تُعدّ المستقلبات المُعدِّلة للمناعة سمةً أساسيةً للبيئة الدقيقة للورم، ولكن باستثناءات قليلة، لا تزال هويتها غير معروفة إلى حد كبير. في هذه الدراسة، قمنا بتحليل الأورام والخلايا التائية من أورام وسوائل استسقاء مرضى سرطان الخلايا المصلية عالي الدرجة، وذلك للكشف عن الميتابولوم في هذه الأجزاء المختلفة من البيئة الدقيقة للورم. يُظهر سائل الاستسقاء وخلايا الورم اختلافاتٍ واسعةً في المستقلبات. فمقارنةً بسائل الاستسقاء، تُظهر الخلايا التائية المتسللة إلى الورم إثراءً ملحوظًا في 1-ميثيل نيكوتيناميد (MNA). على الرغم من ارتفاع مستوى MNA في الخلايا التائية، إلا أن التعبير عن إنزيم ناقل ميثيل نيكوتيناميد (الذي يحفز نقل مجموعات الميثيل من S-أدينوسيل ميثيونين إلى نيكوتيناميد) يقتصر على الخلايا الليفية وخلايا الورم. وظيفيًا، يحفز MNA الخلايا التائية على إفراز عامل نخر الورم ألفا، وهو سيتوكين مُعزز للورم. لذلك، فإن MNA المشتق من TME يساهم في التنظيم المناعي للخلايا التائية ويمثل هدفًا محتملاً للعلاج المناعي لعلاج السرطان البشري.
يمكن أن يكون للمستقلبات المشتقة من الأورام تأثير مثبط قوي على المناعة المضادة للأورام، وتشير أدلة متزايدة إلى أنها قد تُشكل أيضًا قوة دافعة رئيسية لتطور المرض (1). بالإضافة إلى تأثير واربورغ، بدأت الدراسات الحديثة في تحديد الحالة الأيضية للخلايا السرطانية وعلاقتها بالحالة المناعية للبيئة الدقيقة للورم. وقد أظهرت الدراسات التي أُجريت على نماذج الفئران وخلايا T البشرية أن استقلاب الغلوتامين (2)، والاستقلاب التأكسدي (3)، واستقلاب الجلوكوز (4) يمكن أن تؤثر بشكل مستقل على مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا المناعية. وتُثبط العديد من المستقلبات في هذه المسارات وظيفة خلايا T المضادة للأورام. وقد ثبت أن تثبيط الإنزيم المساعد رباعي هيدروبترين (BH4) يُمكن أن يُلحق الضرر بتكاثر خلايا T، وأن زيادة BH4 في الجسم يُمكن أن تُعزز الاستجابة المناعية المضادة للأورام التي تتوسطها خلايا CD4 وCD8. علاوة على ذلك، يُمكن التغلب على التأثير المثبط للمناعة للكينورينين عن طريق إعطاء BH4 (5). في أورام الدماغ الأرومية الدبقية الطافرة في إنزيم إيزوسيترات ديهيدروجينيز (IDH)، يثبط إفراز إنانتيوميبوليك (R)-2-هيدروكسي جلوتارات (R-2-HG) تنشيط الخلايا التائية وتكاثرها ونشاطها التحللي (6). وقد تبين مؤخرًا أن ميثيل جليوكسال، وهو ناتج ثانوي لعملية تحلل الجلوكوز، يُنتج بواسطة الخلايا الكابتة ذات الأصل النخاعي، وأن نقل ميثيل جليوكسال إلى الخلايا التائية يمكن أن يثبط وظيفة الخلايا التائية الفعالة. في العلاج، يمكن لتحييد ميثيل جليوكسال التغلب على نشاط الخلايا الكابتة المشتقة من النخاع (MDSC) وتعزيز علاج حجب نقاط التفتيش المناعية بشكل تآزري في نماذج الفئران (7). تؤكد هذه الدراسات مجتمعة على الدور المحوري للمستقلبات المشتقة من بيئة الورم الدقيقة في تنظيم وظيفة الخلايا التائية ونشاطها.
تم الإبلاغ على نطاق واسع عن خلل في وظيفة الخلايا التائية في سرطان المبيض (8). ويعود ذلك جزئيًا إلى الخصائص الأيضية المتأصلة في نقص الأكسجين والأوعية الدموية الورمية غير الطبيعية (9)، مما يؤدي إلى تحويل الجلوكوز والتريبتوفان إلى نواتج ثانوية مثل حمض اللاكتيك والكينورينين. ويؤدي فرط اللاكتات خارج الخلوي إلى تقليل إنتاج الإنترفيرون غاما (IFN-γ) ويحفز تمايز المجموعات الفرعية المثبطة لنخاع العظم (10، 11). كما أن استهلاك التريبتوفان يثبط تكاثر الخلايا التائية بشكل مباشر، ويثبط إشارات مستقبلات الخلايا التائية (12-14). وعلى الرغم من هذه الملاحظات، فقد أُجريت العديد من الدراسات المتعلقة بأيض المناعة في مزارع الخلايا التائية في المختبر باستخدام أوساط محسّنة، أو اقتصرت على نماذج الفئران المتماثلة في الجسم الحي، ولا يعكس أي منهما بشكل كامل تباين سرطانات الإنسان والبيئة الفيزيولوجية الكلية والجزئية.
من السمات الشائعة لسرطان المبيض انتشاره إلى الصفاق وظهور الاستسقاء. ويرتبط تراكم السائل الخلوي في الاستسقاء بمراحل متقدمة من المرض وسوء الإنذار (15). ووفقًا للتقارير، فإن هذا الحيز الفريد يتميز بنقص الأكسجين، وارتفاع مستويات عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) وإنزيم إندولامين 2،3-ديوكسيجيناز (IDO)، كما أنه متسلل بالخلايا التائية التنظيمية والخلايا النخاعية المثبطة (15-18). قد تختلف البيئة الأيضية للاستسقاء عن بيئة الورم نفسه، لذا فإن إعادة برمجة الخلايا التائية في الحيز الصفاقي غير واضحة. إضافةً إلى ذلك، فإن الاختلافات الرئيسية وعدم التجانس بين الاستسقاء والمستقلبات الموجودة في بيئة الورم قد يعيقان تسلل الخلايا المناعية ووظيفتها في الأورام، مما يستدعي إجراء المزيد من البحوث.
لحل هذه المشكلات، صممنا طريقة حساسة لفصل الخلايا وتحليلها باستخدام كروماتوغرافيا السائل مع مطياف الكتلة الترادفي (LC-MS/MS) لدراسة أنواع الخلايا المختلفة (بما في ذلك الخلايا التائية CD4+ وCD8+) داخل الأورام وفيما بينها. تشمل نواتج هذه الطريقة خلايا في نفس بيئة السائل الاستسقائي والورم لدى المريض. نستخدم هذه الطريقة بالتزامن مع قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد وتسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq) لتوفير صورة دقيقة للحالة الأيضية لهذه المجموعات الخلوية الرئيسية. كشفت هذه الطريقة عن زيادة ملحوظة في مستوى 1-ميثيل نيكوتيناميد (MNA) في الخلايا التائية الورمية، وأظهرت التجارب المخبرية أن التأثير المناعي المعدل لـ MNA على وظيفة الخلايا التائية كان غير معروف سابقًا. بشكل عام، تكشف هذه الطريقة عن التفاعلات الأيضية المتبادلة بين الأورام والخلايا المناعية، وتوفر رؤى فريدة حول نواتج تنظيم المناعة، مما قد يكون مفيدًا في علاج سرطان المبيض باستخدام العلاج المناعي القائم على الخلايا التائية.
استخدمنا تقنية قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد لقياس امتصاص الجلوكوز [2-(N-(7-نيتروفينيل-2-أوكسا-1،3-ديازا-4-يل)أمينو)-2-ديوكسي جلوكوز (2-NBDG)] ونشاط الميتوكوندريا [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7، 19، 20) بشكل متزامن، وهما مؤشران نموذجيان يميزان بين الخلايا المناعية وخلايا الورم (الجدول S2 والشكل S1A). أظهر هذا التحليل أن خلايا السائل الاستسقائي وخلايا الورم، مقارنةً بالخلايا التائية، تتميز بمستويات امتصاص جلوكوز أعلى، ولكن باختلافات أقل في نشاط الميتوكوندريا. يبلغ متوسط ​​امتصاص الجلوكوز في الخلايا السرطانية [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ثلاثة إلى أربعة أضعاف مثيله في الخلايا التائية، بينما يبلغ متوسط ​​امتصاص الجلوكوز في الخلايا التائية CD4+ 1.2 ضعف مثيله في الخلايا التائية CD8+، مما يشير إلى اختلاف الاحتياجات الأيضية للخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TIL) حتى في نفس بيئة الورم (الشكل 1أ). في المقابل، يتشابه نشاط الميتوكوندريا في الخلايا السرطانية مع نظيره في الخلايا التائية CD4+، ويكون نشاط الميتوكوندريا في كلا النوعين من الخلايا أعلى منه في الخلايا التائية CD8+ (الشكل 1ب). وبشكل عام، تكشف هذه النتائج عن المستوى الأيضي. فالنشاط الأيضي في الخلايا السرطانية أعلى منه في الخلايا التائية CD4+، والعكس صحيح. وعلى الرغم من هذه التأثيرات بين أنواع الخلايا المختلفة، لا يوجد فرق ثابت في الحالة الأيضية للخلايا التائية CD4+ وCD8+ أو نسبها النسبية في السائل الاستسقائي مقارنةً بالأورام (الشكل 1ج). في المقابل، في الجزء الخلوي CD45-، زادت نسبة الخلايا EpCAM+ في الورم مقارنةً بالسائل الاستسقائي (الشكل 1D). كما لاحظنا اختلافًا أيضيًا واضحًا بين مكونات الخلايا EpCAM+ وEpCAM-. تتميز خلايا EpCAM+ (الورمية) بمعدل امتصاص جلوكوز ونشاط ميتوكوندريا أعلى من خلايا EpCAM-، وهو أعلى بكثير من النشاط الأيضي للخلايا الليفية في الخلايا الورمية في بيئة الورم الدقيقة (الشكل 1، E وF).
(أ و ب) متوسط ​​شدة التألق (MFI) لامتصاص الجلوكوز (2-NBDG) (أ) ونشاط الميتوكوندريا للخلايا التائية CD4+ (MitoTracker باللون الأحمر الداكن) (ب). رسوم بيانية توضيحية (يسار) وبيانات مُجدولة (يمين)، للخلايا التائية CD8+ وخلايا الورم EpCAM+ CD45- من السائل الاستسقائي والورم. (ج) نسبة الخلايا CD4+ إلى الخلايا CD8+ (من الخلايا التائية CD3+) في السائل الاستسقائي والورم. (د) نسبة خلايا الورم EpCAM+ في السائل الاستسقائي والورم (CD45-). (هـ و و) امتصاص الجلوكوز (2-NBDG) للخلايا الورمية EpCAM+ CD45- وخلايا المصفوفة EpCAM- CD45- (هـ) ونشاط الميتوكوندريا (MitoTracker باللون الأحمر الداكن) (و). رسوم بيانية توضيحية (يسار) وبيانات مُجدولة (يمين) للسائل الاستسقائي وخلايا الورم. (G) رسوم بيانية توضيحية لتعبير CD25 وCD137 وPD1 باستخدام قياس التدفق الخلوي. (H وI) تعبير CD25 وCD137 وPD1 على الخلايا التائية المساعدة (CD4+) (H) والخلايا التائية السامة (CD8+) (I). (J وK) الأنماط الظاهرية للخلايا التائية الساذجة، والخلايا التائية الذاكرة المركزية (Tcm)، والخلايا التائية الفعالة (Teff)، والخلايا التائية الذاكرة الفعالة (Tem) بناءً على تعبير CCR7 وCD45RO. صور توضيحية (يسار) وبيانات جدولية (يمين) للخلايا التائية المساعدة (CD4+) (J) والخلايا التائية السامة (CD8+) (K) في السائل الاستسقائي والأورام. تم تحديد قيم P باستخدام اختبار t المزدوج (*P<0.05، **P<0.01، و***P<0.001). يمثل الخط المرضى المتطابقين (n = 6). FMO: الفلورة ناقص واحد؛ MFI: متوسط ​​شدة الفلورة.
كشف تحليل إضافي عن اختلافات جوهرية أخرى بين الحالة الظاهرية للخلايا التائية عالية الدقة. فالخلايا التائية المنشطة (الشكل 1، من G إلى I) وخلايا الذاكرة الفعالة (الشكل 1، J وK) في الأورام أكثر شيوعًا بكثير من تلك الموجودة في سائل الاستسقاء (نسبة الخلايا التائية CD3+). وبالمثل، أظهر تحليل النمط الظاهري من خلال التعبير عن علامات التنشيط (CD25 وCD137) وعلامات الاستنزاف [بروتين موت الخلايا المبرمج 1 (PD1)] أنه على الرغم من اختلاف الخصائص الأيضية لهذه المجموعات (الشكل S1، من B إلى E)، إلا أنه لم تُلاحظ اختلافات أيضية جوهرية بشكل ثابت بين المجموعات الفرعية للخلايا الساذجة أو الفعالة أو الذاكرة (الشكل S1، من F إلى I). وقد تأكدت هذه النتائج باستخدام أساليب التعلم الآلي لتعيين الأنماط الظاهرية للخلايا تلقائيًا (21)، مما كشف أيضًا عن وجود عدد كبير من خلايا نخاع العظم (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) في سائل الاستسقاء لدى المريض (الشكل S2A). من بين جميع أنواع الخلايا المحددة، أظهرت هذه المجموعة من الخلايا النخاعية أعلى معدل لامتصاص الجلوكوز ونشاط الميتوكوندريا (الشكل S2، من B إلى G). تُبرز هذه النتائج الاختلافات الأيضية الكبيرة بين أنواع الخلايا المتعددة الموجودة في السائل الاستسقائي والأورام لدى مرضى سرطان المبيض عالي الدرجة.
يتمثل التحدي الرئيسي في فهم الخصائص الأيضية للخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TIL) في ضرورة عزل عينات من الخلايا التائية ذات نقاء ونوعية وكمية كافية من الأورام. وقد أظهرت دراسات حديثة أن طرق الفرز والإثراء بالخرز القائمة على قياس التدفق الخلوي قد تؤدي إلى تغييرات في ملامح الأيض الخلوي (22-24). وللتغلب على هذه المشكلة، قمنا بتحسين طريقة الإثراء بالخرز لعزل الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم من سرطان المبيض البشري المستأصل جراحيًا قبل تحليلها بواسطة مطياف الكتلة الترادفي بالكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS/MS) (انظر قسم المواد والأساليب؛ الشكل 2أ). ولتقييم التأثير الكلي لهذا البروتوكول على تغيرات الأيض، قارنا ملامح الأيض للخلايا التائية المنشطة بواسطة متبرعين أصحاء بعد خطوة الفصل بالخرز المذكورة أعلاه مع الخلايا التي لم تُفصل بالخرز بل بقيت على الجليد. وقد أظهر تحليل مراقبة الجودة هذا وجود ارتباط قوي بين هاتين الحالتين (r = 0.77)، كما أظهرت قابلية التكرار التقنية لمجموعة الأيضات الـ 86 قابلية تكرار عالية (الشكل 2ب). لذلك، يمكن لهذه الطرق إجراء تحليل دقيق للمستقلبات في الخلايا التي تخضع لإثراء نوع الخلية، مما يوفر أول منصة عالية الدقة لتحديد المستقلبات المحددة في سرطان المبيض عالي الدرجة، وبالتالي تمكين الناس من اكتساب فهم أعمق لبرنامج استقلاب الخلايا الجنسية.
(أ) رسم تخطيطي لإثراء الخلايا باستخدام الخرز المغناطيسي. قبل التحليل بتقنية LC-MS/MS، تخضع الخلايا لثلاث جولات متتالية من الإثراء باستخدام الخرز المغناطيسي أو تبقى محفوظة على الجليد. (ب) تأثير نوع الإثراء على وفرة المستقلبات. متوسط ​​ثلاث قياسات لكل نوع إثراء ± الخطأ المعياري. يمثل الخط الرمادي علاقة 1:1. معامل الارتباط داخل الفئة (ICC) للقياسات المتكررة موضح في تسمية المحور. NAD: نيكوتيناميد أدينين ثنائي النوكليوتيد. (ج) رسم تخطيطي لسير عمل تحليل مستقلبات المرضى. يتم جمع السائل الاستسقائي أو الأورام من المرضى وحفظها بالتجميد. تم تحليل جزء صغير من كل عينة باستخدام قياس التدفق الخلوي، بينما خضعت العينات المتبقية لثلاث جولات من الإثراء لخلايا CD4+ وCD8+ وCD45-. تم تحليل هذه الأجزاء الخلوية باستخدام تقنية LC-MS/MS. (د) خريطة حرارية لوفرة المستقلبات المعيارية. يمثل مخطط التفرع تجميع وارد للمسافات الإقليدية بين العينات. (هـ) تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لخريطة مستقلبات العينة، موضحًا ثلاث نسخ مكررة من كل عينة، حيث تُربط عينات المريض نفسه بخط. (و) تحليل المكونات الرئيسية لملف تعريف المستقلبات للعينة المشروطة بالمريض (أي باستخدام التكرار الجزئي)؛ ويُحدد نوع العينة بواسطة الغلاف المحدب. PC1: المكون الرئيسي الأول؛ PC2: المكون الرئيسي الثاني.
بعد ذلك، طبقنا طريقة الإثراء هذه لتحليل 99 مستقلباً في أجزاء الخلايا CD4+ وCD8+ وCD45- في السائل الاستسقائي الأولي والأورام لدى ستة مرضى مصابين بسرطان المبيض عالي الدرجة (الشكل 2C، والشكل S3A، والجدولين S3 وS4). تمثل المجموعة الخلوية محل الاهتمام من 2% إلى 70% من العينة الأصلية الكبيرة من الخلايا الحية، وتختلف نسبة هذه الخلايا اختلافاً كبيراً بين المرضى. بعد فصل الخرز، يمثل الجزء المُثرى محل الاهتمام (CD4+ أو CD8+ أو CD45-) أكثر من 85% من جميع الخلايا الحية في العينة في المتوسط. تتيح لنا طريقة الإثراء هذه تحليل مجموعات الخلايا من استقلاب أنسجة الورم البشري، وهو أمر غير ممكن مع العينات الكبيرة. باستخدام هذا البروتوكول، وجدنا أن الكينورينين والأدينوزين، وهما مستقلبان مثبطان للمناعة معروفان جيداً، كانا مرتفعين في الخلايا التائية الورمية أو الخلايا الورمية (الشكل S3، B وC). لذلك، تُظهر هذه النتائج دقة وقدرة تقنية فصل الخلايا وقياس الطيف الكتلي لدينا على إيجاد المستقلبات المهمة بيولوجيًا في أنسجة المرضى.
كشف تحليلنا أيضًا عن تباين أيضي واضح بين أنواع الخلايا داخل المرضى وفيما بينهم (الشكل 2D والشكل S4A). وعلى وجه الخصوص، أظهر المريض رقم 70 خصائص أيضية مختلفة مقارنةً بالمرضى الآخرين (الشكل 2E والشكل S4B)، مما يشير إلى احتمال وجود تباين أيضي كبير بين المرضى. ومن الجدير بالذكر أن كمية السائل الاستسقائي التي جُمعت من المريض رقم 70 (80 مل) كانت أقل مقارنةً بالمرضى الآخرين (من 1.2 إلى 2 لتر؛ الجدول S1). ويُظهر التحكم في التباين بين المرضى أثناء تحليل المكونات الرئيسية (باستخدام تحليل التكرار الجزئي، على سبيل المثال) تغيرات متسقة بين أنواع الخلايا، وتتجمع أنواع الخلايا و/أو البيئة الدقيقة بوضوح وفقًا لملف الأيض (الشكل 2F). وقد أكد تحليل الأيضات الفردية هذه التأثيرات وكشف عن اختلافات كبيرة بين أنواع الخلايا والبيئة الدقيقة. تجدر الإشارة إلى أن أبرز اختلاف مُلاحَظ هو MNA، الذي عادةً ما يكون مُتَوَسِّعًا في الخلايا CD45- وفي الخلايا CD4+ وCD8+ التي تتسلل إلى الورم (الشكل 3A). بالنسبة للخلايا CD4+، يكون هذا التأثير أكثر وضوحًا، ويبدو أن MNA في الخلايا CD8+ يتأثر بشدة بالبيئة المحيطة. مع ذلك، لا يُعد هذا الأمر بالغ الأهمية، إذ لم يتسنَّ تقييم درجات CD8+ في الورم إلا لثلاثة مرضى فقط من أصل ستة. بالإضافة إلى MNA، تُظهر أنواع مختلفة من الخلايا في السائل الاستسقائي والأورام، وفرةً مُتباينةً أيضًا في مُستقلبات أخرى غير مُوَصَّلة جيدًا في الخلايا اللمفاوية المُتسللة إلى الورم (الشكلان S3 وS4). لذا، تُشير هذه البيانات إلى مجموعة واعدة من المُستقلبات المُعدِّلة للمناعة تستحق المزيد من البحث.
(أ) المحتوى المُعَيَّر لـ MNA في خلايا CD4+ وCD8+ وCD45- من السائل الاستسقائي والورم. يُظهر المخطط الصندوقي الوسيط (الخط)، والمدى الربيعي (مفصل الإطار)، ونطاق البيانات، حتى 1.5 ضعف المدى الربيعي (شعيرات الإطار). كما هو موضح في قسم مواد وطرق المرضى، استخدم قيمة limma للمريض لتحديد قيمة P (*P<0.05 و**P<0.01). (ب) مخطط توضيحي لعملية استقلاب MNA (60). المستقلبات: S-أدينوزيل-1-ميثيونين؛ SAH، S-أدينوزين-1-هوموسيستين؛ NA، نيكوتيناميد؛ MNA، 1-ميثيل نيكوتيناميد؛ 2-PY، 1-ميثيل-2-بيريدون-5-كربوكساميد؛ 4-PY، 1-ميثيل-4-بيريدون-5-كربوكساميد. NR، نيكوتيناميد ريبوز؛ NMN، نيكوتيناميد أحادي النوكليوتيد. الإنزيمات (باللون الأخضر): NNMT، نيكوتيناميد N-ميثيل ترانسفيراز؛ SIRT، سيرتوينات؛ NAMPT، نيكوتيناميد فوسفوريبوزيل ترانسفيراز؛ AOX1، ألدهيد أوكسيداز 1؛ NRK، نيكوتيناميد ريبوسيد كيناز؛ NMNAT، نيكوتيناميد أحادي نيوكليوتيد أدينيلات ترانسفيراز؛ Pnp1، بيورين نيوكليوزيد فوسفوريلاز. (ج) تحليل t-SNE لتسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq) لسائل الاستسقاء (باللون الرمادي) والورم (باللون الأحمر؛ ن = 3 مرضى). (د) تعبير NNMT في مجموعات الخلايا المختلفة التي تم تحديدها باستخدام scRNA-seq. (هـ) التعبير عن NNMT وAOX1 في خلايا SK-OV-3، وخلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293T، والخلايا التائية، والخلايا التائية المعالجة بـ MNA. يُعرض التعبير المطوي نسبةً إلى خلايا SK-OV-3. يُعرض نمط التعبير مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​(n = 6 متبرعين أصحاء). تُعتبر قيم Ct الأكبر من 35 غير قابلة للكشف (UD). (و) التعبير عن SLC22A1 وSLC22A2 في خلايا SK-OV-3، وخلايا HEK293T، والخلايا التائية، والخلايا التائية المعالجة بـ 8 مليمولار من MNA. يُعرض التعبير المطوي نسبةً إلى خلايا SK-OV-3. يُعرض نمط التعبير مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​(n = 6 متبرعين أصحاء). تُعتبر قيم Ct الأكبر من 35 غير قابلة للكشف (UD). (ز) محتوى MNA في الخلايا التائية المنشطة من متبرعين أصحاء بعد 72 ساعة من الحضانة مع MNA. يُعرض نمط التعبير مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​(n = 4 متبرعين أصحاء).
يُنتَج MNA عن طريق نقل مجموعة الميثيل من S-أدينوزيل-1-ميثيونين (SAM) إلى نيكوتيناميد (NA) بواسطة إنزيم نيكوتيناميد N-ميثيل ترانسفيراز (NNMT؛ الشكل 3ب). يُفرَط في التعبير عن NNMT في أنواع مختلفة من السرطانات البشرية، ويرتبط بتكاثر الخلايا السرطانية وغزوها وانتشارها (25-27). لفهم مصدر MNA في الخلايا التائية في بيئة الورم بشكل أفضل، استخدمنا تقنية تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq) لتوصيف التعبير عن NNMT عبر أنواع الخلايا المختلفة في السائل الاستسقائي والأورام لدى ثلاثة مرضى مصابين بسرطان المبيض عالي الدرجة (الجدول S5). أظهر تحليل ما يقرب من 6500 خلية أن التعبير عن NNMT في السائل الاستسقائي وبيئات الأورام يقتصر على مجموعات الخلايا الليفية والخلايا السرطانية المفترضة (الشكل 3، جـ ود). تجدر الإشارة إلى عدم وجود تعبير واضح لإنزيم NNMT في أي مجموعة من الخلايا التي تُظهر مستقبلات PTPRC (CD45+) (الشكل 3D والشكل S5A)، مما يدل على أن MNA المُكتشف في طيف الأيض قد تم إدخاله إلى الخلايا التائية. كما أن تعبير إنزيم أوكسيداز الألدهيد 1 (AOX1)، الذي يحول MNA إلى 1-ميثيل-2-بيريدون-5-كربوكساميد (2-PYR) أو 1-ميثيل-4-بيريدون-5-كربوكساميد (4-PYR) (الشكل 3B)، يقتصر أيضًا على مجموعة الخلايا الليفية التي تُظهر COL1A1 (الشكل S5A)، مما يشير مجتمعًا إلى أن الخلايا التائية تفتقر إلى القدرة على استقلاب MNA بالطريقة التقليدية. تم التحقق من نمط التعبير لهذه الجينات المرتبطة بـ MNA باستخدام مجموعة بيانات خلوية مستقلة ثانية من سائل الاستسقاء لدى مرضى سرطان المبيض عالي الدرجة (الشكل S5B؛ n = 6) (16). بالإضافة إلى ذلك، أظهر تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لخلايا T من متبرعين أصحاء، بعد معالجتها بـ MNA، أن التعبير عن NNMT أو AOX1 كان شبه معدوم مقارنةً بخلايا ورم المبيض SK-OV-3 الضابطة (الشكل 3E). تشير هذه النتائج غير المتوقعة إلى أن MNA قد يُفرز من الخلايا الليفية أو الأورام إلى خلايا T المجاورة في بيئة الورم.
على الرغم من أن المرشحين يشملون عائلة ناقلات الكاتيونات العضوية من 1 إلى 3 (OCT1، OCT2، وOCT3) المشفرة بواسطة عائلة الناقل القابل للذوبان 22 (SLC22) (SLC22A1، SLC22A2، وSLC22A3)، فإن الناقلات المحتملة لـ MNA لا تزال غير محددة (28). أظهر تحليل QPCR للـ mRNA من خلايا T من متبرعين أصحاء مستويات تعبير منخفضة لـ SLC22A1، ولكن مستويات غير قابلة للكشف لـ SLC22A2، مما يؤكد ما تم الإبلاغ عنه سابقًا في الأدبيات (الشكل 3F) (29). في المقابل، أظهر خط خلايا ورم المبيض SK-OV-3 مستويات عالية من كلا الناقلين (الشكل 3F).
لاختبار قدرة الخلايا التائية على امتصاص جزيئات MNA الخارجية، زُرعت خلايا تائية من متبرعين أصحاء لمدة 72 ساعة في وجود تراكيز مختلفة من MNA. في غياب MNA الخارجي، لم يكن بالإمكان الكشف عن محتوى MNA الخلوي (الشكل 3G). مع ذلك، أظهرت الخلايا التائية المنشطة المعالجة بـ MNA الخارجي زيادةً في محتوى MNA داخل الخلايا تتناسب مع الجرعة، حتى تركيز 6 ملي مولار من MNA (الشكل 3G). تشير هذه النتيجة إلى أنه على الرغم من انخفاض مستوى التعبير عن الناقل وعدم وجود الإنزيم الرئيسي المسؤول عن استقلاب MNA داخل الخلايا، فإن الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TIL) لا تزال قادرة على امتصاص MNA.
يزيد طيف المستقلبات في الخلايا التائية للمرضى وتجارب امتصاص MNA في المختبر من احتمالية إفراز الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) لـ MNA، وأن الخلايا السرطانية قد تنظم النمط الظاهري ووظيفة الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TIL). ولتحديد تأثير MNA على الخلايا التائية، تم تنشيط خلايا تائية من متبرعين أصحاء في المختبر في وجود MNA أو غيابه، وتم تقييم تكاثرها وإنتاج السيتوكينات. بعد 7 أيام من إضافة MNA بأعلى جرعة، انخفض عدد الخلايا المتضاعفة بشكل طفيف، بينما حافظت الخلايا على حيويتها عند جميع الجرعات (الشكل 4أ). بالإضافة إلى ذلك، أدى العلاج بـ MNA خارجي المنشأ إلى زيادة نسبة الخلايا التائية CD4+ وCD8+ التي تعبر عن عامل نخر الورم ألفا (TNFα؛ الشكل 4ب). في المقابل، انخفض إنتاج الإنترفيرون غاما (IFN-γ) داخل الخلايا التائية المساعدة (CD4+) بشكل ملحوظ، بينما لم يطرأ أي تغيير يُذكر على مستوى الإنترلوكين 2 (IL-2) (الشكل 4، جـ ود). وبناءً على ذلك، أظهر اختبار المقايسة المناعية الإنزيمية المرتبطة (ELISA) للعينات المأخوذة من مزارع الخلايا التائية المعالجة بـ MNA زيادةً ملحوظة في عامل نخر الورم ألفا (TNFα)، وانخفاضًا في مستوى IFN-γ، وعدم وجود تغيير في مستوى IL-2 (الشكل 4، من هـ إلى ز). ويشير انخفاض مستوى IFN-γ إلى أن MNA قد يلعب دورًا في تثبيط النشاط المضاد للأورام للخلايا التائية. بهدف محاكاة تأثير MNA على السمية الخلوية التي تتوسطها الخلايا التائية، تم إنتاج خلايا CAR-T ذات مستقبلات المستضد الخيمرية (FRα-CAR-T) التي تستهدف مستقبلات حمض الفوليك α، وخلايا CAR-T (GFP) المنظمة بواسطة البروتين الفلوري الأخضر (GFP-CAR-T)، وذلك باستخدام خلايا الدم أحادية النواة الطرفية (PBMC) من متبرعين أصحاء. تمت زراعة خلايا CAR-T لمدة 24 ساعة في وجود MNA، ثم زُرعت مع خلايا ورم المبيض البشري SK-OV-3 التي تُعبر عن مستقبلات حمض الفوليك α بنسبة 10:1 بين الخلايا الفعالة والخلايا المستهدفة. أدى العلاج بـ MNA إلى انخفاض ملحوظ في فعالية قتل خلايا FRα-CAR-T، وهو ما يُشابه تأثير خلايا FRα-CAR-T المعالجة بالأدينوزين (الشكل 4H).
(أ) إجمالي عدد الخلايا الحية وتضاعف عددها (PD) مباشرةً من المزرعة في اليوم السابع. يمثل الرسم البياني المتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط ​​لستة متبرعين أصحاء. يمثل هذا الرسم بيانات من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل (n = 3). (ب إلى د) استُخدمت CD3/CD28 وIL-2 لتنشيط الخلايا التائية بتراكيز MNA الخاصة بها لمدة سبعة أيام. قبل التحليل، حُفزت الخلايا باستخدام PMA/أيونوميسين مع GolgiStop لمدة أربع ساعات. (ب) تعبير TNFα في الخلايا التائية. صورة توضيحية (يسار) وبيانات جدولية (يمين) لتعبير TNFα في الخلايا الحية. (ج) و(د) تعبير IFN-γ وIL-2 في الخلايا التائية. قُيس تعبير السيتوكينات باستخدام قياس التدفق الخلوي. يمثل الرسم البياني المتوسط ​​(n = 6 متبرعين أصحاء) ± الخطأ المعياري للمتوسط. استخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه والقياسات المتكررة (*P<0.05 و**P<0.01) لتحديد قيمة P. تمثل هذه البيانات نتائج ثلاث تجارب مستقلة على الأقل (n = 3). (من E إلى G) استُخدمت CD3/CD28 وIL-2 لتنشيط الخلايا التائية بتراكيز MNA الخاصة بها لمدة 7 أيام. جُمع الوسط قبل وبعد 4 ساعات من التحفيز بـ PMA/أيونوميسين. قُيست تراكيز TNFα (E) وIFN-γ (F) وIL-2 (G) باستخدام مقايسة ELISA. يُمثل الرسم البياني المتوسط ​​(n = 5 متبرعين أصحاء) ± الخطأ المعياري للمتوسط. حُددت قيمة P باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه والقياسات المتكررة (*P<0.05). يُشير الخط المنقط إلى حد الكشف. (H) اختبار تحلل الخلايا. عُدلت خلايا FRα-CAR-T أو GFP-CAR-T بالأدينوزين (250 ميكرومولار) أو MNA (10 مليمولار) لمدة 24 ساعة، أو تُركت دون معالجة (مجموعة التحكم). قُيست النسبة المئوية لموت خلايا SK-OV-3. تم تحديد قيمة P بواسطة اختبار Welch t (*P<0.5 و **P<0.01).
لفهم آلية تنظيم التعبير عن TNFα المعتمدة على MNA، تم تقييم التغيرات في mRNA الخاص بـ TNFα في الخلايا التائية المعالجة بـ MNA (الشكل 5أ). أظهرت الخلايا التائية المأخوذة من متبرعين أصحاء والمعالجة بـ MNA زيادةً بمقدار الضعف في مستويات نسخ TNFα، مما يشير إلى أن MNA يعتمد على تنظيم نسخ TNFα. وللتحقق من هذه الآلية التنظيمية المحتملة، تم تقييم عاملين معروفين من عوامل النسخ التي تنظم TNFα، وهما العامل النووي للخلايا التائية المنشط (NFAT) والبروتين المحدد 1 (Sp1)، استجابةً لارتباط MNA بالمحفز القريب لـ TNFα (30). يحتوي محفز TNFα على 6 مواقع ارتباط محددة لـ NFAT وموقعين لارتباط Sp1، يتداخلان في موقع واحد [-55 زوجًا قاعديًا (bp) من غطاء 5'] (30). أظهر ترسيب الكروماتين المناعي (ChIP) أنه عند المعالجة بـ MNA، ازداد ارتباط Sp1 بمحفز TNFα بمقدار ثلاثة أضعاف. كما ازداد دمج NFAT واقترب من أهميته (الشكل 5ب). تشير هذه البيانات إلى أن MNA ينظم التعبير عن TNFα من خلال نسخ Sp1، وبدرجة أقل من خلال التعبير عن NFAT.
(أ) بالمقارنة مع الخلايا التائية المزروعة بدون MNA، يوضح الشكل التغير النسبي في تعبير TNFα في الخلايا التائية المعالجة بـ MNA. ويُظهر نمط التعبير مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​(n = 5 متبرعين أصحاء). تمثل هذه البيانات نتائج 3 تجارب مستقلة على الأقل. (ب) تم فحص مُحفِّز TNFα للخلايا التائية المعالجة بـ 8 ملي مولار من MNA أو بدونها بعد دمج NFAT وSp1 مع (Ctrl) وتحفيز PMA/أيونوميسين لمدة 4 ساعات. استُخدم الغلوبولين المناعي G (IgG) وH3 كضوابط سلبية وإيجابية للترسيب المناعي، على التوالي. أظهر قياس ChIP أن ارتباط Sp1 وNFAT بمُحفِّز TNFα في الخلايا المعالجة بـ MNA قد ازداد عدة مرات مقارنةً بالضابط. تمثل هذه البيانات نتائج 3 تجارب مستقلة على الأقل. تم تحديد قيمة P باستخدام اختبارات t متعددة (*** P < 0.01). (ج) بالمقارنة مع السائل الاستسقائي في سرطان المبيض عالي الدرجة، أظهرت الخلايا التائية (غير السامة للخلايا) زيادة في التعبير عن عامل نخر الورم (TNF) في الورم. تمثل الألوان مرضى مختلفين. تم اختيار 300 خلية عشوائيًا من بين الخلايا المعروضة، مع مراعاة التباين للحد من التداخل (** Padj = 0.0076). (د) نموذج مقترح لـ MNA في سرطان المبيض. يُنتَج MNA في الخلايا السرطانية والخلايا الليفية في بيئة الورم، ويتم امتصاصه بواسطة الخلايا التائية. يزيد MNA من ارتباط Sp1 بمحفز TNFα، مما يؤدي إلى زيادة نسخ TNFα وإنتاج السيتوكين TNFα. كما يتسبب MNA في انخفاض مستوى IFN-γ. يؤدي تثبيط وظيفة الخلايا التائية إلى انخفاض قدرتها على قتل الخلايا السرطانية وتسريع نمو الورم.
تشير التقارير إلى أن عامل نخر الورم ألفا (TNFα) يمتلك تأثيرات مضادة للأورام تعتمد على موقع الورم، ولكنه معروف بدوره في تعزيز نمو وانتشار سرطان المبيض (31-33). كما تشير التقارير إلى أن تركيز TNFα في السائل الاستسقائي وأنسجة الورم لدى مرضى سرطان المبيض أعلى منه في الأنسجة السليمة (34-36). من حيث الآلية، يستطيع TNFα تنظيم تنشيط ووظيفة وتكاثر خلايا الدم البيضاء، وتغيير النمط الظاهري للخلايا السرطانية (37، 38). وتماشياً مع هذه النتائج، أظهر تحليل التعبير الجيني التفاضلي ارتفاعاً ملحوظاً في مستوى TNF في الخلايا التائية في أنسجة الورم مقارنةً بالسائل الاستسقائي (الشكل 5C). وكان هذا الارتفاع واضحاً فقط في مجموعات الخلايا التائية ذات النمط الظاهري غير السام للخلايا (الشكل S5A). باختصار، تدعم هذه البيانات الرأي القائل بأن MNA يمتلك تأثيرات مزدوجة، مثبطة للمناعة ومعززة للورم، في سرطان المبيض عالي الدرجة.
أصبح التأشير الفلوري القائم على قياس التدفق الخلوي الطريقة الرئيسية لدراسة استقلاب الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TIL). وقد أظهرت هذه الدراسات أن الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم في الفئران والبشر، مقارنةً بالخلايا اللمفاوية في الدم المحيطي أو الخلايا التائية من الأعضاء اللمفاوية الثانوية، لديها ميل أكبر لامتصاص الجلوكوز (4، 39) وفقدان تدريجي لوظيفة الميتوكوندريا (19، 40). على الرغم من أننا لاحظنا نتائج مماثلة في هذه الدراسة، إلا أن التطور الرئيسي يكمن في مقارنة استقلاب الخلايا السرطانية والخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم من نفس نسيج الورم المستأصل. وتماشياً مع بعض التقارير السابقة، فإن خلايا الورم (CD45-EpCAM+) من الاستسقاء والأورام لديها امتصاص أعلى للجلوكوز من الخلايا التائية CD8+ وCD4+، مما يدعم إمكانية مقارنة امتصاص الجلوكوز العالي للخلايا السرطانية مع الخلايا التائية. مفهوم تنافس الخلايا التائية. بيئة الورم الدقيقة. ومع ذلك، فإن نشاط الميتوكوندريا في الخلايا السرطانية أعلى من نشاط الميتوكوندريا في الخلايا التائية CD8+، ولكنه مشابه لنشاط الميتوكوندريا في الخلايا التائية CD4+. تؤكد هذه النتائج الفكرة الناشئة بأن الأيض التأكسدي مهم للخلايا السرطانية (41، 42). كما تشير إلى أن الخلايا التائية CD8+ قد تكون أكثر عرضةً للاختلال الوظيفي التأكسدي من الخلايا التائية CD4+، أو أن الخلايا التائية CD4+ قد تستخدم مصادر كربون أخرى غير الجلوكوز للحفاظ على نشاط الميتوكوندريا (43، 44). تجدر الإشارة إلى أننا لم نلاحظ أي فرق في امتصاص الجلوكوز أو نشاط الميتوكوندريا بين الخلايا التائية CD4+ الفعالة، والخلايا التائية الذاكرة الفعالة، والخلايا التائية الذاكرة المركزية في السائل الاستسقائي. وبالمثل، فإن حالة تمايز الخلايا التائية CD8+ في الأورام لا علاقة لها بالتغيرات في امتصاص الجلوكوز، مما يسلط الضوء على الاختلاف الكبير بين الخلايا التائية المزروعة في المختبر والخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم البشري في الجسم الحي (22). وقد تم تأكيد هذه الملاحظات أيضًا باستخدام التوزيع التلقائي غير المتحيز لمجموعات الخلايا، والذي كشف كذلك أن الخلايا CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ ذات امتصاص الجلوكوز ونشاط الميتوكوندريا الأعلى من الخلايا السرطانية هي السائدة، ولكنها تمثل مجموعة خلايا نشطة أيضيًا. قد يُمثل هذا التجمع الخلوي المجموعة الفرعية المفترضة من الخلايا الكابتة النخاعية أو الخلايا التغصنية البلازمية التي تم تحديدها في تحليل تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq). على الرغم من الإبلاغ عن وجود كليهما في أورام المبيض البشرية [45]، إلا أن هناك حاجة إلى مزيد من البحث لوصف هذه المجموعة الفرعية النخاعية.
على الرغم من أن الطرق القائمة على قياس التدفق الخلوي تُسهم في توضيح الاختلافات العامة في استقلاب الجلوكوز والأكسدة بين أنواع الخلايا، إلا أن المستقلبات الدقيقة الناتجة عن الجلوكوز أو مصادر الكربون الأخرى لاستقلاب الميتوكوندريا في بيئة الورم الدقيقة لم تُحدد بعد. ويتطلب تحديد وجود أو غياب المستقلبات في مجموعة فرعية معينة من الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم تنقية الخلايا من النسيج المستأصل. لذا، فإن طريقتنا لإثراء الخلايا، المقترنة بقياس الطيف الكتلي، تُتيح فهمًا أعمق للمستقلبات التي تختلف نسبتها في الخلايا التائية وخلايا الورم في عينات المرضى المتطابقة. ورغم تفوق هذه الطريقة على فرز الخلايا المنشط بالفلورة، إلا أن بعض مكتبات المستقلبات قد تتأثر بسبب استقرارها الذاتي و/أو معدل دورانها السريع (22). ومع ذلك، فقد تمكنت طريقتنا من تحديد اثنين من المستقلبات المثبطة للمناعة المعروفة، وهما الأدينوزين والكينورينين، نظرًا لاختلافهما الكبير بين أنواع العينات.
يُقدّم تحليلنا للميتابولوميات في الأورام وأنواع الخلايا اللمفاوية المتسللة للورم (TIL) رؤىً أعمق حول دور المستقلبات في بيئة الورم الدقيقة في المبيض. أولًا، باستخدام قياس التدفق الخلوي، تبيّن لنا عدم وجود فرق في نشاط الميتوكوندريا بين الأورام وخلايا CD4+ T. مع ذلك، كشف تحليل LC-MS/MS عن تغيرات ملحوظة في وفرة المستقلبات بين هذه المجموعات، مما يُشير إلى أن الاستنتاجات المتعلقة باستقلاب خلايا TIL ونشاطها الأيضي العام تتطلب تفسيرًا دقيقًا. ثانيًا، يُعدّ MNA المستقلب الذي يُظهر أكبر فرق بين خلايا CD45- وخلايا T في السائل الاستسقائي، وليس في الأورام. لذا، قد يكون للتجزئة الخلوية وموقع الورم تأثيرات مختلفة على استقلاب خلايا TIL، مما يُسلّط الضوء على التباين المُحتمل في بيئة دقيقة مُحددة. ثالثًا، يقتصر التعبير عن إنزيم NNMT المُنتج لـ MNA بشكل رئيسي على الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF)، والتي تُعدّ خلايا ورمية بدرجة أقل، ولكن لوحظت مستويات قابلة للكشف من MNA في خلايا T المُشتقة من الورم. يُعرف أن الإفراط في التعبير عن إنزيم NNMT في الخلايا الليفية المرتبطة بسرطان المبيض له تأثير محفز للسرطان، ويعود ذلك جزئيًا إلى تعزيز استقلاب هذه الخلايا، وغزو الورم، وانتشاره (27). على الرغم من أن المستوى الإجمالي للخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TIL) معتدل، إلا أن التعبير عن إنزيم NNMT في الخلايا الليفية المرتبطة بسرطان المبيض يرتبط ارتباطًا وثيقًا بالنمط الميزانشيمي في أطلس جينوم السرطان (TCGA)، والذي يرتبط بتشخيص سيئ (27، 46، 47). أخيرًا، يقتصر التعبير عن إنزيم AOX1 المسؤول عن تحلل MNA أيضًا على الخلايا الليفية المرتبطة بسرطان المبيض، مما يشير إلى أن الخلايا التائية تفتقر إلى القدرة على استقلاب MNA. تدعم هذه النتائج فكرة أنه على الرغم من الحاجة إلى مزيد من الدراسات للتحقق من هذه النتيجة، إلا أن المستويات العالية من MNA في الخلايا التائية قد تشير إلى وجود بيئة دقيقة مثبطة للمناعة في الخلايا الليفية المرتبطة بسرطان المبيض.
بالنظر إلى انخفاض مستوى التعبير عن ناقلات MNA وعدم إمكانية الكشف عن مستويات البروتينات الرئيسية المشاركة في استقلاب MNA، فإن وجود MNA في الخلايا التائية أمرٌ غير متوقع. لم يُكشف عن وجود NNMT أو AOX1 بواسطة تحليل تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq) والتفاعل التسلسلي الكمي المستهدف (qPCR) لمجموعتين مستقلتين. تشير هذه النتائج إلى أن MNA لا تُصنّع بواسطة الخلايا التائية، بل تُمتص من بيئة الورم المحيطة. تُظهر التجارب المخبرية أن الخلايا التائية تميل إلى تراكم MNA الخارجي.
أظهرت دراساتنا المخبرية أن إضافة MNA خارجيًا تحفز التعبير عن TNFα في الخلايا التائية، وتعزز ارتباط Sp1 بمحفز TNFα. على الرغم من أن TNFα له وظائف مضادة للأورام، إلا أنه في سرطان المبيض، قد يعزز نمو هذا السرطان (31-33). إن تحييد TNFα في مزارع خلايا ورم المبيض، أو إزالة إشارة TNFα في نماذج الفئران، يمكن أن يحسن إنتاج السيتوكينات الالتهابية بوساطة TNFα، ويثبط نمو الورم (32، 35). لذلك، في هذه الحالة، يمكن أن يعمل MNA المشتق من بيئة الورم الدقيقة كمستقلب محفز للالتهاب عبر آلية تعتمد على TNFα من خلال حلقة ذاتية الإفراز، مما يعزز حدوث وانتشار سرطان المبيض (31). بناءً على هذه الإمكانية، يجري دراسة حجب TNFα كعامل علاجي محتمل لسرطان المبيض (37، 48، 49). بالإضافة إلى ذلك، يُضعف MNA فعالية الخلايا التائية المعدلة وراثيًا (CAR-T) في تثبيط خلايا سرطان المبيض، مما يُقدم دليلًا إضافيًا على تثبيط المناعة بوساطة MNA. تشير هذه النتائج مجتمعةً إلى نموذج تُفرز فيه الأورام والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) مادة MNA في البيئة الخلوية خارج الخلية. من خلال (أ) تحفيز نمو سرطان المبيض بواسطة عامل نخر الورم (TNF) و(ب) تثبيط النشاط السام للخلايا التائية بواسطة MNA، قد يكون لهذا تأثير مزدوج على الورم (الشكل 5D).
في الختام، كشفت هذه الدراسة، من خلال تطبيق مزيج من تقنيات الإثراء الخلوي السريع، وتسلسل الخلايا المفردة، والتحليل الأيضي، عن اختلافات مناعية أيضية هائلة بين خلايا الأورام وخلايا السائل الاستسقائي لدى مرضى سرطان المبيض عالي الدرجة. وأظهر هذا التحليل الشامل وجود اختلافات في امتصاص الجلوكوز ونشاط الميتوكوندريا بين الخلايا التائية، وحدد MNA كمستقلب مناعي منظم غير ذاتي الوظيفة. لهذه البيانات تأثير على كيفية تأثير بيئة الورم الدقيقة على أيض الخلايا التائية في السرطانات البشرية. على الرغم من الإبلاغ عن التنافس المباشر على العناصر الغذائية بين الخلايا التائية والخلايا السرطانية، إلا أن المستقلبات يمكن أن تعمل أيضًا كمنظمات غير مباشرة لتعزيز تطور الورم وربما تثبيط الاستجابات المناعية الذاتية. قد يفتح المزيد من الوصف للدور الوظيفي لهذه المستقلبات التنظيمية آفاقًا لاستراتيجيات بديلة لتعزيز الاستجابة المناعية المضادة للأورام.
تم الحصول على عينات المرضى والبيانات السريرية من خلال مستودع أنسجة أورام السرطان في مقاطعة كولومبيا البريطانية، المعتمد من قبل شبكة مستودعات الأنسجة الكندية. ووفقًا للبروتوكول المعتمد من قبل لجنة أخلاقيات أبحاث السرطان في مقاطعة كولومبيا البريطانية وجامعة كولومبيا البريطانية (H07-00463)، تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى أو تنازلهم رسميًا عن موافقتهم على جميع عيناتهم وبياناتهم السريرية. تُحفظ العينات في بنك الأنسجة الحيوي المعتمد (BRC-00290). تُعرض الخصائص التفصيلية للمرضى في الجدولين S1 وS5. وللحفظ بالتبريد، يُستخدم مشرط لتفكيك عينة ورم المريض ميكانيكيًا، ثم تُمرر عبر مرشح بمسام 100 ميكرون للحصول على معلق خلوي أحادي. خضع سائل الاستسقاء للمريض للطرد المركزي بسرعة 1500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لترسيب الخلايا وإزالة السائل الطافي. تم تجميد الخلايا المستخلصة من الورم والسائل الاستسقائي في محلول مكون من 50% من مصل الدم البشري AB المُعطَّل حرارياً (سيجما-ألدريتش)، و40% من وسط RPMI-1640 (ثيرمو فيشر ساينتيفيك)، و10% من ثنائي ميثيل سلفوكسيد. ثم أُذيبت هذه المعلقات الخلوية المفردة المحفوظة واستُخدمت في تحليل الأيض وتحديد المستقلبات كما هو موضح أدناه.
يتكون الوسط الكامل من RPMI 1640 مُرشَّح بمسام 0.22 ميكرومتر، مُضاف إليه 50:50 من المُكمِّلات. RPMI 1640 + 2.05 ملي مول من الجلوتامين (Thermo Fisher Scientific) مُضاف إليه 10% من مصل AB البشري المُعطَّل حراريًا (Sigma-Aldrich)، و12.5 ملي مول من هيبس (Thermo Fisher Scientific)، و2 ملي مول من الجلوتامين (Thermo Fisher Scientific)، ومحلول بنسلين-ستربتومايسين (PenStrep) بتركيز 1x (Thermo Fisher Scientific)، و50 ميكرومول من ميركابتوإيثانول. أما AimV (Invitrogen) فهو مُضاف إليه 20 ملي مول من هيبس (Thermo Fisher Scientific) و2 ملي مول من الجلوتامين (Thermo Fisher Scientific). يتكون محلول التلوين المستخدم في جهاز قياس التدفق الخلوي من محلول ملحي فوسفاتي مُرشَّح بمسام 0.22 ميكرومتر (PBS؛ من شركة Invitrogen) مُدعَّم بنسبة 3% من مصل بشري AB مُعطَّل حراريًا (من شركة Sigma). أما محلول إثراء الخلايا فيتكون من محلول ملحي فوسفاتي مُرشَّح بمسام 0.22 ميكرومتر، مُدعَّم بنسبة 0.5% من مصل بشري AB مُعطَّل حراريًا (من شركة Sigma-Aldrich).
في وسط كامل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، صُبغت الخلايا بـ 10 نانومتر من MT DR و100 ميكرومتر من 2-NBDG لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، صُبغت الخلايا بصبغة حيوية eF506 عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. أُعيد تعليق الخلايا في محلول FC Block (eBioscience) ومحلول Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences)، وخُففت في محلول تلوين جهاز قياس التدفق الخلوي (وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة)، وحُضنت لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. صُبغت الخلايا بمجموعة من الأجسام المضادة (الجدول S2) في محلول تلوين جهاز قياس التدفق الخلوي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. أُعيد تعليق الخلايا في محلول تلوين جهاز قياس التدفق الخلوي (Cytek Aurora؛ تكوين 3L-16V-14B-8R) قبل التحليل. استُخدم برنامجا SpectroFlo وFlowJo V10 لتحليل بيانات تعداد الخلايا، واستُخدم برنامج GraphPad Prism 8 لإنشاء البيانات. تم تحويل متوسط ​​شدة التألق (MFI) لـ 2-NBDG وMT DR إلى مقياس لوغاريتمي، ثم استُخدم اختبار t المزدوج للتحليل الإحصائي لمراعاة المرضى المتطابقين. يجب استبعاد جميع المجموعات التي تحتوي على أقل من 40 حدثًا من التحليل؛ وإدخال قيمة MFI تساوي 1 لأي ​​قيم سالبة قبل إجراء التحليل الإحصائي وعرض البيانات.
لتعزيز استراتيجية التحديد اليدوي للخلايا في لوحة المعالجة المذكورة أعلاه، استخدمنا بيانات الشرح الكاملة المُستقاة من شجرة تقييد الشكل (FAUST) (21) لتخصيص الخلايا تلقائيًا للمجموعات بعد استبعاد الخلايا الميتة في برنامج FlowJo. ثم قمنا بمعالجة المخرجات يدويًا لدمج المجموعات التي يبدو أنها مُخصصة بشكل خاطئ (دمج خلايا الورم PD1+ مع خلايا الورم PD1-) مع المجموعات المُحتفظ بها. تحتوي كل عينة على ما يزيد عن 2% من الخلايا في المتوسط، ليصبح المجموع 11 مجموعة.
استُخدمت تقنية الطرد المركزي بتدرج كثافة الفيكول لفصل الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم المحيطي (PBMC) عن نواتج فصل الكريات البيضاء (STEMCELL Technologies). عُزلت الخلايا التائية CD8+ من الخلايا الليمفاوية أحادية النواة باستخدام حبيبات CD8 الدقيقة (Miltenyi)، ووُسعت في وسط كامل باستخدام TransAct (Miltenyi) لمدة أسبوعين وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تُرِكت الخلايا لمدة 5 أيام في وسط كامل يحتوي على إنترلوكين-7 (10 نانوغرام/مل؛ PeproTech)، ثم أُعيد تحفيزها باستخدام TransAct. في اليوم السابع، ووفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، استُخدمت حبيبات CD45 الدقيقة البشرية (Miltenyi) لإثراء الخلايا في ثلاث جولات متتالية. قُسّمت الخلايا إلى أجزاء لتحليل التدفق الخلوي (كما هو موضح أعلاه)، وقُسّم مليون خلية إلى أجزاء ثلاث مرات لتحليل LC-MS/MS. عُولجت العينات بواسطة LC-MS/MS كما هو موضح أدناه. قُدّرت قيمة المستقلب المفقود برقم أيوني قدره 1000. يتم تطبيع كل عينة بواسطة العدد الإجمالي للأيونات (TIC)، وتحويلها لوغاريتميًا، وتطبيعها تلقائيًا في MetaboAnalystR قبل التحليل.
تم إذابة معلق الخلايا المفردة لكل مريض وترشيحه عبر مرشح 40 ميكرومتر في وسط غذائي كامل (كما هو موضح أعلاه). وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة، استُخدمت ثلاث جولات متتالية من الانتقاء الإيجابي بواسطة الفصل المغناطيسي باستخدام حبيبات دقيقة (MicroBeads) من شركة ميلتيني (Miltenyi) لإثراء العينات بخلايا CD8+ وCD4+ وCD45- (على الجليد). باختصار، تُعلق الخلايا في محلول إثراء الخلايا (كما هو موضح أعلاه) ويتم عدّها. حُضنت الخلايا مع حبيبات CD8 البشرية، أو حبيبات CD4 البشرية، أو حبيبات CD45 البشرية (Miltenyi) عند درجة حرارة 4 مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم غُسلت بمحلول إثراء الخلايا. تُمرر العينة عبر عمود LS (Miltenyi)، وتُجمع الأجزاء الموجبة والسالبة. لتقليل مدة هذه الخطوة وزيادة استعادة الخلايا إلى أقصى حد، يُستخدم جزء CD8- في الجولة الثانية من إثراء CD4+، ويُستخدم جزء CD4- في إثراء CD45- اللاحق. حافظ على المحلول بارداً طوال عملية الفصل.
لتحضير عينات تحليل المستقلبات، غُسلت الخلايا مرة واحدة بمحلول ملحي بارد، ثم أُضيف 1 مل من الميثانول بتركيز 80% إلى كل عينة، وخُلطت جيدًا، وجُمدت تجميدًا سريعًا في النيتروجين السائل. خضعت العينات لثلاث دورات من التجميد والذوبان، ثم طُردت مركزيًا بسرعة 14000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. بُخر السائل الطافي المحتوي على المستقلبات حتى جفافه. أُذيبت المستقلبات مرة أخرى في 50 ميكرولتر من حمض الفورميك بتركيز 0.03%، وخُلطت جيدًا، ثم طُردت مركزيًا لإزالة الشوائب.
استخلص المستقلبات كما هو موضح أعلاه. انقل الراشح إلى قارورة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء لأبحاث علم الأيض. استخدم بروتوكول معالجة عشوائي لمعالجة كل عينة بعدد مماثل من الخلايا لتجنب تأثيرات الدُفعات. أجرينا تقييمًا نوعيًا للمستقلبات العامة المنشورة سابقًا باستخدام مطياف الكتلة الرباعي الأقطاب الثلاثي AB SCIEX QTRAP 5500 (50). تم إجراء التحليل الكروماتوغرافي وتكامل مساحة الذروة باستخدام برنامج MultiQuant الإصدار 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
استُخدم عدد أيونات مقداره 1000 لتقدير قيمة المستقلب المفقود، واستُخدم إجمالي التيار الأيوني (TIC) لكل عينة لحساب مساحة الذروة المُعَيَّرة لكل مستقلب مُكتشف لتصحيح التغييرات الناتجة عن التحليل الآلي أثناء معالجة العينات. بعد معايرة إجمالي التيار الأيوني، استُخدم برنامج MetaboAnalystR(51) (بالمعامل الافتراضي) للتحويل اللوغاريتمي وتوسيع نطاق خط المعايرة تلقائيًا. استخدمنا تحليل المكونات الرئيسية (PCA) مع حزمة vegan R لإجراء تحليل استكشافي لاختلافات الأيض بين أنواع العينات، واستخدمنا تحليل التكرار الجزئي لتحليل المرضى. استخدمنا طريقة وارد لإنشاء مخطط شجري حراري لتجميع المسافة الإقليدية بين العينات. استخدمنا دالة limma(52) على وفرة المستقلبات المعيارية لتحديد المستقلبات ذات الوفرة المختلفة عبر نوع الخلية والبيئة الدقيقة بأكملها. لتبسيط الشرح، استخدمنا مُعامل متوسط ​​المجموعة لتحديد النموذج، واعتبرنا أنواع الخلايا في البيئة الدقيقة كمجموعة (عدد المجموعات = 6). لإجراء اختبار الدلالة الإحصائية، أجرينا ثلاث قياسات متكررة لكل مستقلب. ولتجنب التكرار الخاطئ، أُدرج المريض كعائق في تصميم limma. وللتحقق من الاختلافات في المستقلبات بين المرضى المختلفين، عدّلنا نموذج limma ليشمل المرضى بشكل ثابت. ونُبلغ عن دلالة التباين المحدد مسبقًا بين نوع الخلية والبيئة الدقيقة بقيمة Padj < 0.05 (تصحيح Benjamini-Hochberg).
بعد تعزيز حيوية الخلايا باستخدام مجموعة إزالة الخلايا الميتة من ميلتيني (>80% حيوية)، أُجري تسلسل النسخ الجيني للخلايا المفردة على عينات السائل الاستسقائي والورم المجمدة بالكامل باستخدام بروتوكول التعبير الجيني 10x 5′. تم تحليل خمس حالات متطابقة من حيث الأورام والسائل الاستسقائي، على الرغم من أن انخفاض حيوية إحدى عينات الورم حال دون إدراجها. ولتحقيق اختيارات متعددة للمرضى، قمنا بدمج عينات كل مريض في مسارات وحدة التحكم بالكروم 10x، وحللنا السائل الاستسقائي ومواقع الورم بشكل منفصل. بعد التسلسل [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE)، جينوم كيبيك؛ بمتوسط ​​73,488 و41,378 قراءة لكل خلية في الورم والسائل الاستسقائي على التوالي، استخدمنا CellSNP وVireo (53) (استنادًا إلى CellSNP). يتم تعيين هوية المتبرع للنمط الجيني البشري الشائع (VCF) المقدم من GRCh38. نستخدم SNPRelate لاستنتاج أقرب هوية (IBS) لحالة النمط الجيني للمريض، مع استبعاد الخلايا غير المعينة والخلايا المحددة على أنها مزدوجة، ومطابقة المتبرعين بين عينات السائل الاستسقائي والورم (54). بناءً على هذه المهمة، احتفظنا بثلاث حالات ذات تمثيل خلوي وفير في الورم والسائل الاستسقائي للتحليل اللاحق. بعد إجراء خطوة ترشيح جماعي في حزمة BioConductor scater (55) وscran (56)، نتج عن ذلك 6975 خلية (2792 و4183 خلية من الورم والسائل الاستسقائي، على التوالي) للتحليل. نستخدم تجميع Louvain من igraph (57) للجوار الأقرب المشترك تم استخدام شبكة عصبية مترابطة (SNN) تعتمد على مسافة جاكارد لتجميع الخلايا حسب التعبير الجيني. تم تصنيف المجموعات يدويًا إلى أنواع الخلايا المحتملة بناءً على التعبير الجيني للعلامات، وتم عرضها باستخدام t-SNE. تُعرَّف الخلايا التائية السامة للخلايا من خلال التعبير عن CD8A وGZMA، باستثناء المجموعات الفرعية ذات التعبير المنخفض عن البروتينات الريبوزومية. استخدمنا البيانات المنشورة لإزار وآخرون (16)، بما في ذلك تضمين t-SNE الخاص بهم، للتحكم في تداخل التعبير بين علامات الخلايا المناعية وتعبير NNMT.
تم فصل الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم المحيطي (PBMC) عن منتجات فصل الكريات البيضاء (STEMCELL Technologies) باستخدام تقنية الطرد المركزي بتدرج كثافة الفيكول. عُزلت الخلايا CD3+ من الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم المحيطي باستخدام خرز CD3 (Miltenyi). في وجود أو غياب MNA، تم تنشيط الخلايا CD3+ باستخدام CD3 المرتبط بالصفيحة (5 ميكروغرام/مل)، وCD28 الذائب (3 ميكروغرام/مل)، وIL-2 (300 وحدة/مل؛ Proleukin). في اليوم الأخير من التوسع، تم تقييم حيوية الخلايا (باستخدام صبغة حيوية قابلة للتثبيت eFluor450، eBioscience) وتكاثرها (باستخدام خرز eBeads 123، Thermo Fisher Scientific) بواسطة قياس التدفق الخلوي. يُقيّم أداء الخلايا الفعالة بتحفيزها باستخدام PMA (20 نانوغرام/مل) وأيونوميسين (1 ميكروغرام/مل) مع GolgiStop لمدة 4 ساعات، ويُرصد كل من CD8-PerCP (RPA-T8، BioLegend) وCD4-AF700 (RPA-T4، BioLegend) وTNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11، BD). يُحفز كل من qPCR وChIP الخلايا باستخدام PMA (20 نانوغرام/مل) وأيونوميسين (1 ميكروغرام/مل) لمدة 4 ساعات. يُجمع السائل الطافي الناتج عن اختبار ELISA قبل وبعد التحفيز باستخدام PMA (20 نانوغرام/مل) وأيونوميسين (1 ميكروغرام/مل) لمدة 4 ساعات.
اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام مجموعة RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). استخدم جهاز QIAshredder (QIAGEN) لتجانس العينة. استخدم مجموعة تحويل الحمض النووي الريبوزي إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA) عالية السعة (Thermo Fisher Scientific) لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA). استخدم مزيج TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) لتحديد كمية التعبير الجيني (وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة) باستخدام المجسات التالية: Hs00196287_m1 (NNMT)، وHs00154079_m1 (AOX1)، وHs00427552_m1 (SLC22A1)، وHs02786624_g1 [جليسرالدهيد-3-فوسفات منزوع الهيدروجين (GAPDH)]، وHs01010726_m1 (SLC22A2). تم تحليل العينات باستخدام نظام StepOnePlus للتفاعل المتسلسل للبوليميراز في الوقت الحقيقي (Applied Biosystems) في صفيحة التفاعل الضوئية السريعة MicroAmp ذات 96 بئراً (Applied Biosystems) المزودة بغشاء ضوئي MicroAmp. أي قيمة Ct تتجاوز 35 تُعتبر أعلى من عتبة الكشف وتُصنف على أنها غير قابلة للكشف.
يُجرى اختبار ChIP كما وُصف سابقًا (58). باختصار، عُولجت الخلايا بالفورمالديهايد (بتركيز نهائي 1.42%) وحُضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. استُخدم محلول انتفاخ مُدعّم (25 مليمولار هيبس، 1.5 مليمولار كلوريد المغنيسيوم، 10 مليمولار كلوريد البوتاسيوم، و0.1% NP-40) على الجليد لمدة 10 دقائق، ثم أُعيد تعليقها في محلول الترسيب المناعي كما وُصف (58). بعد ذلك، عُولجت العينة بالموجات فوق الصوتية وفقًا للدورات التالية: 10 دورات (20 نبضة لمدة ثانية واحدة) وفترة سكون لمدة 40 ثانية. حُضنت الأجسام المضادة من نوع الغلوبولين المناعي G (من شركة Cell Signaling Technology؛ 1 ميكرولتر)، والهيستون H3 (من شركة Cell Signaling Technology؛ 3 ميكرولتر)، وNFAT (من شركة Invitrogen؛ 3 ميكرولتر)، وSP1 (من شركة Cell Signaling Technology؛ 3 ميكرولتر) مع العينة عند درجة حرارة 4 مئوية مع الرج طوال الليل. حضّن خرز البروتين A (Thermo Fisher Scientific) مع العينة عند درجة حرارة 4 مئوية مع رجّ خفيف لمدة ساعة واحدة، ثم استخدم خرز chelex (Bio-Rad) لتركيز الحمض النووي، واستخدم بروتينيز K (Thermo Fisher) لهضم البروتين. تم الكشف عن مُحفّز TNFα بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): البادئ الأمامي: GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT؛ البادئ العكسي: GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (ناتج بطول 207 زوج قاعدي). تم إنتاج الصور بواسطة برنامج Image Lab (Bio-Rad) وتم تحليلها كميًا باستخدام برنامج ImageJ.
جُمع السائل الطافي من مزارع الخلايا كما هو موضح سابقًا. أُجري التحليل وفقًا لإجراءات الشركة المصنعة لمجموعات ELISA الخاصة بـ TNFα البشري (Invitrogen)، وIL-2 البشري (Invitrogen)، وIFN-γ البشري (Abcam). ووفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة، خُفف السائل الطافي بنسبة 1:100 للكشف عن TNFα وIL-2، وبنسبة 1:3 للكشف عن IFN-γ. استُخدم جهاز EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) لقياس الامتصاص عند 450 نانومتر.
تم فصل الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم المحيطي (PBMC) عن منتجات فصل الكريات البيضاء (STEMCELL Technologies) باستخدام تقنية الطرد المركزي بتدرج كثافة الفيكول. عُزلت الخلايا CD3+ من الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم المحيطي باستخدام خرز CD3 (Miltenyi). في وجود أو غياب MNA، تم تنشيط الخلايا CD3+ باستخدام CD3 المرتبط بالصفيحة (5 ميكروغرام/مل)، وCD28 الذائب (3 ميكروغرام/مل)، وIL-2 (300 وحدة/مل؛ Proleukin) لمدة 3 أيام. بعد 3 أيام، جُمعت الخلايا وغُسلت بمحلول ملحي 0.9%، ثم جُمدت الخلايا تجميدًا سريعًا. أُجريَ عد الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي (Cytek Aurora؛ تكوين 3L-16V-14B-8R) باستخدام خرز eBeads 123count.
استُخلصت المستقلبات كما هو موضح أعلاه. أُعيد تكوين المستخلص المجفف بتركيز 4000 مكافئ خلية/ميكرولتر. حُللت العينة باستخدام كروماتوغرافيا الطور المعكوس (1290 Infinity II، Agilent Technologies، سانتا كلارا، كاليفورنيا) وعمود CORTECS T3 (2.1×150 مم، حجم الجسيمات 1.6 ميكرومتر، حجم المسام 120 أنغستروم؛ #186008500، Waters). طُبقت تقنية مطياف الكتلة القطبي (6470، Agilent) حيث يعمل التأين بالرذاذ الإلكتروني في الوضع الموجب. يتكون الطور المتحرك A من 0.1% حمض الفورميك (في الماء)، ويتكون الطور المتحرك B من 90% أسيتونيتريل و0.1% حمض الفورميك. يُطبَّق تدرج كروماتوغرافي سائل عالي الأداء (LC) من 0 إلى 2 دقيقة باستخدام 100% من المذيب A، ومن 2 إلى 7.1 دقيقة باستخدام 99% من المذيب B، ومن 7.1 إلى 8 دقائق باستخدام 99% من المذيب B. ثم يُعاد توازن العمود باستخدام المذيب A بمعدل تدفق 0.6 مل/دقيقة لمدة 3 دقائق. بعد ذلك، يُضبط معدل التدفق على 0.4 مل/دقيقة، وتُسخَّن حجرة العمود إلى 50 درجة مئوية. يُستخدم المعيار الكيميائي النقي من شركة MNA (M320995، شركة تورنتو للأبحاث الكيميائية، نورث يورك، أونتاريو، كندا) لتحديد زمن الاحتفاظ (RT) والتحول (RT = 0.882 دقيقة، التحول 1 = 137→94.1، التحول 2 = 137→92، التحول 3 = 137→78). عند حدوث التحولات الثلاثة جميعها في زمن الاحتفاظ الصحيح، يُستخدم التحول 1 للقياس الكمي لضمان الخصوصية. تم إنشاء منحنى المعايرة لمركب MNA (شركة تورنتو للأبحاث الكيميائية) من خلال ستة تخفيفات متسلسلة للمحلول الأصلي (1 ملغم/مل) للحصول على معايير سائلة بتركيزات 0.1، 1.0، 10، و100 نانوغرام/مل، و1.0، و10 ميكروغرام/مل على التوالي. حد الكشف هو 1 نانوغرام/مل، والاستجابة الخطية تتراوح بين 10 نانوغرام/مل و10 ميكروغرام/مل. يُستخدم حقن 2 ميكرولتر من العينة والمعيار في كل عملية تحليل باستخدام تقنية LC/MS، ويتم تشغيل عينة مراقبة جودة مختلطة كل ثماني حقن لضمان استقرار منصة التحليل. كانت استجابات MNA لجميع عينات الخلايا المعالجة بـ MNA ضمن النطاق الخطي للفحص. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج MassHunter للتحليل الكمي (الإصدار 9.0، شركة Agilent).
تم استخلاص بنية الجيل الثاني من مستقبلات ألفا الحمضية الخيمرية (αFR-CAR) من دراسة سونغ وآخرون (59). باختصار، تحتوي هذه البنية على المكونات التالية: التسلسل القائد لـ CD8a، والجزء المتغير أحادي السلسلة الخاص بمستقبلات ألفا الحمضية البشرية، ومنطقة المفصل والمنطقة العابرة للغشاء لـ CD8a، والنطاق داخل الخلوي لـ CD27، والنطاق داخل الخلوي لـ CD3z. تم تصنيع تسلسل مستقبلات الحمضية الخيمرية الكامل بواسطة شركة GenScript، ثم تم استنساخه في ناقل التعبير الفيروسي البطيء من الجيل الثاني في اتجاه التيار من كاسيت التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) المستخدم لتقييم كفاءة النقل.
يُنتَج الفيروس البطيء عن طريق نقل الجينات إلى خلايا HEK293T [المجموعة الأمريكية لزراعة الأنسجة (ATCC)]؛ حيث تُزرع هذه الخلايا في وسط دولبيكو المعدل من وسط إيجل المحتوي على 10% من مصل الأبقار الجنيني (FBS) و1% من البنسلين والستربتومايسين، ويُستخدم ناقل CAR-GFP. أما بلازميدات التغليف (psPAX2 وpMD2.G، من شركة Addgene) فتُستخدم فيها تقنية نقل الجينات باستخدام أمين الليبوفكشن (من شركة Sigma-Aldrich). يُجمع السائل الطافي المحتوي على الفيروس بعد 48 و72 ساعة من نقل الجينات، ثم يُرشح ويُركز بالطرد المركزي الفائق. يُحفظ السائل الطافي الفيروسي المركز عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى استخدامه في عملية النقل الجيني.
يتم فصل الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم المحيطي (PBMC) عن منتجات فصل الكريات البيضاء من متبرعين أصحاء (STEMCELL Technologies) باستخدام تقنية الطرد المركزي بتدرج كثافة الفيكول. تُستخدم حبيبات CD8 الدقيقة للاختيار الإيجابي (Miltenyi) لعزل خلايا CD8+ من الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من الدم المحيطي. تُحفز الخلايا التائية باستخدام TransAct (Miltenyi) في وسط TexMACS [Miltenyi؛ مُضاف إليه 3% من مصل بشري مُعطل حراريًا، و1% من البنسلين والستربتومايسين، وIL-2 (300 وحدة/مل)]. بعد 24 ساعة من التحفيز، تُنقل الجينات إلى الخلايا التائية باستخدام فيروس lentivirus (10 ميكرولتر من مُستخلص الفيروس المُركز لكل 106 خلية). بعد 1 إلى 3 أيام من نقل الجينات على جهاز Cytek Aurora (على FSC (التشتت الأمامي)/SSC (التشتت الجانبي)، Singlet، GFP+)، يُقيّم تعبير GFP في الخلايا لإثبات كفاءة نقل الجينات بنسبة 30% على الأقل.
تمت زراعة خلايا CAR-T لمدة 24 ساعة في وسط Immunocult (من شركة STEMCELL Technologies، مُدعّم بـ 1% من البنسلين والستربتومايسين) في الظروف التالية: غير مُعالجة، مُعالجة بـ 250 ميكرومول من الأدينوزين أو 10 مليمول من MNA. بعد المعالجة المسبقة، غُسلت خلايا CAR-T بمحلول PBS، ثم جُمعت مع 20,000 خلية SK-OV-3 [ATCC] في وسط McCoy 5A (من شركة Sigma-Aldrich) مُدعّم بـ 10% من مصل بقري جنيني و1% من البنسلين والستربتومايسين بنسبة 10:1 (نسبة الخلايا الفعالة إلى الخلايا المستهدفة 1)، وتم تضخيمها ثلاث مرات في وسط Immunocult المُدعّم. استُخدمت خلايا SK-OV-3 وخلايا SK-OV-3 المُحللة باستخدام سابونين الديجيتال (0.5 ملغم/مل؛ من شركة Sigma-Aldrich) كضوابط سلبية وإيجابية على التوالي. بعد 24 ساعة من الزراعة المشتركة، جُمع السائل الطافي وقُيس مستوى إنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (مجموعة اختبار السمية الخلوية LDH Glo، بروميج). خُفف السائل الطافي لإنزيم LDH بنسبة 1:50 في محلول منظم LDH. حُسبت نسبة القتل باستخدام الصيغة التالية: نسبة القتل = نسبة التصحيح / أقصى معدل قتل × 100%، حيث نسبة التصحيح = الزراعة المشتركة - الخلايا التائية فقط، وأقصى معدل قتل = العينة الضابطة الموجبة - العينة الضابطة السالبة.
كما هو موضح في النص أو قسم المواد والأساليب، استخدم برنامج GraphPad Prism 8 أو Microsoft Excel أو R الإصدار 3.6.0 للتحليل الإحصائي. في حال جمع عينات متعددة من المريض نفسه (مثل السائل الاستسقائي والورم)، نستخدم اختبار t المقترن أو نُدرج المريض كمتغير عشوائي في نموذج خطي أو نموذج معمّم حسب الاقتضاء. بالنسبة لتحليل الأيض، يُجرى اختبار الأهمية ثلاث مرات.
للاطلاع على المواد التكميلية لهذه المقالة، يرجى زيارة الرابط التالي: http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
هذه مقالة متاحة للجميع بموجب شروط رخصة المشاع الإبداعي نَسب المُؤَلِّف - غير تجاري، والتي تسمح باستخدامها وتوزيعها وإعادة إنتاجها بأي وسيلة، شريطة ألا يكون الاستخدام النهائي لأغراض تجارية وأن يكون العمل الأصلي صحيحًا. مرجع.
ملاحظة: نطلب منك فقط تزويدنا بعنوان بريدك الإلكتروني لكي يعلم الشخص الذي توصي به للصفحة أنك ترغب في أن يرى الرسالة وأنها ليست رسالة مزعجة. لن نقوم بتسجيل أي عناوين بريد إلكتروني.
يُستخدم هذا السؤال لاختبار ما إذا كنت زائرًا ولمنع إرسال الرسائل غير المرغوب فيها تلقائيًا.
كيلجور (ماريسا ك. كيلجور)، سارة ماكفيرسون (سارة ماكفيرسون)، لورين جي. زاكارياس (لورين جي. زكريا)، أبيجيل إيلي أريس جي. واتسون (إتش. واتسون)، جون ستاج (جون ستاج)، براد إتش. نيلسون (براد إتش. نيلسون)، رالف جيه. دي بيلارديني (رالف جي. ديبيراردينيس)، راسل جي. جونز (راسل جي. جونز)، فينياس تي. هاميلتون (فينياس تي.
يساهم MNA في تثبيط المناعة للخلايا التائية ويمثل هدفًا محتملاً للعلاج المناعي لعلاج السرطان البشري.
كيلجور (ماريسا ك. كيلجور)، سارة ماكفيرسون (سارة ماكفيرسون)، لورين جي. زاكارياس (لورين جي. زكريا)، أبيجيل إيلي أريس جي. واتسون (إتش. واتسون)، جون ستاج (جون ستاج)، براد إتش. نيلسون (براد إتش. نيلسون)، رالف جيه. دي بيلارديني (رالف جي. ديبيراردينيس)، راسل جي. جونز (راسل جي. جونز)، فينياس تي. هاميلتون (فينياس تي.
يساهم MNA في تثبيط المناعة للخلايا التائية ويمثل هدفًا محتملاً للعلاج المناعي لعلاج السرطان البشري.
©2021 الجمعية الأمريكية لتقدم العلوم. جميع الحقوق محفوظة. AAAS هي شريك لـ HINARI، وAGORA، وOARE، وCHORUS، وCLOCKSS، وCrossRef، وCOUNTER. تقدم العلوم ISSN 2375-2548.