيف 500 ميكرولتر من محلول الغسل إلى المرشح دون قلبه. خُضعت العينات للطرد المركزي بسرعة 12000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. نُقلت المرشحات إلى أنبوب LoBind® سعة 1.5 مل، وأُضيف إليها 100 ميكرولتر من الماء الدافئ الخالي من النيوكلياز. حُضنت المرشحات في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة، ثم خُضعت للطرد المركزي بسرعة 12000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. حُفظ الحمض النووي المستخلص عند درجة حرارة -80 درجة مئوية.
تم قياس تركيز الحمض النووي باستخدام جهاز قياس التألق Qubit™ 4.0. وتم تحضير الحمض النووي باستخدام مجموعة Qubit™ 1X dsDNA عالية الحساسية (رقم المنتج Q33231) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. وقيس توزيع أطوال قطع الحمض النووي باستخدام جهاز Agilent™ 4150 أو 4200 TapeStation. كما تم تحضير الحمض النووي باستخدام كواشف Agilent™ Genomic DNA (رقم المنتج 5067-5366) وشريط فحص الحمض النووي الجينومي (رقم المنتج 5067-5365). وتم تحضير المكتبة باستخدام مجموعة Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. وتم تسلسل الحمض النووي باستخدام جهاز التسلسل ONT GridION™ Mk1 مع خلية تدفق Min106D (R 9.4.1). كانت إعدادات التسلسل كالتالي: دقة عالية في تحديد القواعد، وقيمة q دنيا تبلغ 9، وإعداد الباركود، وتقليم الباركود. تم تسلسل العينات لمدة 72 ساعة، وبعد ذلك تم إرسال بيانات تحديد القواعد لمزيد من المعالجة والتحليل.
أُجريت معالجة المعلوماتية الحيوية باستخدام طرق موصوفة سابقًا (Greenman et al., 2024). قُسّمت ملفات FASTQ المُستخرجة من التسلسل إلى مجلدات لكل عينة. قبل تحليل المعلوماتية الحيوية، عُولجت البيانات وفقًا للخطوات التالية: أولًا، دُمجت ملفات FASTQ الخاصة بالعينات في ملف FASTQ واحد. ثم، رُشّحت القراءات الأقصر من 1000 زوج قاعدي باستخدام برنامج Filtlong الإصدار 0.2.1، مع تغيير المعامل الوحيد وهو –min_length 1000 (Wick, 2024). قبل إجراء المزيد من الترشيح، جرى التحقق من جودة القراءات باستخدام برنامج NanoPlot الإصدار 1.41.3 بالمعاملات التالية: –fastq –plots dot –N50 -o(دي كوستر ورادماكرز، 2023). تمت محاذاة القراءات مع جينوم الفأر المرجعي GRCm39 (GCF_000001635.27) باستخدام minimap2 الإصدار 2.24-r1122 لإزالة القراءات الملوثة بالمضيف، وذلك باستخدام المعلمات التالية: -L -ax map-ont(لي، 2018). حُوِّلت ملفات المحاذاة المُولَّدة إلى صيغة BAM باستخدام الأمر samtools view -b (دانيك وآخرون، 2021) في برنامج samtools الإصدار 1.16.1. ثم حُدِّدت القراءات غير المُحاذية باستخدام الأمر samtools view -b -f 4، مما يشير إلى أن هذه القراءات لا تنتمي إلى جينوم المضيف. حُوِّلت القراءات غير المُحاذية مرة أخرى إلى صيغة FASTQ باستخدام الأمر samtools bam2fq بالمعلمات الافتراضية. أُعيد تشغيل برنامج NanoPlot على القراءات المُفلترة باستخدام الإعدادات المذكورة سابقًا. بعد الفلترة، جُمِعت بيانات الميتاجينوم باستخدام برنامج metaflye الإصدار 2.8.2-b1689 بالمعلمات التالية: –nano-raw–meta (كولموغوروف وآخرون، 2020). اترك باقي المعلمات على قيمها الافتراضية. بعد التجميع، رُسمت قراءات التسلسل المُفلترة على التجميع باستخدام minimap2، واستُخدمت المعلمة -ax map-ont لإنشاء ملف محاذاة بصيغة SAM. جرى تحسين التجميع أولًا باستخدام racon الإصدار 1.4.20 بالمعلمات التالية: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (فايزر وآخرون، 2017). بعد اكتمال racon، جرى تحسينه مرة أخرى باستخدام medaka الإصدار 1.7.2، باستخدام medaka_consesus، مع ترك جميع المعلمات على قيمها الافتراضية باستثناء المعلمة -m. تم ضبط المعلمة -m على r941_min_hac_g507 لتحديد كيمياء خلية التدفق وتقنية استدعاء القواعد عالية الدقة المستخدمة لبياناتنا (nanoporetech/medaka، 2024). تم استخدام البيانات المفلترة (المشار إليها فيما يلي باسم البيانات الميكروبية) والتجميع النهائي النظيف للتحليل اللاحق.
لأغراض التصنيف التكسونومي، تم تصنيف القراءات والقطع المتجاورة المُجمَّعة باستخدام برنامج Kraken2 الإصدار 2.1.2 (Wood et al., 2019). يتم إنشاء تقارير وملفات إخراج للقراءات والتجميعات على التوالي. استخدم الخيار ‎–use-names لتحليل القراءات والتجميعات. يتم تحديد الخيارين ‎–gzip-compressed و‎–paired لقطاعات القراءات. تم تقدير الوفرة النسبية للتصنيفات في الميتاجينومات باستخدام برنامج Bracken الإصدار 2.8 (Lu et al., 2017). أنشأنا أولًا قاعدة بيانات kmer تحتوي على 1000 قاعدة باستخدام برنامج bracken-build بالمعلمات التالية: ‎-d-k 35 -l 1000 بعد اكتمال البناء، يعمل برنامج براكن بناءً على التقرير الذي أنشأه برنامج كراكن 2 ويقوم بتصفية البيانات باستخدام الخيارات التالية: -d -I -O-p 1000 -l

يتم اختيار أحد الخيارات P أو G أو S بناءً على مستوى التصنيف المُحلل. ولتقليل تأثير التصنيفات الإيجابية الخاطئة، تم اعتماد حد أدنى للوفرة النسبية قدره 1e-4 (1/10000 قراءة). قبل التحليل الإحصائي، تم تحويل الوفرة النسبية التي أبلغ عنها برنامج براكن (fraction_total_reads) باستخدام تحويل النسبة اللوغاريتمية المركزية (CLR) (أيتشيسون، 1982). تم اختيار طريقة CLR لتحويل البيانات لأنها ثابتة المقياس وكافية لمجموعات البيانات غير المتفرقة (غلور وآخرون، 2017). يستخدم تحويل CLR اللوغاريتم الطبيعي. تم تطبيع بيانات العد التي أبلغ عنها برنامج براكن باستخدام التعبير اللوغاريتمي النسبي (RLE) (أندرس وهوبر، 2010). تم إنشاء الأشكال باستخدام مزيج من مكتبة matplotlib الإصدار 3.7.1، ومكتبة seaborn الإصدار 3.7.2، ومكتبة sequential logarithms (Gloor et al., 2017)، ومكتبة stantanotations الإصدار 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). حُسبت نسبة Bacillus/Bacteroidetes لكل عينة باستخدام تعداد البكتيريا المُعَيَّر. القيم المذكورة في الجداول مُقَرَّبة إلى أربعة منازل عشرية. حُسب مؤشر تنوع سيمبسون باستخدام برنامج alpha_diversity.py المُضمَّن في حزمة KrakenTools الإصدار 1.2 (Lu et al., 2022). يُقدَّم تقرير Bracken في البرنامج النصي، ويُقدَّم مؤشر سيمبسون "Si" للمعامل -an. تم تعريف الاختلافات الكبيرة في الوفرة على أنها فروق متوسطة في قيمة CLR ≥ 1 أو ≤ -1. يشير فرق متوسط ​​قيمة CLR البالغ ±1 إلى زيادة قدرها 2.7 ضعف في وفرة نوع العينة. تشير الإشارة (+/-) إلى ما إذا كان التصنيف أكثر وفرة في عينة PPA وعينة التحكم، على التوالي. تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار مان-ويتني U (فيرتانين وآخرون، 2020). تم استخدام برنامج Statsmodels الإصدار 0.14 (بنجاميني وهوكبرغ، 1995؛ سيبولد وبيركتولد، 2010)، وطُبقت إجراءات بنجاميني-هوكبرغ لتصحيح اختبارات الفرضيات المتعددة. تم استخدام قيمة p المعدلة ≤ 0.05 كعتبة لتحديد الدلالة الإحصائية.
أُجريت عملية ترميز الجينات وتقدير وفرتها النسبية باستخدام نسخة مُعدّلة من البروتوكول الموصوف من قِبل مارانغا وآخرون (مارانغا وآخرون، 2023). في البداية، أُزيلت القطع المتجاورة التي يقل طولها عن 500 زوج قاعدي من جميع التجميعات باستخدام برنامج SeqKit الإصدار 2.5.1 (شين وآخرون، 2016). ثم جُمعت التجميعات المُختارة في جينوم شامل. حُددت الأُطر المفتوحة للقراءة (ORFs) باستخدام برنامج Prodigal الإصدار 1.0.1 (وهو إصدار مُوازٍ لبرنامج Prodigal الإصدار 2.6.3) مع المعلمات التالية: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024). ثم جرى ترشيح ملفات النيوكليوتيدات الناتجة باستخدام بايثون لإزالة جميع الجينات غير المكتملة. بعد ذلك، استُخدم برنامج CD-HIT الإصدار 4.8.1 لتجميع الجينات باستخدام المعلمات التالية: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012). استُخدم فهرس الجينات غير المتكرر المُنشأ لتقدير وفرة الجينات وشرحها. قُدّرت الوفرة النسبية للجينات باستخدام KMA الإصدار 1.4.9 (Clausen et al., 2018). أولًا، أنشئ ملف فهرس باستخدام KMA index بالمعلمات التالية: -i -Oثم، باستخدام الفهرس المُنشأ مع قراءات الميكروبات لكل عينة كما هو موضح في قسم مسار المعلوماتية الحيوية، تم تشغيل KMA بالمعلمات التالية: -i -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. بعد ذلك، تم توحيد عدد الجينات باستخدام CLR، واستُخدم تحليل المكونات الرئيسية (PCA) من مكتبة Scikit-learn (Pedregosa et al., 2011). أُجريت عملية ترميز الجينات المتوقعة على فهرس الجينات غير المتكرر باستخدام برنامج emapper.py النصي من eggNOG الإصدار 2.1.12 وقاعدة بيانات eggNOG الإصدار 5.0.2 بالمعلمات التالية: –itype CDS –cpu 24 -i– فهرس البيانات–go_evidence غير إلكتروني – إخراج– دليل الإخراج–target_orthologs all –seed_ortholog_evalue 0.001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(كانتالابيدرا وآخرون، 2021). خضعت نتائج تحليل التجميع الهرمي (KMA) للفحص لاختيار الجينات ذات التغطية الكافية للقالب وتطابق القالب (≥ 90%) والوفرة (عمق ≥ 3). تم تحويل نتائج عمق KMA باستخدام CLR كما هو موضح سابقًا. ثم قورنت نتائج KMA بمعرفات القطع المتجاورة من نتائج الشرح الوظيفي والتصنيف باستخدام مصدر القطع المتجاورة لكل جين. وكما هو الحال مع التصنيفات، عُرّفت الاختلافات الكبيرة في وفرة الجينات بأنها الجينات التي يكون متوسط ​​فرق CLR فيها ≥ 1 أو ≤ -1، مع إشارة (+/-) تشير إلى أن الجين كان أكثر وفرة في عينات PPA أو عينات التحكم، على التوالي.
تم تجميع الجينات مبدئيًا وفقًا لمعرفات الجينات المتماثلة (KO) في موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) المُخصصة بواسطة eggNOG لمقارنة وفرة مسارات الجينات. تم استبعاد الجينات التي لا تحتوي على أي حذف جيني أو الجينات التي تحتوي على حذف جيني متعدد قبل التحليل. ثم حُسب متوسط ​​وفرة كل حذف جيني لكل عينة، وأُجري التحليل الإحصائي. عُرّفت جينات استقلاب حمض البيركلورو أسيتيك (PPA) بأنها أي جين مُخصص له الصف ko00640 في عمود KEGG_Pathway، مما يشير إلى دوره في استقلاب البروبيونات وفقًا لـ KEGG. الجينات التي تم تحديدها على أنها مرتبطة بإنتاج حمض البيركلورو أسيتيك (PPA) مُدرجة في الجدول التكميلي 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). أُجريت اختبارات التبديل لتحديد جينات استقلاب وإنتاج حمض البيركلورو أسيتيك (PPA) الأكثر وفرة بشكل ملحوظ في كل نوع من أنواع العينات. أُجري ألف تبديل لكل جين تم تحليله. تم استخدام قيمة p تساوي 0.05 كحد فاصل لتحديد الدلالة الإحصائية. تمّ إسناد وظائف جينية فردية ضمن مجموعة جينية بناءً على وظائف الجينات التمثيلية داخل تلك المجموعة. ويمكن تحديد التصنيفات المرتبطة باستقلاب و/أو إنتاج حمض البيركلوريك (PPA) من خلال مطابقة معرّفات القطع المتجاورة (contig IDs) في ملفات مخرجات برنامج Kraken2 مع نفس معرّفات القطع المتجاورة المحفوظة أثناء عملية الإسناد الوظيفي باستخدام برنامج eggNOG. أُجري اختبار الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار مان-ويتني U الموصوف سابقًا. وتمّ تصحيح نتائج الاختبارات المتعددة باستخدام إجراء بنجاميني-هوخبيرغ. واعتُبرت قيمة p ≤ 0.05 حدًا فاصلًا لتحديد الدلالة الإحصائية.
تم تقييم تنوع الميكروبيوم المعوي للفئران باستخدام مؤشر سيمبسون للتنوع. لم تُلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية بين عينات المجموعة الضابطة وعينات PPA من حيث تنوع الأجناس والأنواع (قيمة p للجنس: 0.18، قيمة p للأنواع: 0.16) (الشكل 1). ثم قورن التركيب الميكروبي باستخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA). يُظهر الشكل 2 تجميع العينات حسب شعبها، مما يشير إلى وجود اختلافات في تركيب أنواع الميكروبيوم بين عينات PPA والمجموعة الضابطة. كان هذا التجميع أقل وضوحًا على مستوى الجنس، مما يوحي بأن PPA يؤثر على أنواع معينة من البكتيريا (الشكل التكميلي 1).
الشكل 1. التنوع الألفا للأجناس وتكوين الأنواع في ميكروبيوم أمعاء الفأر. مخططات الصندوق توضح مؤشرات تنوع سيمبسون للأجناس (أ) والأنواع (ب) في عينات PPA وعينات التحكم. تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار مان-ويتني U، وتم إجراء تصحيح متعدد باستخدام إجراء بنجاميني-هوخبيرغ. ns، قيمة p غير دالة إحصائيًا (p>0.05).
الشكل 2. نتائج تحليل المكونات الرئيسية لتكوين ميكروبيوم أمعاء الفئران على مستوى النوع. يُظهر مخطط تحليل المكونات الرئيسية توزيع العينات عبر أول مكونين رئيسيين. تشير الألوان إلى نوع العينة: الفئران المعرضة لمادة PPA باللون الأرجواني، والفئران الضابطة باللون الأصفر. تم تمثيل المكونين الرئيسيين 1 و2 على المحورين السيني والصادي على التوالي، ويتم التعبير عنهما كنسبة التباين المُفسَّر.
باستخدام بيانات العد المحولة بتقنية RLE، لوحظ انخفاض ملحوظ في متوسط ​​نسبة البكتيريا العصوية/البكتيريا اللاهوائية في فئران المجموعة الضابطة وفئران PPA (المجموعة الضابطة: 9.66، فئران PPA: 3.02؛ قيمة p = 0.0011). ويعود هذا الاختلاف إلى زيادة وفرة البكتيريا العصوية في فئران PPA مقارنةً بالمجموعة الضابطة، على الرغم من أن هذا الاختلاف لم يكن ذا دلالة إحصائية (متوسط ​​نسبة البكتيريا العصوية في المجموعة الضابطة: 5.51، متوسط ​​نسبة البكتيريا العصوية في فئران PPA: 6.62؛ قيمة p = 0.054)، بينما كانت وفرة البكتيريا العصوية متقاربة (متوسط ​​نسبة البكتيريا العصوية في المجموعة الضابطة: 7.76، متوسط ​​نسبة البكتيريا العصوية في فئران PPA: 7.60؛ قيمة p = 0.18).
أظهر تحليل وفرة الأنواع التصنيفية للميكروبيوم المعوي أن شعبة واحدة و77 نوعًا اختلفت اختلافًا كبيرًا بين عينات PPA وعينات المجموعة الضابطة (الجدول التكميلي 2). وكانت وفرة 59 نوعًا في عينات PPA أعلى بكثير من وفرتها في عينات المجموعة الضابطة، بينما كانت وفرة 16 نوعًا فقط في عينات المجموعة الضابطة أعلى من وفرتها في عينات PPA (الشكل 3).
الشكل 3. وفرة الأصناف المختلفة في ميكروبيوم أمعاء فئران PPA وفئران المجموعة الضابطة. تُظهر مخططات فولكانو اختلافات في وفرة الأجناس (أ) أو الأنواع (ب) بين عينات PPA والمجموعة الضابطة. تشير النقاط الرمادية إلى عدم وجود فرق معنوي في وفرة الأصناف. تشير النقاط الملونة إلى اختلافات معنوية في الوفرة (قيمة p ≤ 0.05). تظهر أعلى 20 صنفًا ذات أكبر اختلافات في الوفرة بين أنواع العينات باللون الأحمر والأزرق الفاتح (عينات المجموعة الضابطة وعينات PPA)، على التوالي. كانت النقاط الصفراء والبنفسجية أكثر وفرة بمقدار 2.7 مرة على الأقل في عينات المجموعة الضابطة أو عينات PPA مقارنةً بعينات المجموعة الضابطة. تمثل النقاط السوداء الأصناف ذات الوفرة المختلفة بشكل معنوي، بمتوسط ​​اختلافات CLR بين -1 و1. تم حساب قيم p باستخدام اختبار مان-ويتني U وتم تصحيحها لاختبارات متعددة باستخدام إجراء بنجاميني-هوخبيرغ. تشير اختلافات CLR المتوسطة المكتوبة بخط غامق إلى اختلافات معنوية في الوفرة.
بعد تحليل التركيب الميكروبي للأمعاء، أجرينا توصيفًا وظيفيًا للميكروبيوم. بعد استبعاد الجينات ذات الجودة المنخفضة، تم تحديد 378,355 جينًا فريدًا في جميع العينات. استُخدمت وفرة هذه الجينات المُحوّلة في تحليل المكونات الرئيسية (PCA)، وأظهرت النتائج درجة عالية من تجميع أنواع العينات بناءً على خصائصها الوظيفية (الشكل 4).
الشكل 4. نتائج تحليل المكونات الرئيسية (PCA) باستخدام الملف الوظيفي لميكروبيوم أمعاء الفئران. يُظهر مخطط PCA توزيع العينات عبر أول مكونين رئيسيين لها. تشير الألوان إلى نوع العينة: الفئران المعرضة لمادة PPA باللون الأرجواني، والفئران الضابطة باللون الأصفر. تم تمثيل المكونين الرئيسيين 1 و2 على المحورين السيني والصادي على التوالي، ويتم التعبير عنهما كنسبة التباين المُفسَّر.
بعد ذلك، فحصنا وفرة الطفرات الجينية المُعطَّلة في قاعدة بيانات KEGG في أنواع العينات المختلفة. تم تحديد 3648 طفرة جينية فريدة، منها 196 طفرة كانت أكثر وفرة بشكل ملحوظ في عينات التحكم، و106 طفرات كانت أكثر وفرة في عينات PPA (الشكل 5). تم الكشف عن 145 جينًا في عينات التحكم و61 جينًا في عينات PPA، مع اختلافات ملحوظة في وفرتها. كانت المسارات المتعلقة باستقلاب الدهون والسكريات الأمينية أكثر وفرة بشكل ملحوظ في عينات PPA (الجدول التكميلي 3). كما كانت المسارات المتعلقة باستقلاب النيتروجين وأنظمة نقل الكبريت أكثر وفرة بشكل ملحوظ في عينات التحكم (الجدول التكميلي 3). وكانت وفرة الجينات المتعلقة باستقلاب السكريات الأمينية/النيوكليوتيدات (ko:K21279) واستقلاب فوسفات الإينوزيتول (ko:K07291) أعلى بشكل ملحوظ في عينات PPA (الشكل 5). تحتوي عينات التحكم على عدد أكبر بكثير من الجينات المتعلقة باستقلاب البنزوات (ko:K22270)، واستقلاب النيتروجين (ko:K00368)، وتحلل الجلوكوز/تكوين الجلوكوز (ko:K00131) (الشكل 5).
الشكل 5. وفرة المجموعات الوظيفية (KOs) في ميكروبيوم أمعاء فئران PPA وفئران المجموعة الضابطة. يوضح مخطط البركان الاختلافات في وفرة المجموعات الوظيفية (KOs). تشير النقاط الرمادية إلى المجموعات الوظيفية التي لم تكن وفرتها مختلفة بشكل ملحوظ بين أنواع العينات (قيمة p > 0.05). تشير النقاط الملونة إلى اختلافات ملحوظة في الوفرة (قيمة p ≤ 0.05). تظهر المجموعات الوظيفية العشرين ذات أكبر اختلافات في الوفرة بين أنواع العينات باللونين الأحمر والأزرق الفاتح، والتي تتوافق مع عينات المجموعة الضابطة وعينات PPA، على التوالي. تشير النقاط الصفراء والبنفسجية إلى المجموعات الوظيفية التي كانت أكثر وفرة بمقدار 2.7 ضعف على الأقل في عينات المجموعة الضابطة وعينات PPA، على التوالي. تشير النقاط السوداء إلى المجموعات الوظيفية ذات الوفرة المختلفة بشكل ملحوظ، بمتوسط ​​اختلافات CLR بين -1 و1. تم حساب قيم p باستخدام اختبار مان-ويتني U وتم تعديلها للمقارنات المتعددة باستخدام إجراء بنجاميني-هوخبيرغ. يشير NaN إلى أن المجموعة الوظيفية لا تنتمي إلى مسار في KEGG. تشير قيم متوسط ​​فرق CLR المكتوبة بخط غامق إلى اختلافات كبيرة في الوفرة. للاطلاع على معلومات مفصلة حول المسارات التي تنتمي إليها الجينات المذكورة، انظر الجدول التكميلي 3.
من بين الجينات المُعَلَّمة، أظهر 1601 جينًا اختلافاتٍ معنويةً في وفرتها بين أنواع العينات (p ≤ 0.05)، حيث كان كل جين منها أكثر وفرةً بمقدار 2.7 ضعف على الأقل. من بين هذه الجينات، كانت 4 جينات أكثر وفرةً في عينات الضبط، و1597 جينًا أكثر وفرةً في عينات PPA. نظرًا لخصائص PPA المضادة للميكروبات، فحصنا وفرة جينات استقلاب وإنتاج PPA بين أنواع العينات. من بين 1332 جينًا مرتبطًا باستقلاب PPA، كان 27 جينًا أكثر وفرةً بشكلٍ معنوي في عينات الضبط، و12 جينًا أكثر وفرةً في عينات PPA. من بين 223 جينًا مرتبطًا بإنتاج PPA، كان جين واحد أكثر وفرةً بشكلٍ معنوي في عينات PPA. يُظهر الشكل 6A بوضوحٍ أكبر وفرة الجينات المشاركة في استقلاب PPA، مع وفرةٍ أعلى بشكلٍ معنوي في عينات الضبط وأحجام تأثير كبيرة، بينما يُبرز الشكل 6B جيناتٍ فرديةً ذات وفرةٍ أعلى بشكلٍ معنوي في عينات PPA.
الشكل 6. وفرة الجينات المرتبطة بـ PPA في ميكروبيوم أمعاء الفأر. توضح مخططات فولكانو الاختلافات في وفرة الجينات المرتبطة باستقلاب PPA (أ) وإنتاجه (ب). تشير النقاط الرمادية إلى الجينات التي لم تكن وفرتها مختلفة بشكل ملحوظ بين أنواع العينات (قيمة p > 0.05). تشير النقاط الملونة إلى اختلافات ملحوظة في الوفرة (قيمة p ≤ 0.05). تظهر الجينات العشرين ذات أكبر اختلافات في الوفرة باللون الأحمر والأزرق الفاتح (عينات التحكم وعينات PPA)، على التوالي. كانت وفرة النقاط الصفراء والبنفسجية أكبر بمقدار 2.7 مرة على الأقل في عينات التحكم وعينات PPA مقارنةً بعينات التحكم. تمثل النقاط السوداء الجينات ذات الوفرة المختلفة بشكل ملحوظ، بمتوسط ​​اختلافات CLR بين -1 و1. تم حساب قيم p باستخدام اختبار مان-ويتني U وتم تصحيحها للمقارنات المتعددة باستخدام إجراء بنجاميني-هوخبيرغ. تتوافق الجينات مع الجينات التمثيلية في فهرس الجينات غير المتكررة. تتكون أسماء الجينات من رمز KEGG الذي يدل على جين مُعطَّل. تشير الفروق المتوسطة المكتوبة بخط غامق في نسبة التعبير الجيني (CLR) إلى اختلافات كبيرة في وفرة الجينات. يشير الخط الواصل (-) إلى عدم وجود رمز للجين في قاعدة بيانات KEGG.
تم تحديد التصنيفات التي تحمل جينات مرتبطة باستقلاب و/أو إنتاج حمض الفوسفوبروبيك (PPA) من خلال مطابقة الهوية التصنيفية للقطع المتجاورة مع مُعرّف القطعة المتجاورة للجين. على مستوى الجنس، وُجد أن 130 جنسًا تحمل جينات مرتبطة باستقلاب حمض الفوسفوبروبيك، و61 جنسًا تحمل جينات مرتبطة بإنتاجه (الجدول التكميلي 4). مع ذلك، لم تُظهر أي من الأجناس اختلافاتٍ دالة إحصائيًا في الوفرة (p > 0.05).
على مستوى الأنواع، وُجد أن 144 نوعًا من البكتيريا تحمل جينات مرتبطة باستقلاب حمض البيركلوريك (PPA)، بينما وُجد أن 68 نوعًا من البكتيريا تحمل جينات مرتبطة بإنتاج حمض البيركلوريك (الجدول التكميلي 5). من بين البكتيريا التي تستقلب حمض البيركلوريك، أظهرت ثماني بكتيريا زيادات ملحوظة في وفرتها بين أنواع العينات، كما أظهرت جميعها تغيرات ملحوظة في التأثير (الجدول التكميلي 6). وكانت جميع البكتيريا التي تم تحديدها والتي تستقلب حمض البيركلوريك والتي أظهرت اختلافات ملحوظة في وفرتها أكثر وفرة في عينات حمض البيركلوريك. كشف تصنيف الأنواع عن ممثلين لأجناس لم تختلف اختلافًا ملحوظًا بين أنواع العينات، بما في ذلك العديد من أنواع البكتيريا من جنسي Bacteroides وRuminococcus، بالإضافة إلى Duncania dubois وMyxobacterium enterica وMonococcus pectinolyticus وAlcaligenes polymorpha. من بين البكتيريا المنتجة لحمض البيركلوريك، أظهرت أربع بكتيريا اختلافات ملحوظة في وفرتها بين أنواع العينات. وشملت الأنواع التي أظهرت اختلافات ملحوظة في الوفرة: Bacteroides novorossi وDuncania dubois وMyxobacterium enteritidis وRuminococcus bovis.
في هذه الدراسة، فحصنا تأثيرات التعرض لمركب PPA على الميكروبات المعوية لدى الفئران. يُمكن أن يُثير مركب PPA استجاباتٍ مُختلفة في البكتيريا نظرًا لإنتاجه من قِبل أنواعٍ مُعينة، أو استخدامه كمصدرٍ غذائي من قِبل أنواعٍ أخرى، أو امتلاكه لتأثيراتٍ مُضادة للميكروبات. لذلك، قد تُؤدي إضافته إلى بيئة الأمعاء عبر المُكملات الغذائية إلى تأثيراتٍ مُختلفة اعتمادًا على مدى تحمل البكتيريا له، وحساسيتها له، وقدرتها على استخدامه كمصدرٍ غذائي. قد يتم استبعاد أنواع البكتيريا الحساسة واستبدالها بأنواعٍ أكثر مُقاومة لمركب PPA أو قادرة على استخدامه كمصدرٍ غذائي، مما يُؤدي إلى تغييراتٍ في تركيبة الميكروبات المعوية. كشفت نتائجنا عن اختلافاتٍ كبيرة في التركيب الميكروبي، ولكن دون أي تأثيرٍ على التنوع الميكروبي الإجمالي. لوحظت أكبر التأثيرات على مستوى الأنواع، حيثُ وُجد أكثر من 70 نوعًا مختلفًا بشكلٍ كبير في وفرتها بين عينات PPA وعينات التحكم (الجدول التكميلي 2). أظهر تقييم إضافي لتكوين العينات المعرضة لمركب PPA تباينًا أكبر في أنواع الميكروبات مقارنةً بالعينات غير المعرضة له، مما يشير إلى أن مركب PPA قد يعزز خصائص نمو البكتيريا ويحد من أعدادها القادرة على البقاء في بيئات غنية به. وبالتالي، قد يُحدث مركب PPA تغييرات انتقائية بدلًا من إحداث اضطراب واسع النطاق في تنوع الميكروبات المعوية.
أظهرت دراسات سابقة أن المواد الحافظة للأغذية، مثل حمض البيرفلورو أسيتيك (PPA)، تُغير وفرة مكونات الميكروبيوم المعوي دون التأثير على التنوع الكلي (ناجبال وآخرون، 2021). في هذه الدراسة، لاحظنا اختلافاتٍ بارزة بين أنواع البكتيريا من شعبة البكتيرويديتس (المعروفة سابقًا باسم البكتيرويديتس)، والتي كانت أكثر وفرةً بشكلٍ ملحوظ في الفئران المعرضة لحمض البيرفلورو أسيتيك. يرتبط ازدياد وفرة أنواع البكتيرويدس بزيادة تحلل المخاط، مما قد يزيد من خطر الإصابة بالعدوى ويُعزز الالتهاب (كورنيك وآخرون، 2015؛ ديساي وآخرون، 2016؛ بينزول وآخرون، 2019). أظهرت إحدى الدراسات أن ذكور الفئران حديثة الولادة التي عولجت ببكتيريا Bacteroides fragilis أبدت سلوكيات اجتماعية تُشبه اضطراب طيف التوحد (كارميل وآخرون، 2023)، كما أظهرت دراسات أخرى أن أنواعًا من بكتيريا Bacteroides قادرة على تغيير النشاط المناعي والتسبب في اعتلال عضلة القلب الالتهابي المناعي الذاتي (جيل كروز وآخرون، 2019). ولوحظ أيضًا ارتفاع ملحوظ في أعداد أنواع تنتمي إلى أجناس Ruminococcus وPrevotella وParabacteroides لدى الفئران المعرضة لمركب PPA (كوريتي وآخرون، 2018). وترتبط بعض أنواع Ruminococcus بأمراض مثل داء كرون من خلال إنتاج السيتوكينات الالتهابية (هينكي وآخرون، 2019)، بينما ترتبط أنواع Prevotella، مثل Prevotella humani، بأمراض أيضية مثل ارتفاع ضغط الدم وحساسية الأنسولين (بيدرسن وآخرون، 2016؛ لي وآخرون، 2017). ●️ ... بدلاً من ذلك، قد يؤدي تعرض الأم لمادة PPA إلى تعزيز نمو الجنين عن طريق جعل أمعاء نسل الفئران أكثر عرضة لاستعمار البكتيريا البكتيرويدية؛ ومع ذلك، فإن تصميم دراستنا لم يسمح بمثل هذا التقييم.
كشف تقييم المحتوى الميتاجينومي عن اختلافات كبيرة في وفرة الجينات المرتبطة باستقلاب وإنتاج حمض البيروكسي أسيتيك (PPA)، حيث أظهرت الفئران المعرضة لحمض البيروكسي أسيتيك وفرة أكبر في الجينات المسؤولة عن إنتاجه، بينما أظهرت الفئران غير المعرضة له وفرة أكبر في الجينات المسؤولة عن استقلاب حمض البيروكسي أسيتيك (PAA) (الشكل 6). تشير هذه النتائج إلى أن تأثير حمض البيروكسي أسيتيك على التركيب الميكروبي قد لا يكون ناتجًا فقط عن استخدامه، وإلا لكانت وفرة الجينات المرتبطة باستقلابه أعلى في ميكروبيوم أمعاء الفئران المعرضة له. أحد التفسيرات هو أن حمض البيروكسي أسيتيك يؤثر على وفرة البكتيريا بشكل أساسي من خلال تأثيراته المضادة للميكروبات، وليس من خلال استخدامه كمغذٍّ للبكتيريا. وقد أظهرت دراسات سابقة أن حمض البيروكسي أسيتيك يثبط نمو بكتيريا السالمونيلا التيفية بطريقة تعتمد على الجرعة (جاكوبسون وآخرون، 2018). قد يؤدي التعرض لتركيزات عالية من حمض البيروكسي أسيتيك إلى انتقاء بكتيريا مقاومة لخصائصه المضادة للميكروبات، والتي قد لا تكون قادرة بالضرورة على استقلابه أو إنتاجه. على سبيل المثال، أظهرت عدة أنواع من بكتيريا Parabacteroides وفرةً أعلى بشكل ملحوظ في عينات PPA، ولكن لم يتم الكشف عن أي جينات مرتبطة باستقلاب أو إنتاج PPA (الجداول التكميلية 2 و4 و5). علاوة على ذلك، ينتشر إنتاج PPA كمنتج ثانوي للتخمر على نطاق واسع بين أنواع مختلفة من البكتيريا (Gonzalez-Garcia et al., 2017). قد يكون التنوع البكتيري الأعلى سببًا في زيادة وفرة الجينات المرتبطة باستقلاب PPA في عينات التحكم (Averina et al., 2020). بالإضافة إلى ذلك، تم التنبؤ بأن 27 جينًا فقط (2.14%) من أصل 1332 جينًا مرتبطة حصريًا باستقلاب PPA. تشارك العديد من الجينات المرتبطة باستقلاب PPA أيضًا في مسارات أيضية أخرى. وهذا يُظهر بوضوح أن وفرة الجينات المشاركة في استقلاب PPA كانت أعلى في عينات التحكم؛ قد تعمل هذه الجينات في مسارات لا تؤدي إلى استخدام PPA أو تكوينه كمنتج ثانوي. في هذه الحالة، أظهر جين واحد فقط مرتبط بتكوين PPA اختلافات كبيرة في الوفرة بين أنواع العينات. على عكس الجينات المرتبطة باستقلاب حمض البيركلوريك (PPA)، تم اختيار جينات مؤشرة لإنتاج حمض البيركلوريك لأنها تشارك بشكل مباشر في المسار البكتيري لإنتاجه. في الفئران المعرضة لحمض البيركلوريك، وُجد أن جميع الأنواع لديها وفرة وقدرة متزايدة بشكل ملحوظ على إنتاجه. يدعم هذا التوقع بأن أحماض البيركلوريك ستؤدي إلى انتقاء البكتيريا المنتجة له، وبالتالي توقع زيادة قدرة إنتاجه. مع ذلك، لا ترتبط وفرة الجينات بالضرورة بتعبيرها الجيني؛ لذا، على الرغم من أن وفرة الجينات المرتبطة باستقلاب حمض البيركلوريك أعلى في عينات التحكم، إلا أن معدل التعبير قد يختلف (شي وآخرون، 2014). لتأكيد العلاقة بين انتشار الجينات المنتجة لحمض البيركلوريك وإنتاجه، يلزم إجراء دراسات حول تعبير الجينات المشاركة في إنتاجه.
كشف التحليل الوظيفي للميتاجينومات الخاصة بعينات PPA وعينات التحكم عن بعض الاختلافات. وأظهر تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لمحتوى الجينات وجود مجموعات منفصلة بين عينات PPA وعينات التحكم (الشكل 5). وكشف التجميع داخل العينات أن محتوى الجينات في عينات التحكم كان أكثر تنوعًا، بينما تجمعت عينات PPA معًا. وكان التجميع حسب محتوى الجينات مماثلاً للتجميع حسب تركيب الأنواع. وبالتالي، تتوافق الاختلافات في وفرة المسارات مع التغيرات في وفرة أنواع وسلالات محددة ضمنها. في عينات PPA، ارتبط مساران ذوا وفرة أعلى بشكل ملحوظ باستقلاب سكريات الأمينو/سكريات النيوكليوتيدات (ko:K21279) ومسارات متعددة لاستقلاب الدهون (ko:K00647، ko:K03801؛ الجدول التكميلي 3). ومن المعروف أن الجينات المرتبطة بـ ko:K21279 مرتبطة بجنس البكتيرويدس، وهو أحد الأجناس التي تضم عددًا أكبر بكثير من الأنواع في عينات PPA. يستطيع هذا الإنزيم التهرب من الاستجابة المناعية عن طريق التعبير عن عديدات السكاريد الكبسولية (وانغ وآخرون، 2008). قد يفسر هذا الزيادة في بكتيريا البكتيرويديتس التي لوحظت في الفئران المعرضة لـ PPA. ويكمل هذا الزيادة في تخليق الأحماض الدهنية التي لوحظت في الميكروبيوم المعوي لـ PPA. تستخدم البكتيريا مسار FASIIko:K00647 (fabB) لإنتاج الأحماض الدهنية، مما قد يؤثر على مسارات التمثيل الغذائي للمضيف (ياو وروك، 2015؛ جونسون وآخرون، 2020)، وقد تلعب التغيرات في استقلاب الدهون دورًا في النمو العصبي (يو وآخرون، 2020). كما لوحظت زيادة في وفرة مسار آخر في عينات PPA، وهو مسار تخليق الهرمونات الستيرويدية (ko:K12343). وهناك أدلة متزايدة على وجود علاقة عكسية بين قدرة الميكروبات المعوية على التأثير في مستويات الهرمونات وتأثرها بها، بحيث قد يكون لارتفاع مستويات الستيرويدات عواقب صحية لاحقة (تيتل وآخرون، 2018).
لا تخلو هذه الدراسة من بعض القيود والاعتبارات. من أهمها أننا لم نُجرِ تقييمات فسيولوجية للحيوانات، وبالتالي لا يُمكننا الجزم بشكل مباشر بوجود ارتباط بين التغيرات في الميكروبيوم وأي مرض. ومن الاعتبارات الأخرى أن الفئران في هذه الدراسة تغذت على نفس النظام الغذائي الذي تغذت عليه أمهاتها. قد تُحدد الدراسات المستقبلية ما إذا كان التحول من نظام غذائي غني بـ PPA إلى نظام غذائي خالٍ منه يُحسّن من تأثيره على الميكروبيوم. ومن قيود دراستنا، كغيرها من الدراسات، صغر حجم العينة. ورغم إمكانية استخلاص استنتاجات صحيحة، إلا أن زيادة حجم العينة ستُعزز القوة الإحصائية عند تحليل النتائج. كما أننا نتوخى الحذر عند استخلاص استنتاجات حول وجود ارتباط بين التغيرات في ميكروبيوم الأمعاء وأي مرض (Yap et al., 2021)، إذ يُمكن لعوامل مُربكة، كالعمر والجنس والنظام الغذائي، أن تُؤثر بشكل كبير على تكوين الكائنات الدقيقة. قد تُفسر هذه العوامل التناقضات الملحوظة في الدراسات المنشورة حول ارتباط الميكروبيوم المعوي بالأمراض المعقدة (جونسون وآخرون، 2019؛ لاغود وناصر، 2023). فعلى سبيل المثال، تبين أن أنواعًا من جنس البكتيرويديتس إما تزداد أو تنقص لدى الحيوانات والبشر المصابين باضطراب طيف التوحد (أنجيليس وآخرون، 2013؛ كوشاك وآخرون، 2017). وبالمثل، وجدت دراسات تكوين الأمعاء لدى مرضى التهاب الأمعاء زيادات ونقصانًا في نفس التصنيفات (والترز وآخرون، 2014؛ فوربس وآخرون، 2018؛ أوبادياي وآخرون، 2023). وللحد من تأثير التحيز الجنسي، حرصنا على ضمان تمثيل متساوٍ للجنسين، بحيث تكون الاختلافات ناتجة على الأرجح عن النظام الغذائي. ومن تحديات التوصيف الوظيفي إزالة تسلسلات الجينات المتكررة. تتطلب طريقة تجميع الجينات لدينا تطابقًا بنسبة 95% في تسلسل الحمض النووي، وتشابهًا بنسبة 85% في الطول، بالإضافة إلى تغطية محاذاة بنسبة 90% لاستبعاد التجميع الخاطئ. مع ذلك، لاحظنا في بعض الحالات وجود مجموعات جينية مشتركة (COGs) تحمل نفس التصنيفات (مثل MUT) (الشكل 6). هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد ما إذا كانت هذه الجينات المتماثلة متميزة، أو مرتبطة بأجناس محددة، أو ما إذا كان هذا قيدًا على منهجية تجميع الجينات. من القيود الأخرى للتصنيف الوظيفي احتمالية سوء التصنيف؛ فجين mmdA البكتيري هو إنزيم معروف يشارك في تخليق البروبيونات، لكن قاعدة بيانات KEGG لا تربطه بمسار استقلاب البروبيونات. في المقابل، فإن الجينات المتماثلة scpB وmmcD مرتبطة ببعضها. قد يؤدي العدد الكبير من الجينات التي لا تحتوي على جينات معطلة إلى عدم القدرة على تحديد الجينات المرتبطة بـ PPA عند تقييم وفرة الجينات. ستستفيد الدراسات المستقبلية من تحليل الميتا-ترانسكريبتوم، الذي يمكن أن يوفر فهمًا أعمق للخصائص الوظيفية للميكروبات المعوية، ويربط التعبير الجيني بالتأثيرات اللاحقة المحتملة. في الدراسات التي تتناول اضطرابات النمو العصبي المحددة أو أمراض الأمعاء الالتهابية، يلزم إجراء تقييمات فسيولوجية وسلوكية للحيوانات لربط التغيرات في تكوين الميكروبيوم بهذه الاضطرابات. كما أن إجراء دراسات إضافية لزرع ميكروبيوم الأمعاء في فئران خالية من الجراثيم سيكون مفيدًا لتحديد ما إذا كان الميكروبيوم عاملًا محفزًا للمرض أو سمة مميزة له.
باختصار، أثبتنا أن مادة PPA الغذائية تُؤثر على تركيبة الميكروبات المعوية. تُعدّ PPA مادة حافظة معتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية، وتوجد على نطاق واسع في العديد من الأطعمة، وقد يُؤدي التعرض لها لفترات طويلة إلى اضطراب البكتيريا المعوية الطبيعية. وقد وجدنا تغيرات في وفرة العديد من البكتيريا، مما يُشير إلى أن PPA يُمكن أن تُؤثر على تركيبة الميكروبات المعوية. يُمكن أن تُؤدي التغيرات في الميكروبات إلى تغيرات في مستويات بعض المسارات الأيضية، مما قد يُؤدي إلى تغيرات فسيولوجية ذات صلة بصحة الجسم. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد ما إذا كانت تأثيرات PPA الغذائية على التركيبة الميكروبية تُؤدي إلى اختلال التوازن الميكروبي أو أمراض أخرى. تُرسّخ هذه الدراسة الأساس لدراسات مستقبلية حول كيفية تأثير PPA على تركيبة الأمعاء على صحة الإنسان.
تتوفر مجموعات البيانات المعروضة في هذه الدراسة في مستودعات إلكترونية. اسم المستودع ورقم الوصول هما: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/، PRJNA1092431.
تمت الموافقة على هذه الدراسة الحيوانية من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة سنترال فلوريدا (UCF-IACUC) (رقم تصريح استخدام الحيوانات: PROTO202000002). وتتوافق هذه الدراسة مع القوانين واللوائح المحلية والمتطلبات المؤسسية.
NG: وضع التصور، جمع البيانات، التحليل الرسمي، البحث، المنهجية، البرمجيات، التصور البصري، كتابة المسودة الأصلية، مراجعة وتحرير المسودة. LA: وضع التصور، جمع البيانات، المنهجية، الموارد، مراجعة وتحرير المسودة. SH: التحليل الرسمي، البرمجيات، مراجعة وتحرير المسودة. SA: البحث، مراجعة وتحرير المسودة. رئيس لجنة التحكيم: البحث، مراجعة وتحرير المسودة. SN: وضع التصور، إدارة المشروع، الموارد، الإشراف، مراجعة وتحرير المسودة. TA: وضع التصور، إدارة المشروع، الإشراف، مراجعة وتحرير المسودة.
أعلن المؤلفون أنهم لم يتلقوا أي دعم مالي لإجراء البحث أو التأليف أو نشر هذه المقالة.
يُعلن المؤلفون أن البحث قد أُجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يُمكن اعتبارها تضاربًا محتملاً في المصالح. غير منطبق.
جميع الآراء الواردة في هذه المقالة هي آراء المؤلفين فقط، ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر مؤسساتهم أو ناشريهم أو محرريهم أو مراجعيهم. ولا يضمن الناشر أو يصادق على أي منتجات تم تقييمها في هذه المقالة، أو أي ادعاءات صادرة عن الشركات المصنعة لها.
يمكن الاطلاع على المواد التكميلية لهذه المقالة عبر الإنترنت: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
عبدلي، ل. س.، وسامسام، أ.، وناصر، س. أ. (2019). يحفز حمض البروبيونيك التليف الدبقي والالتهاب العصبي عن طريق تنظيم مسار PTEN/AKT في اضطرابات طيف التوحد. التقارير العلمية 9، 8824-8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
أيتشيسون، ج. (1982). التحليل الإحصائي للبيانات التركيبية. مجلة الجمعية الملكية للإحصاء، السلسلة ب، المنهجية. 44، 139-160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
أهن جيه، كوون إتش، كيم واي جيه (2023). نسبة الفيرميكوتس/بكتيرويديتس كعامل خطر للإصابة بسرطان الثدي. مجلة الطب السريري، 12، 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
أندرس إس، هوبر دبليو (2010). تحليل التعبير التفاضلي لبيانات تعداد التسلسل. نات بريف. 1-1، 1-10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
أنجيليس، دكتوراه في الطب، بيكولو، م.، فانيني، ل.، سيراغوزا، س.، جياكومو، أ.د.، سيرازانيتي، د.إ.، وآخرون. (2013). الميكروبات المعوية والميتابولوم لدى الأطفال المصابين بالتوحد واضطراب النمو الشامل غير المحدد. PLoS One 8، e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
أفيرينا، أو. في.، كوفتون، أ. س.، بولياكوفا، س. إ.، سافيلوفا، أ. م.، ريبريكوف، د. ف.، دانيلينكو، ف. ن. (2020). الخصائص العصبية الأيضية للبكتيريا المعوية لدى الأطفال الصغار المصابين باضطرابات طيف التوحد. مجلة علم الأحياء الدقيقة الطبية 69، 558-571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
باكيرو، ف.، ونومبيلا، ك. (2012). الميكروبيوم كعضو بشري. علم الأحياء الدقيقة السريري والعدوى 18، 2-4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
باور، ت.، ودور، ب. (2023). رؤى جديدة حول فسيولوجيا البكتيريا المنتجة لحمض البروبيونيك: Anaerotignum propionicum وAnaerotignum neopropionicum (المعروفة سابقًا باسم Clostridium propionicum وClostridium neopropionicum). الكائنات الدقيقة 11، 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
بازر مهاجم، سبنسر تي إي، وو جي، كود تا، مينينجر إس جي (2004). تغذية الأم ونمو الجنين. ي نوتر. 134، 2169-2172. دوى: 10.1093/جن/134.9.2169
بنجاميني، ي.، وهوكبرغ، ج. (1995). التحكم في معدل النتائج الإيجابية الكاذبة: منهج عملي وفعال للاختبارات المتعددة. مجلة الجمعية الملكية للإحصاء، السلسلة ب، المنهجية. 57، 289-300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x